אנו מודים חברי המעבדה Huse עבור ייעוץ וסיוע. נתמך על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות (R01-AI087644 ל מ. ה) ו- P30-CA008748 אל מרכז הסרטן סלואן-קטרינג הזיכרון.

1. הכנה של משטחי זכוכית מופחתים
<ol><li>המעיל. ובכן שמונה תאיים coverglass עם biotinylated פולי-L-ליזין (ביו-PLL) מדולל שבערך במים מזוקקים, יונים (ddH2O). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לשטוף עם H2O.</li>
	<li>היא יבשה 2 h-RT.</li>
	<li>בלוק ביו-PLL מצופה משטחים עם מאגר חסימה (באגירה HEPES תמיסת מלח [10 מ מ HEPES pH 7.4, 150 מ מ NaCl], עם 2% BSA) במשך 30 דקות ב- RT.<ol>
<li>להמיס 5 מ"ג פולי-L-ליזין מנות ב- 1 מ ל 10 מ מ נאפו4, pH 8.5.</li>
		<li>להוסיף μmol 125 (0.55 מ ג) של NHS-ביוטין (מתוך מלאי 100 מ"ג/מ"ל ב דימתיל סולפוקסיד) ולבדוק את רמת החומציות של התגובה. אם ה-pH מתחת 8.5, להוסיף 2 μL של 4 N NaOH לגדל אותו בין pH 8.5 ו- 9.5.</li>
		<li>מערבולת למשך 30 דקות.</li>
		<li>להרוות את תגובת עם 50 μL 100 מ מ גליצין מומס 20 מ מ טריס pH 8.0.</li>
		<li>ספין בעוצמה מלאה למשך 10 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. הערה: ביו-PLL איכות הוא בדרך כלל לעומת ההכנות הקודם על ידי ציפוי טורי דילולים כפולה של החומר על צלחת אליסה 96-ובכן וכימות ביוטין תוכן לאחר דגירה עם phosphatase אלקליין בשילוב streptavidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר את חסימת מאגר. אל תאפשר בארות להתייבש. להוסיף streptavidin (100 µg/mL במאגר חסימה). תקופת דגירה של h 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לרחוץ ב- HBS. מילוי, היפוך קאמרית שקופית בארות 4 - 5 פעמים, הסרת HBS מן הבארות. אל תאפשר בארות להתייבש.</li>
	<li>הוסף biotinylated pMHC ליגנדים של אדהזיה מולקולות על פני השטח. הערה: MCC וביצית יכולה להיות photocaged על-ידי הוספת אורתופדיה-nitrobenzyl המבוסס על קבוצות מגן (למשל, nitrophenylethyl (NPE) או nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) על קבוצת אמינו חדוה lysines מפתח (K12 ב- MCC, K7 בתוך ביצית). ניתן להשיג Photocaged MCC וביצית של ספקים מסחריים. לאחר שיחזור במאגר מימית, הם הם refolded לתוך ביטוי bacterially-Ek ו- H2-Kb באמצעות גישות הוקמה11,12.</li>
	<li>אימות של פפטיד MCC או ביצית photoactivatable<ol>
<li>Decage פפטידים NVOC המוגנים על-ידי UV בין עם מנורת UV כף יד (ראה טבלה של חומרים) במשך 20 דקות ב- RT.</li>
		<li>הדופק 1.0 x 105 נגמ שים עם 1 מיקרומטר של פפטיד nonstimulatory (שליטה שלילי, למשל Hb), unirradiated photoactivatable פפטיד, photoactivatable לקרינה פפטיד, ופפטיד אגוניסט (בקרה חיובית, למשל, MCC) עבור h 1 כדי לילה ב 37 º C.</li>
		<li>כדי לעורר תאי T לבטא את ג 5 C7/2B4/AND TCR, להשתמש CH12 או CH27 B תאים. לעורר תאים OT1 T, השתמש RMA-s או EL4 thymoma תאים.</li>
		<li>מערבבים את נגמ שים פעמו עם מספר שווה של תאי T ב 96-ובכן סביב לוחות בווליום הסופי של 200 µL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות.</li>
		<li>לשחזר את supernatants מכל קידוח ולנתח il-2 מאת אליסה עם streptavidin-חזרת peroxidase זיהוי ערכי צבע מוחלטים. הערה: אישור על מצב caging של פפטידים כל באמצעות ספקטרומטר מסה ספקטרומטריית electrospray לפני refolding לתוך מתחמי MHC, מומלץ מאוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע קיפול וטיהור של MHC כדי למזער חשיפה לאור. למשל, גלישת קיפול תגובות בנייר אלומיניום, לבצע בדיקות סינון ג'ל עם מנורת UV מחוץ. הערה: זה כבר מצא את photoactivatable MCC-אני-Ek , ביצית - H2-Kb זירוז UV הפעלה עצמאית תא T-צפיפות גבוהה, ייתכן שעקב שכולאת פונקציונלי לא שלם. לפיכך, pMHC photoactivatable הוא מדולל מעודף x 10-30 nonstimulatory pMHC (למשל -Ek שמכיל פפטיד64-76 (Hb) של המוגלובין) במהלך השלב הנייח. זה מגביר את האות לרעש יחס של הניסוי הדמיה עוקבות.</li>
	<li>כדי photoactivate CD4+ T תאים, באופן קולקטיבי משתמשים בתערובת של biotinylated על בסיס חצי פנסיון-אני-Ek (3 µg/mL), biotinylated photoactivatable MCC-אני-Ek (0.1 µg/mL) ו- biotinylated נוגדנים נגד המעמד אני MHC H2-Kk (0.5 µg / mL)-נוגדן anti-H2-Kk מעודד ג 5 C7/2B4/AND T תאים, אשר אקספרס H2-Kk, למרוח על גבי משטח זכוכית שבלי לעבור הפעלה.</li>
	<li>עבור CD8+ T תאים, משתמשים בתערובת של biotinylated H2-Db הנושאת את פפטיד KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylated photoactivatable ביצית-H2-Kb (0.1 µg/mL), לבין קבוצת המחשבים חוץ-תאי של המולקולה אדהזיה ICAM-1 (2 µg/mL הופק על ידי חרקים תא תרבות13.) ה-ICAM-1 מעודד היווצרות קשר קרוב ומרבה את אינטגרין LFA1 על פני תא T.</li>
	<li>החלת כל חלבון תערובות במאגר חסימה, ואחריו הדגירה 1 h RT או לפחות 2 h-4 מעלות צלזיוס. הערה: צפיפות מולקולרית על משטחים מסוג זה להיות ~ 8000 לכל מיקרומטר2 כבר נקבע בעבר6. בהתחשב בכך photoactivatable pMHC מייצג ~1/30th של החלבון biotinylated על פני השטח, כשהצפיפות שלה יהיה ~ 267 מולקולות לכל מיקרומטר2, לפני decaging.</li>
	<li>לשטוף כמו שלב 1.6 ולהשאיר ב- HBS עד מוכן לשימוש.</li>
	<li>להוסיף 200,000 CD4+ או CD8+ T תאים המבטאים את TCR המתאים לבאר כל ולאפשר תאים לדבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ברגע תאים יש המצורפת, התפשט על פני השטח, הם מוכנים בשבילכם photoactivation והדמיה. הערה: התמרה חושית Retroviral אפקטור T תאים עם פלורסנט הדמיה הגששים מתואר בפרט elswhere6,7. סידן איתות שניתן גם ללמוד באמצעות תאי T untransduced טעון עם סידן רגיש לצבוע Fluo-46. לצבוע רציומטרי Fura-2 לא מומלץ כי זה דורש עירור בטווח UV, אשר גם גורם decaging של pMHC photoactivatable.</li>
</ol>2. ייבוא תמונות
<ol><li>השתמש במיקרוסקופ TIRF הפוכה לבוש עם עדשה המטרה UV תואם 150 X עבור רכישת התמונה. UV להאיר אזורים על-ידי המשתמש באמצעות מערכת דיגיטלית הסרעפת מחוברת מנורת כספית W 100 (HBO). ישיר UV אור המנורה הזו על המדגם באמצעות מראה מסירה ארוכה 400 nm.</li>
	<li>השתמש התמונה ניתוח תוכנה עבור photoactivation מקומי ורכישת זמן לשגות. בניסויים רוב, לפקח על הגששים בערוצים שני ירוק ואדום באמצעות 488 ננומטר, 561 nm עירור לייזרים, בהתאמה. אור לייזר מכוונת על המדגם באמצעות מראה כפולה-bandpass ודיקרואיק זוהר ששולחות גם בטווח UV (כדי לאפשר decaging). אנא עיין טבלה של חומרים איור 6 לקבלת מידע נוסף על תצורת מיקרוסקופ.</li>
	<li>לאחר טעינת השקופית תא המכיל תאי T, להתאים את ההגדרות כדי להשיג תאורה TIRF או epifluorescence, לפי הצורך. במצב live, בחר שדה של תאים הם המבטאים את probe(s) פלואורסצנט עניין. להקים בקנה מידה מיקרון אזורים עבור photoactivation מתחת תאים בודדים באמצעות תוכנת שליטה.</li>
	<li>מתחילים רכישת זמן לשגות. בדרך כלל, 80 timepoints נרכשים, עם מרווח של 5 s בין כל נקודת זמן. זה משאיר יותר ממספיק זמן רציפים 488 ננומטר, 563 חשיפות ננומטר, במקרה של ניסויים צבע כפול.</li>
	<li>לאחר 10 timepoints, photoactivate האזורים שנבחרו על-ידי פתיחת הסרעפת דיגיטלי תריס עבור s 1-1.5.</li>
	<li>בתום זמן לשגות, בחר שדה חדש של תאים וחזור על התהליך.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
הערה: photoactivation המותאמות לשפות אחרות של ליגנדים קיבוע יוצר אזור מופחתים מוגדרים היטב, נייח יכול לשמש לניתוח כמותי של איתות תגובות ואירועים שיפוץ cytoskeletal. ניתוח פרוטוקולים בדרך כלל כרוכים או לכימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך אזור לקרינה או באמצעות האזור לקרינה כמו נקודת קצה של מיקום מרחק מעבדתיים (למשל. להערכת קיטוב של centrosome אזור לקרינה). ניתוח פרוטוקולים שיפורטו להלן. תוכניות שונות של ניתוח תמונה אינטראקטיבית יכול לשמש כדי להפוך את העוצמה של מדידות מרחק, אשר לאחר מכן ניתן ליצור תבנית פלט עבור עיבוד נוסף וניתוח.
<ol><li>
עוצמת קרינה פלואורסצנטית
	<ol>
<li>קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) של אזור רקע מחוץ לתא (FIb). זה ישמש עבור רקע תיקון.<ol>
<li>לצייר אזור מרובע בגודל מיקרון מחוץ לתא ולעשות מסכה. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים. הערה: פרטי פרוצדורלי (למשל 3.1.1.1) מתייחסים לתוכנה Slidebook (ראה טבלה של חומרים). יישום של פרוטוקול זה באמצעות חבילות תוכנה אחרות (למשל., פיג'י) יהיה שונה במקצת.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לקבוע את האלחוטי בתוך אזור photoactivated עבור כל נקודת זמן.<ol>
<li>בחרו מסיכה כדי לסמן את אזור זה היה photoactivated. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הפחת על רקע פי מתוך הערכים FI שנמדד באזור. לאחר מכן, לנרמל את המידות FI המתוקן על-ידי חלוקת מאת הממוצע, רקע מתוקנת האלחוטי של המסגרות 9 קודם לפני photoactivation. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). הערה: גרף ΔF/F כפונקציה של הזמן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מרחק
	<ol>
<li>להשיג x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.<ol>
<li>כדי לקבוע את x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated, בחרו מסיכה כדי לסמן את אזור זה היה photoactivated. ברגע האזור של photoactivation מודגשת, בחר נתח | מסיכה סטטיסטיקה | מרכז של אזור ולייצא את הערכים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לקבוע x ו- y קואורדינטות עבור המכשיר פלואורסצנט עניין עבור כל נקודת זמן. זו מושגת בדרך כלל באמצעות חלקיקים ידני או אוטומטי מעקב.<ol>
<li>כדי לקבוע את x ו- y הקואורדינטות של המכשיר פלואורסצנט עניין, בחר ידני חלקיקים מעקב ולחץ על החללית פלואורסצנט עניין לאורך זמן. לאחר כל נקודות זמן כבר מסומנים, לבחור נתח | מסיכה סטטיסטיקה | מרכז של אזור ולייצא את הערכים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לחשב את המרחק בין החלבון הניאון עניין למרכז של האזור photoactivated עבור כל נקודת זמן באמצעות המשוואה: מרחק = כהן ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), שבו x2 ו- y הם2 הקואורדינטות של החלבון הניאון של ריבית ו- x1 ו- y1 הן הקואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.</li>
		<li>גרף המרחק כפונקציה של הזמן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers.">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li><li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+kinase+&#945;+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse.">Diacylglycerol kinase &#945; establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82 (2014).</li><li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist.">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li><li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II.">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li><li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells.">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li><li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC:+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning.">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li><li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2-peptide+complexes:+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides.">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בשנים האחרונות התפתחה אור כלי מצוין עבור הפעלה מבוקרת spatiotemporally של תהליכים תאיים. מתודולוגיות שונות פותחו, כל אחד עם המשויך יתרונות וחסרונות. המערכת המתוארת כאן, אשר מבוססת על decaging של ליגנדים קיבוע, חוץ-תאית, מתאימה באופן אידיאלי עבור הניתוח של תגובות איתות מהירה, subcellular, מקוטב. גישה זו הוחל לבחון הוא היווצרות בתאי T כפי שתואר לעיל. בנוסף, ליגנדים בכלוב על רצפטורים אחרים יש מהונדס, ומאפשרת לנו ליישם את האסטרטגיה אותה כדי להעריך מעכבות איתות תאי הרג טבעיים, רוברטסונית הגרעין של הגורם שעתוק NF-κB בתגובה על אגרה כמו קולטן איתות14,15.
ב פרוטוקול זה, ליגנדים מופחתים הם הנשיכה כדי להבטיח שהם יישארו כמקור נייח, מקוטב של גירוי משך זמן הניסוי הדמיה. גישה זו היא מתאימה על מחקרים של התא קיטוב. יודגש עם זאת, כי הגישה photoactivation TCR הוא מותאם בקלות הפעלה מבוקרת חנותם תא T על השומנים הנתמכים bilayers. ללא ספק, אחד לא יכול להשיג גירוי מתמשך, מקוטב בהקשר זה. עם זאת, ייתכן שהדבר נחוץ, ובהתחשב ביעדים ניסיוני.
המערכת הוא גם גמיש למדי לגבי מקור אור UV עבור decaging. כיום, מנורה W Hg 100 משמש עבור תאורה ממוקדת, אולם לייזר פעמו חנקן (ns רוחב 4 דופק, דופק אנרגיה 120 mJ), היה בשימוש בעבר6. לעתים, מנורת UV כף יד (365 nm, 4 W) היה ממוקם מעל המדגם דימות על מנת decage אזורים גדולים של ליגנד photostimulatable. התכונות הספציפיות של מערכת decaging בכל מקרה תלוי הדרישות הטכניות של הניסוי המדובר.
בעת יישום מערכת זו, חשוב לוודא כי התגובות שנצפו הן ספציפיות עבור האירוע photoactivation, ולא התוצאה של הפעלת קולטן כדין או נזקי UV-induced. כדי לשלול לכלוכים אלה, ניתן לבצע שני פקדים ירידה לפרטים. ראשית, ניתן לנטר עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתאים הם לא ישירות מוקרן במהלך הניסויים photoactivation. אם השטח כראוי בכלוב, ניכר תגובות בתאים אלה לא להתייחס (לדוגמה, איור 5C). שנית, ניתן לבצע ניסויים ב- T אילו תאים UV-מזויפותאו מסומנות על משטחים חסר ליגנדים photoactivatable. שליטה זו היא חיונית לזיהוי UV-induced תופעות שאינן תלויות ליגנד photoactivatable (ראה לדוגמה, הפניה 6). במהלך מערכת אופטימיזציה, זה גם מועיל מאוד שיהיה בהישג יד איתנה הסלולר הדמיה תגובה (למשל, Grb2-GFP הגיוס) הוא גם מהיר וגם לשפות אחרות. הערכת מתאמים בין אירועים איתות, photoactivation היא הרבה יותר פשוטה אם האירועים הללו הם spatiotemporally הפרוקסימלית אל קולטן לגירוי.
למרות הגישה photoactivation מציעה שליטה ייתכן משובח על קולטן איתות, היא חסרה את הסתגלות המוענקת על ידי transfectable optogenetic מערכות16,17,18,19 ,20,21,22. חלבונים מסוימים optogenetic גם הם photoreversible, מספקת מותנה שליטה שאינה זמינה עם הגישה photoactivation המתוארים כאן. במערכות optogenetic, עם זאת, הגבלת פעפוע של חלבונים photoactivated הוא טכנית מאתגר. זה מסבך את הניתוח של איתות מקוטב, במיוחד בהקשר subcellular.
צריך גם לציין כי הישות מרתקים של המערכת photoactivation הזאת היא משטח זכוכית, אשר לא מסכם את הדברים בכל ההיבטים של אינטראקציה תאים תאים בתום-לב. כדי לעקוף בעיה זו תוך שמירה על בקרת ייתכן אות החניכה, החוקרים השתמשו מערכת אופטית מלכודת להביא משוריין במגע עם תא T, המאפשר התחלתה של cytoskeletal rearrangements ו- IS ההבשלה להיות דמיינו בזמן אמת23. למרות מערכת זו מאפשר החניכה מדויק, ויזואליזציה של cytoskeletal dynamics באמצעות משוריין בפועל, זה תפוקה נמוכה יחסית והוא לא תואם עם תאורה TIRF, המשפיע לרעה על איכות התמונה.
לסיכום, השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה מספק שליטה ייתכן TCR-induced איתות בתוך התא T, בסופו של דבר המאפשר הבהרה של שינויים ביוכימיים מהר בעקבות הפעלת TCR. מערכת זו מספקת לנו אמצעים כדי להבין טוב יותר איך האירועים איתות בעקבות הפעלת TCR לקדם קיטוב תא T, הוא היווצרות, ובסופו של דבר מסירת אפקטור תגובות.

T לימפוציטים (T תאים) לשחק תפקיד מרכזי חסינות תאית על ידי זיהוי פפטידים antigenic מוצג בהקשר של תא השטח MHC. זיהוי אנטיגן, אשר מתווך על ידי TCR, מניע את הבידול של תמים T תאים ומעודדת המסירה של התגובות cytolytic וקומוניקטיבי אפקטור אוכלוסיות. TCR האירוסין גורם גם שינויים דרמטיים אדריכלות הסלולר. בתוך דקות, תאי T אני מטפל לצד של התא אנטיגן (APC), ויצרו ממשק מקוטב המכונה סינפסה אימונולוגי (IS)1,2. IS potentiates תא T אפקטור תגובות על-ידי הפעלת שחרור כיוונית של ציטוקינים או, במקרה של לימפוציטים T ציטוטוקסיות (Ctl), חלבונים lytic להרוס את APC.
TCR האירוסין מאת pMHC גורם זירחון מהירה של מולקולות מתאם הזרם מרובות, כולל מקשר עבור התאים ההפעלה של T (LAT), אשר בסופו של דבר מקדם שיפוץ חזקים של שלד התא סינפטית2. אקטין filamentous בקליפת המוח (F-אקטין) כוננים תא T מתפשטת על פני השטח APC, ואז פותר לתוך מבנה טבעתי מאופיין על ידי F-אקטין הצטברות IS הפריפריה, דלדול מהמרכז. F-אקטין טבעת היווצרות בחוזקה רתומה ולהתפכחות של מרכז הארגון microtubule (MTOC, הנקרא גם centrosome של תאי T) למיקום מתחת למרכז של ממשק שני האירועים מתרחשים בתוך דקות של זיהוי אנטיגן הראשונית ולהקים ההקשר אדריכלי אירועי הפעלה עוקבות, אפקטור מתרחשות תגובות.
ללמוד הוא היווצרות, מעבדות שונות פיתחו גישות אשר APC מוחלף על ידי משטח זכוכית מכיל ליגנדים TCR קיבוע או תומך ליפידית עצמו מכיל3,ליגנדים4. תאי T טופס הוא כמו הקשר על משטחים אלה יכולים לדימות גמורה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRF) או מיקרוסקופיה קונפוקלית, הפעלת מחקרים ברזולוציה גבוהה של הפעלת תא T מוקדמת ויצירת IS.
למרות גישות אלה אפשרו להמחשת מעולה של IS שהרכבתם, הרבה איתות מצדו TCR:pMHC הבאים מתרחש תוך שניות, מקשים על המאמצים כדי לקבוע את רצף האירועים בעקבות הפעלת TCR במדויק . כדי לעקוף בעיה זו, בגישה photoactivation פותחה, שבו photoactivatable pMHC משמש כדי להשיג שליטה ייתכן TCR הפעלה5,6,7. במערכת זו, תאי T מחוברים משטחי זכוכית המכיל pMHC photoactivatable זה ללא-מופחתים TCR עד מוקרן באור אולטרה סגול (UV). הקרנת UV על אזור מיקרון בגודל של המשטח מתחת לתא T מסיר את photocage יצירת אזור מופחתים יכולים להיות מזוהים על-ידי תא T. והאירועים איתות ובניה cytoskeletal ואז מנוטרים באמצעות מקודדים גנטית כתבים פלורסנט. שתי גרסאות photoactivatable של פפטידים antigenic, עש ציטוכרום c88-103 (MCC) ו אובלבומין257-264 (פשוט), אשר מוצגות בהקשר של המחלקה II MHC-Ek , הכיתה אני MHC H2-Kb, בהתאמה, היה פיתח (איור 1). פעולה זו מאפשרת הניתוח של שני CD4+ T תאים ספציפיים עבור MCC-אני-Ek (לבטא את ג 5 C7, 2B4, או AND TCRs) ו CD8+ T תאים ספציפיים עבור ביצית-H2-Kb (לבטא את OT1 TCR).
בעשור האחרון, הגישה photoactivation ודימות TCR יש כבר מנוצל כדי לבסס את קינטיקה מדויק של TCR מוקדם איתות צעדים וגם כדי לזהות מסלולים מולקולריים המסדירים מקוטב cytoskeletal שיפוצים5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. לדוגמה, וזמינותו היה תפקיד חשוב בקביעת centrosome הזה ולהתפכחות לכיוון APC מתווך על ידי מעבר הדרגתי המותאמות לשפות אחרות של השומנים השני messenger diacylglycerol מרוכז בכל IS. הוא צפוי כי מתודולוגיה זו ימשיכו להיות יקר עבור יישומים הדורשים ניתוח דימות ברזולוציה גבוהה של תפקוד תא T.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Will be used to biotinylate proteins</td></tr><tr><td>Biotinylated Hb I-E&lt;sup&gt;K&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-MCC I-E&lt;sup&gt;K&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &amp;alpha;H2-K&lt;sup&gt;k&lt;/sup&gt; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-OVA H2-K&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-D&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated ICAM1&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td></tr><tr><td>Hand held UV lamp</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>Lamp is held &amp;lt; 1 cm from the sample.&amp;nbsp; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td></tr><tr><td>Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Additional information about the imaging system can be found in &lt;strong class=&quot;xfig&quot;&gt;Figure 6&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mosaic digital diaphragm</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

לימפוציטים מסוג T לעסוק מהירה, מקוטב איתות, המתרחשים בתוך דקות לאחר הפעלת TCR. זה גורם להיווצרות הסינפסה חיסוניות, צומת הסטראוטיפי תא-תא זה מווסת את תא T הפעלה ויעדים directionally אפקטור תגובות. ללמוד ביעילות של תהליכים אלה, נחוצה גישה הדמיה המותאם לתפיסת תגובות מהר, מקוטב. פרוטוקול זה מתאר מערכת כזו, אשר מבוססת על photoactivatable פפטיד-מייג'ר histocompatibility מורכבים (pMHC) זה שאינו מופחתים עד חשוף לאור אולטרה סגול. Decaging יישוב של ריאגנט הזה במהלך הניסויים videomicroscopy מאפשר שליטה ייתכן מדויקת של הפעלת TCR וניטור ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר עוקבות מאת גמורה (TIRF) הדמיה. גישה זו מתאימה גם אסטרטגיות ההפרעות גנטיות ולא תרופתי. דבר זה מאפשר ההרכבה של מסלולים מולקולריים מוגדרים היטב לקשר TCR איתות היווצרות המבנים cytoskeletal מקוטב העומדים בבסיס הסינפסה אימונולוגי.

הגישה photoactivation ודימות מאפשר התבוננות נתיישב כימות של תגובות איתות מהירה, מקוטב. כדי להדגים את היכולות שלה, לשכפל הנה ניסוי בחינת המתאם ייתכן בין צבירה דאג TCR-induced ולהתפכחות centrosome. ג 5 תקיעות התא C7 T היו transduced retrovirally עם שני הכתבים פלורסנט: ביוסנסור דאג המכיל קבוצות המחשבים C1 טנדם מכל חלבון קינאז C-θ באמצעות מקושר GFP (C1-GFP) ו- RFP-טובולין כדי לנטר את centrosome. תאי T צורפו אז אל תאיים coverglass המכיל photoactivatable MCC-אני-Ek. C1-GFP צולמה באמצעות מיקרוסקופ TIRF ו- RFP-טובולין במצב epifluorescence. כפי שמוצג באיור2, photoactivation המותאמות לשפות אחרות של המשטח מתחת לתא T גורם להצטברות של דאג באזור לקרינה. זה מלווה בתוך שניות ולהתפכחות של centrosome באזור.
C1-GFP הצטברות ניתן לכמת על-ידי חישוב עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל, לאחר תיקון רקע, במרכזו של אזור photoactivated לאורך זמן (איור 3). ניתן לכמת centrosome ולהתפכחות בתגובה photoactivation על-ידי חישוב המרחק בין centrosome את המרכז של האזור photoactivated כפונקציה של הזמן (איור 4).
בשיטה זו ניתן לבחון מגוון רחב של תגובות איתות מהירה, מקוטב, בעצם כל דבר ניתן לנטר באמצעות בדיקה פלורסנט. לדוגמה, TCR photoactivation הוא מנוצל כדי לפקח בתחילת הגיבוש microcluster איתות באמצעות Grb2 שכותרתו fluorescently (Grb2-GFP) (איור 5). בדומה להצטברות דאג ותגובות ולהתפכחות centrosome, קיטוב Grb2-GFP מתרחשת זמן קצר לאחר photoactivation (איור 5), ניתן לכמת באמצעות גישה עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig1.jpg"> איור 1: המערכת Photoactivation באמצעות photocaged MCC פפטיד. (א) Photocaged אסטרטגיה פפטיד MCC. קבוצת NPE מחובר ליזין. השאריות פפטיד MCC. הקרנת UV גורמת להסרת NPE, שחזור MCC לצורתו המקורית. (B) כאשר NPE מאוגד MCC, ג 5 C7 TCR אין אפשרות לאגד אל MCC. הסרת NPE תוצאות מתוך הכרה ג 5 TCR C7 ל פפטיד MCC מקורית. (ג) האסטרטגיה photocaged הותאם לעבודה עם תאי CD8 + T, שבו פפטיד ביצית photocaged משמש כדי להפעיל את TCR OT-1 על הקרנת UV.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig2.jpg"> איור 2: מונטאז בצילום מואץ של הצטברות דאג ולהתפכחות centrosome בעקבות photoactivation של TCR ב 5 ג תא C7 T. ג 5 תא C7 לבטא ביוסנסור דאג, המכיל טנדם C1-תחומים של PKC - התמזגו GFP (C1-GFP), תג-RFP טובולין (RFP-ג'קוזי), כתב centrosome פלורסנט. Montages להמחיש את התגובה מקוטב של 5 ג תאי C7 T לאורך זמן. האליפסה צהוב והטקסט מציינים את הזמן והמיקום של photoactivation. לאורך זמן, C1-GFP מצטבר על האזור photoactivated, ואחריו centrosome ולהתפכחות לכיוון האזור photoactivated. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig3.jpg"> איור 3: כימות של הצטברות דאג על האזור photoactivated ניתן לכמת דאג, C1-GFP, הצטברות על האזור photoactivated (משמאל) על-ידי חישוב עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל, לאחר תיקון רקע, על האזור photoactivated (עיגול צהוב עם צללית כחולה) לאורך זמן. הנתונים הם מנורמל ביחס המסגרות תשעה שהושגו לפני photoactivation. C1-GFP העשרה על האזור photoactivated יכול להיות מחושב על ידי חלוקת עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע באזור לקרינה מעוצמת פלורסצנטיות אומר כל התא, בעקבות תיקון רקע. המשוואה: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), על פי אילו היא עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע, ניתן להשתמש כדי לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל. אז יכול להיות בגרף עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמלת על האזור photoactivated כפונקציה של הזמן (מימין). הקו הסגול מציין את הזמן של photoactivation. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig4.jpg"> איור 4: כימות ולהתפכחות centrosome. לקבוע את הקואורדינטות של centrosome (RFP-ג'קוזי) לאורך זמן על ידי שתבצע מעקב ידני אחר הנתיב centrosome לכיוון האזור photoactivated (חץ לבן) בכל נקודה בזמן (משמאל). לקבוע את נקודות הציון של המרכז של אזור photoactivated (עיגול צהוב). ניתן לחשב את המרחק בין centrosome את המרכז של האזור photoactivated בכל נקודה בזמן באמצעות המשוואה עבור מרחק = כהן ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), שבו x2 ו- y 2 נמצאים ה-x, y נקודות ציון במרכז האזור של centrosome, ולא x1 ו- y1 x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated. המרחק של centrosome מן המרכז של האזור photoactivated בכל מועד נקודת יכול אז להיות בגרף כפונקציה של הזמן (מימין). הקו הסגול מציין את הזמן של photoactivation. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig5.jpg"> איור 5: Grb2-GFP-צורה microcluster. (א) נציג 5 ג תא C7 לבטא fluorescently שכותרתו Grb2 (Grb2-GFP). Montages ממחישים את התגובה מקוטב Grb2-GFP נוספות. האליפסה צהוב והטקסט מציינים את הזמן והמיקום של photoactivation. לאורך זמן, מצטבר Grb2-GFP-האזור photoactivated. (ב) כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית Grb2-GFP-האזור photoactivated לאורך זמן. N = 15 תאים. (ג) כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית Grb2-GFP באזור הבקרה מחוץ לאזור photoactivated. N = 15 תאים.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56655/56655fig6.jpg"> איור 6: מיקרוסקופ תצורה עבור photoactivation ו- TIRF הדמיה. 488 ננומטר, 561 ננומטר לייזר משמשים TIRF epifluorescence הדמיה של הגששים ירוק ואדום, בהתאמה. אולטרא סגול עבור photoactivation נלקח מנורת כספית (Hg) המחובר למערכת דיגיטלית הסרעפת מסוגל זרחני אזורים קטנים, על-ידי המשתמש. אור המנורה/הסרעפת Hg משתקף על המדגם על ידי מראה longpass ממוקם מתחת במראה ודיקרואיק זוהר שמשקף את הלייזרים הדמיה. להיות מעוצב במראה ודיקרואיק זוהר לעבור UV אור. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56655/56655fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist at JoVE.com

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K Views.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

Video: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Bioengineering

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Genetics

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biology

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Neuroscience

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain unanswered. One requirement for advancements in our understanding of the underlying disease mechanisms and cellular dynamics is the precise coupling of the microanatomical location of cell subsets with downstream molecular or functional analyses; a goal that has traditionally been difficult to achieve. The development of stable photoactivatable biological fluorophores and their integration into reporter strains has recently enabled precise microanatomical labeling and tracking of cellular subsets in murine models. Here, we describe how the ability to analyze autoreactive lymphocytes from single germinal centers may help to provide novel insights into autoimmunity, using the combination of a novel chimeric model of autoimmunity with a photoactivatable reporter as an example. We demonstrate a procedure for generating mixed chimeras with spontaneous autoreactive germinal centers populated by lymphocytes carrying a photoactivatable green fluorescent protein reporter. Using in vivo labeling strategies, single germinal centers can be visualized in explanted lymphoid tissues and their cellular constituents photoactivated by two-photon microscopy. Photoactivated lymphocytes from single germinal centers can then be analyzed or sorted flow cytometrically, as single cells or in bulk, and may be subjected to additional downstream molecular and functional analyses. This approach may directly be applied to provide renewed insights in the field of autoimmunity, but the procedure for generating bone marrow chimeras and the photoactivation procedure may additionally find broad application in studies of infectious diseases and tumor metastases.

This protocol describes the generation of mixed murine bone marrow chimeras with spontaneous autoimmune germinal centers, in which autoreactive lymphocytes carry a photoactivatable green fluorescent protein (PA-GFP) reporter. This provides the ability to link cellular location in tissues with downstream molecular and functional analyses.

חוקרים למרכזי נבטי Autoreactive בודדים על-ידי Photoactivation במודל של Chimeric מעורבת של מחלת חיסון עצמי

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain ...

<meta charset="utf8"></head><body>בקרה אופטוגנטית של פעילות האנזים באמצעות מתג אלוסטרי מווסת אור

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most optogenetic approaches often face significant challenges in integrating multiple capabilities in a single tool applicable to a wide range of target proteins. Achieving precise control over ON/OFF kinetics, ensuring minimum leakiness in the dark, and demonstrating efficient performance in mammalian cells with subcellular precision are some of the most common challenges faced in this field. A promising solution lies in the application of rationally designed light-sensitive domains to allosterically control protein activity. Using that strategy, we generated an optogenetic method combining all the desired features. The approach involves the incorporation of the Light-regulated allosteric switch module (LightR) in the target protein to regulate enzyme activity using blue (465 nm) light. The LightR domain is generated by linking two Vivid (VVD) photoreceptor domains, creating a light-sensitive clamp that can be incorporated into a small flexible loop within the catalytic domain of an enzyme. In its dark state, LightR clamp is open, thus distorting the enzyme&#39;s catalytic domain and inactivating it. Upon exposure to blue light, the LightR domain closes and restores the catalytic domain&#39;s structure and enzyme activity. In this manuscript, we discuss design strategies&#160;to generate a light-regulated protein kinase and demonstrate its control by blue light, reversibility, kinetics, and precise regulation at the subcellular level, enabling tight spatiotemporal precision. Utilizing Src tyrosine kinase as a model, we showcase a protocol for effectively regulating LightR-Src kinase activity. We also demonstrate LightR applicability across different enzyme classes, expanding the utility of the tool system in addressing mechanistic questions of signaling pathways in different diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי

This protocol describes the application of an engineered blue-light-activated allosteric switch (LightR) domain for reversible spatiotemporal control of protein activity. Utilizing Src tyrosine kinase as a model, this study offers an elaborate protocol for developing and characterizing light-regulated Src (LightR-Src). It demonstrates the versatility of this approach across enzyme classes.