We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).

<ol>
	<li>Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Stimulation+of+Nerve+Cells+in+Aplysia.">Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia.</a> Science. 171 (3974), 907-908 (1971).</li><li>Callaway, E. M., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+using+caged+glutamate+reveals+functional+circuitry+in+living+brain+slices.">Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).</li><li>Cambridge, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-dependent+photoactivated+gene+expression+in+eukaryotic+systems.">Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems.</a> Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).</li><li>Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+cortical+neurons+form+fine-scale+functional+networks.">Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks.</a> Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).</li><li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior.">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+for+remote+control+of+neuronal+firing.">Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing.</a> Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).</li><li>Volgraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+control+of+an+ionotropic+glutamate+receptor+with+an+optical+switch.">Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch.</a> Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).</li><li>Szobota, S., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+neuronal+activity.">Optical control of neuronal activity.</a> Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+disulfide+connectivity+using+backbone+ester+hydrolysis.">Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis.</a> Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).</li><li>Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+caged+cysteine+and+caged+tyrosine+into+a+transmembrane+segment+of+the+nicotinic+ACh+receptor.">Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+decaging+leads+to+substantial+membrane+trafficking+during+modulation+of+an+inward+rectifier+potassium+channel.">Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel.</a> J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).</li><li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code.">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).</li><li>Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Expanding the genetic code of Escherichia coli.</a> Science. 292 (5516), 498-500 (2001).</li><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code.">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons.">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+for+cellular+and+neuronal+studies.">Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies.</a> Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).</li><li>Kang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+expression+of+a+light-activatable+potassium+channel+using+unnatural+amino+acids.">In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids.</a> Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).</li><li>Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+functional+studies+with+structures+of+inward-rectifier+K(+)+channels.">Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).</li><li>Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+synaptic+plasticity+triggered+by+selective+suppression+of+activity+in+individual+neurons.">Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons.</a> Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).</li><li>Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+genetic+suppression+of+neuronal+excitability.">Inducible genetic suppression of neuronal excitability.</a> J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+protein+phosphorylation+with+a+genetically+encoded+photocaged+amino+acid.">Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid.</a> Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).</li><li>Coin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+chemical+probes+in+cells+reveal+the+binding+path+of+urocortin-I+to+CRF+class+B+GPCR.">Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR.</a> Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).</li><li>Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterification+of+an+unnatural+amino+acid+structurally+deviating+from+canonical+amino+acids+promotes+its+uptake+and+incorporation+into+proteins+in+mammalian+cells.">Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells.</a> Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).</li><li>Parrish, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Genetic+Code+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Bacterial+Aminoacyl-tRNA+Synthetase/tRNA+Pairs.">Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs.</a> ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).</li><li>Lu, H., Klaassen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+and+thyroid+hormone+regulation+of+Pept1+and+Pept2+mRNA+in+rodents.">Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents.</a> Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Plaster, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Kir2.1+cause+the+developmental+and+episodic+electrical+phenotypes+of+Andersen's+syndrome.">Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome.</a> Cell. 105 (4), 511-519 (2001).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+short+QT+syndrome+(SQT3)+is+caused+by+a+mutation+in+the+KCNJ2+gene.">A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene.</a> Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).</li><li>Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+mapping+ion+channel+function.">Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function.</a> Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).</li><li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+photoswitchable+click+amino+acids+in+Escherichia+coli+and+mammalian+cells.">Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).</li><li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Formation+of+an+Azo+Bridge+on+Proteins+Controllable+by+Visible+Light.">In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light.</a> J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כדי להשיג צילום אפנון יעיל, השלב הראשוני החשוב הוא להחליט היכן לשלב את UAA photoresponsive ב חלבון המטרה. מידע מבני ותפקודי של חלבון המטרה מאוד עוזר להנחות את הבחירה של אתרי מועמדים. במקביל, לעניין תקנת אור היה לקבוע איזה אתר הוא מתאים ביותר. לאחר בחירת אתרי מועמדים, אנו ממליצים לבדוק באתרים בשורות תא יונקים כגון הכליה העוברית האנושי (HEK) תאים לתרבות ומניפולציה קלות, לפני שתמשיך הנוירונים עיקריים in vivo. כדי לזהות אתר עבור photoactivation Kir2.1 מספר אתרים לאורך הנקבובי Kir2.1 נבדקו תחילה בתאים HEK. C169 של Kir2.1 נמצא אופטימלי, משום הגודל הנקבובי Kir2.1 שבו C169 מתגורר הוא גדול מספיק כדי להכיל שרשרות צד CMN אך קטן מספיק עבור רשתות בצד CMN לחסום מעבר יוני. כאשר CMN התאגדה ב C169 ב Kir2.1 לידי ביטוי בתאים HEK, tהוא כתוצאה מוטציה Kir2.1 היה פעיל אך הפך מופעל על יבבה קצרה של אור, המאשר פיתוח PIRK מוצלח 21. ביטוי יעיל של tRNA ו synthetase המאונך הוא קריטי להשגת יעילות התאגדות UAA גבוהה בתאי in vivo. גן synthetase המאונך מתבטא ביעילות באמצעות אמרגן פולימראז II ואותות פולי משמש לעתים קרובות בתאים ונוירונים יונקים. עבור ביטוי של tRNA המאונך, אמרגן III פולימראז סוג -3 מיוחד, כמו המקדם H1 משמש כאן, יחד עם רצף איגוף-3&#39;נדרשים כפי שתואר לעיל 18,20. עבור מחקרי in vivo, מצאנו כי שלושה עותקים של קלטת ביטוי tRNA התייעלות התאגדות CMN לעומת עותק אחד (איור 5 א). במחקר אחר בתאי יונקים, הגדלת מספר קלטת ביטוי tRNA גדל גם יעילות ההתאגדות UAA 30. Therefore, מומלץ לבצע אופטימיזציה של מספר קלטות הביטוי tRNA עבור Uaas, תאים שונים, וחלבונים היעד כאשר יעילות ההתאגדות UAA טעון שיפור. זמינות ביולוגית של Uaas בתאים ובחי הוא גורם קריטי עבור התאגדות UAA. מחקרים קודמים הראו כי esterification של Uaas מגביר ספיגת שלהם בתאי יונקים 31, וכי הכנת Uaas בצורה dipeptide מגביר ספיגת UAA לתאים elegans Caenorhabditis 32. מצאנו כי האכלת CMN ישירות תקשורת ותרבות העצבית מספיקה עבור התאגדות CMN ב Kir2.1 לידי ביטוי הנוירונים עיקריים תרבותיים, אבל לא מספיק עבור התאגדות במוח העכבר in vivo 21. לכן, dipeptide CMN-עלא היה מסונתז והזריק לתוך מוח העכבר. טרנספורטר Oligopeptide PEPT2 מבוטא בכמות גבוהה במוחות מכרסמים 33, אשר עשוי להקל על הובלת dipeptide לתוך הנוירונים. Dipe הפניםptide יהיה הידרוליזה על ידי peptidases הסלולר להניב את UAA CMN עבור התאגדות. ואכן, עם אופטימיזציה זו השגנו התאגדות CMN ביותר לחלבונים עצביים על אזורים המרובים של מוח העכבר העוברי, כולל הניאוקורטקס, התלמוס וההיפותלמוס 21. ביטוי PIRK מוצלח בנוירונים תלויים במידה רבה על הכנת התרבות העצבית בריאה. כל צעד בפרוטוקול צריכה להתבצע באופן מדויק ומוקפד. לאחר הכנה תרבות, עדיף לשמור על התרבות בחממה ללא הפרעה. פתיחה וסגירה של דלת החממה, כמו גם העברת המנה תרבות פנימה והחוצה של החממה, ניתן להוסיף עד לערעור איכות ותרבות. טמפרטורה בחממה תחתונה (35 ° C במקום 37 ° C) עוזרת להפחית יתר רעיל. בנימה דומה, transfection Ca-P צריך להיעשות במשנה זהירות. הכנת חיץ 2x BBS היא שלב קריטי. זה רעיון טוב כדי קאליbrate ה- pH האופטימלי עבור חיץ 2x BBS בין pH 6.90-7.15, מאז בונה או preps DNA החדש יוכל לשנות תנאי transfection. ה- pH החיץ יכול להיות מותאם בדייקנות אל 0.01 הספרות אם זה עוזר להשיג תוצאות עקביות. לפני transfection, תקשורת הצמיחה של תרבות העצבית מוחלפת אחד טרי. זה חיוני כדי לשמור את המדיה הצמיחה המקורית, ולהוסיף חזרה לתרבות לאחר transfection כדי לשחזר את המצב המקורי. שמירת נוירון תרבות בתקשורת טריה לאחר transfection תפריע נוירונים מחלים, שכן הוא חסר מולקולות מפתח עבור התפשטות תאים כגון גורמי גדילה שוחררו מהתא עצב. להגברת פעילות לאור PIRK בתאים בתרבית ופרוסות רקמות, מקור שיטת הצגה באור נכון צריכים להיות נחוש. CMN סופג אורות UV גל ארוך ובינוני (280-400 ננומטר). עם זאת, האריך חשיפה לאור UV, במיוחד לאור UV באורך גל קצר יותר, יהיה מזיק לתאים. באותו הסםזמן דואר, אור מרחיקות אדום יכול לחמם את הדגימה perturbing התאים. לכן, LED עם פליטה חד אורך גל הוא טוב ביותר עבור הפעלת PIRK. לקבלת photolysis CMN, נורית עם פליטה של ​​385 ננומטר (~ 40 mW; Prizmatix) נבחרה. הנורית מותקנת חיצוני ליד המיקרוסקופ, סיב אופטי משמש כדי להעביר את אור בדיוק הנוירון בפוקוס. לרכישת נתונים לשחזור, הסיב האופטי מוגדר במרחק 1 ס&quot;מ בזווית של 45 מעלות מן הנוירון בפוקוס. כוח אור על המדגם נמדד 40 mW / cm 2. מומלץ גם לבדוק את ביצועי LED מעת לעת באמצעות מד כוח אופטי. אנו מראים כי ב electroporation ברחם הוא טכניקה יעילה גנטי לשלב Uaas in vivo. ברחם electroporation של DNAs פלסמיד לתוך הניאוקורטקס העכבר העוברי מבוצע כפי שתואר לעיל 34, עם שינויים קלים. כדי לבטא חלבונים PIRK ב neonataמוח עכבר l, שני ניתוחים נדרשים (איור 5 ב). הצעד הראשון הוא להזריק בונה גן לביטוי PIRK ואחריו electroporation. ימים לאחר מכן, זריקת המוח השנייה מתבצעת על מנת לספק CMN-עלא. זה ידרוש בפועל לבצע ניתוחים במיומנות, בלי להשקיע מאמץ החיות יותר מדי. לאחר כל ניתוח, בעלי החיים צריכים להיות טפלו ובדקו על בסיס קבוע במהלך ההתאוששות. זמינות מספיק ועדכני של CMN במוח חיונית לביטוי PIRK נכון. 2-5 μl של CMN-עלא (500 מ&quot;מ) מוזרק בדרך כלל אל המוח העוברי. לפעמים, זה עוזר להזרים CMN-עלא החדר הן electroporated האונה הנגדית, מאז CMN-עלא מהצד ההפוך שיפזר לצד electroporated עבור CMN אספקה ​​מורחבת. בהתחשב שירות כללי של electroporation ברחם, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לא רק נוירונים neocortical אלא גם נוירוניםבאזורים אחרים במוח כגון בסטריאטום, diencephalon, מוח קטן, כאשר אתר electroporation / הזרקה מותאם לכל איזור. המוח בילוד / עוברי הם הרבה יותר רך מאשר מוחות בוגרים, כך שזה יהיה קשה לקבל פרוסות חריפות לניסויים אלקטרופיזיולוגיה. הטבעת agarose עוזרת לייצב את מבנה המוח העוברי עבור vibratome חיתוך. למרות נקודת התכה נמוכה agarose ממזער הלם טמפרטורה לרקמות המוח, זהירות נדרשת כאשר יוצקת נמס agarose על מוחות קרים. השפעת הלם טמפרטורה לרקמה מן ההטבעה agarose הייתה מורגשת במהלך הקלטת התא כולו. גנטי קידוד Uaas photoresponsive ב נוירונים בתרבית ובחי, שהודגם על ידי PIRK כאן, יעניק טכניקת optogenetic לשלוט בפעילות חלבון שונה עצבית עם אור בסביבת מולדתם. הפרוטוקול הנוכחי מציג הליך צעד צעד אחר לבצע ניסויי הפעלת ביטוי PIRK in תרבות עצבית במבחנה במוחות מכרסמים in vivo, המייצגים את הפיתוח המוצלח הראשון של מערכת UAA לשימוש מוח יונק. יש לו ושיכול לתרום מחקר של חלבונים טבעיים רבים, כמו גם ההשלכות שלהם מחלות. לדוגמה, α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic חומצה (AMPA) קולטנים N-methyl-D-aspartate (NMDA) קולטנים לשתף מבנים הטרנסממברני דומה עם ערוצי Kir2.1. זה היה אפוא להיות ריאלי ליישם מתודולוגיה PIRK כדי תעלות יונים ליגנד מגודרת אלה. יתר על כן, טכניקת PIRK יכול גם להיות מנוצלת כדי לטפל בפתופיזיולוגיה של מחלות גנטיות הקשורות Kir2.1, כגון תסמונת אנדרסן ותסמונת QT קצר לב 35,36. בנוסף &quot;בלוק-ו-שחרור&quot; Cys באמצעות CMN, חומצות אמינו מרובים כגון טירוזין, סרין, ליזין, גלוטמט, aspartate, גליצין כבר בכלוב עם קבוצות photoreleasable שונים 37. לכן, אסטרטגיות דומות ניתן להשתמשד פוטו-להסדיר חומצות אמינו אלה בנוירונים במבחנה in vivo. ניתן להשיג זאת ועוד, שליטה אופטית הפיכה עם azobenzene המכיל Uaas, ו Uaas כזה עכשיו כבר מקודדים גנטיים ב E. coli ותאי יונקים 38,39. לסיכום, פרוטוקול זה מציג שיטה כללית של שליטה בפעילות של חלבונים עצביים במסגרות מולדתם עם אור. לשם השוואה לשיטות optogenetic אחרות הקשורות opsin-משפחה ואור אחרים חלבונים או תחומים רגישים, שיטה זו משתמשת מקודד גנטית רגישים לאור Uaas ושינויים משקע אחת בלבד. לכן, זה צריך להיות הפרעה מינימאלית לפונקציה, הסחר והלוקליזציה של חלבון המטרה נחקר. באתר-סלקטיביות גבוהה יכולה גם להיות מושגת עם המקודד הגנטי אלה Uaas אור-תגובה, כדי לספק גמישות רבה יותר וספציפי לחקירה מולקולרית מפורטת. פרוטוקול זה מספק גם את השיתוף הראשוןmprehensive, קל לעקוב אחרי הליך איך לשלב Uaas בהצלחה לחלבונים בנוירונים במבחנה in vivo. שליטה אופטית של חלבונים בכלל באמצעות מקודד גנטית Uaas בנוירונים במבחנה in vivo יש פוטנציאל גדול כדי ליהנות גם במדע בסיסי translational, ופרוטוקול זה יעזור לקדם את היישום שלה.

לעומת גירוי חשמלי קונבנציונלי, photostimulation מציעה רזולוציה של זמן ומרחב גדול עם הפרעה מינימאלית למערכת הפיזיולוגית של דגימות. מאז ההפגנה של שימוש בלייזר כדי לעורר נוירונים ב -1971 1, בדרכים יצירתיות רבות הומצאו אקסוגני לשלוט הפעילות העצבית עם אור. שחרור אופטי של אגוניסטים photocaged כבר זמן רב בשימוש ללמוד תגובה פיזיולוגית של הרשת העצבית הליגנדים 2,3,4. טכניקה זו הגבילה סגולית עקב דיפוזיה של אגוניסטים בכלוב. סגולי גנטי מושגת ectopically ידי ערוצי opsin רגיש לאור בעת ומשאבות 5,6,7, וזה יושם בהצלחה לווסת רשתות נוירונים שנבחרו אורגניזמים מודל מגוונים. עם זאת, זה יהיה קשה ליישם את השיטה לשלוט אופטי שונים חלבונים עצביים אחרים, מאז השתלת photoresponsiveness מן החלבונים opsin לחלבונים אחרים would דורש הנדסה אינטנסיבית שעשויות לשנות את התכונות הטבעיות של החלבון נחקר. מבחינת כימית קשירה ליגנד רגיש אקסוגניים לחלבון הוכיח דרך נוספת לשלוט על הפונקציונליות של חלבוני ערוץ 8,9,10. ליגנד מוצג או ממדפי אתר הקישור של החלבון דרך photoisomerization של מחצית azobenzene. כימית קשירה מגבילה את היישום בעיקר לצד תאיים של חלבונים בממברנה, למעט הצד התאי וחלבונים תאיים. Photoresponsive Uaas, לאחר שולבו חלבונים, לספק אסטרטגיה כללית לתמרן חלבונים עם אור. ב המאמצים המוקדמים, tRNAs acylated כימית עם Uaas photocaged היו microinjected לתוך ביציות Xenopus לשלב את Uaas לתוך קולטנים הממברנה תעלות יונים 11, אשר קידמו את ההבנה של יחסי מבנה-תפקידם 12,13,14.גישת microinjection זה מתמצה בעיקר ביציות גדולות. התאגדות גנטית של UAA עוקפת את acylation ו microinjection מאתגר מבחינה הטכנית tRNA באמצעות זוג מאונך tRNA / synthetase, אשר משלב את UAA באמצעות תרגום חלבון אנדוגני בתאי חי 15,16,17,18. UAA התאגדות לחלבונים עצביים הודגמה הנוירונים עיקריים ותאי גזע עצביים 19,20. לאחרונה, photoresponsive UAA כבר שולב גנטי לתוך חלבון עצבי במוח יונקי in vivo בפעם הראשונה 21. התקדמות אלה מאפשרים ללמוד חלבונים עצביים עם Uaas בסביבת הסלולר מולדתם. כלפי פנים Kir2.1 ערוץ אשלגן לתיקון הוא מיישר חזק שעובר K + זרמים יותר בקלות לתוך מאשר מחוץ לתא, והוא חיוני בוויסות תהליכים פיזיולוגיים כולל רגישות התא, הטון של כלי הדם, קצב הלב, מחדשזרימת מלח סופית ואינסולין לשחרר 22. התבטאות יתר של Kir2.1 hyperpolarizes פוטנציאל הממברנה של הנוירון היעד, אשר הופך להיות פחות 23,24 להתרגש. כדי לשלוט Kir2.1 אופטית בתאים המקוריים שלו, קאנג et al. מאוגד גנטי תמונת מגיבי UAA לתוך Kir2.1 לידי הביטוי בתאי יונקים, נוירונים מוח עכבר עוברי 21. דופק קצר של אור הצליח להמיר את UAA לתוך חומצה אמינית טבעית Cys, ובכך הפעלת חלבון Kir2.1 היעד. כאשר אשלגן צילום מושרה זה לתיקון כלפי פנים (PIRK) חלבון ערוץ התבטא הנוירונים עיקריים בהיפוקמפוס עכברוש, הוא הדחיק ירי עצבי בתגובת הפעלת אור. בנוסף, ערוץ PIRK התבטא הניאוקורטקס העכבר העוברי, וזרם האור מופעל PIRK ב נוירונים בקליפת המוח נמדד. היישום המוצלח של טכנולוגית UAA in vivo במוח היונקים פותח את הדלת כדי לשלוט אופטי חלבונים עצבייםבסביבה האם שלהם, אשר תאפשר לנתיחה אופטית של תהליכים ומנגנונים עצביים ברמה המולקולרית. בפרוטוקול זה אנו מתארים הליכי התאגדות גנטית של Uaas לתוך הנוירונים עיקריים בתרבות במוח העכבר העוברי in vivo. Photoresponsive UAA CMN ו Kir2.1 משמש כדי להמחיש את התהליך. שיטות להעריך התאגדות UAA מוצלחת שליטה אופטית של פעילות חלבון עצבית מסופקות. פרוטוקול זה מספק מדריך ברור גנטי קידוד Uaas בנוירונים ובחי, וכדי אופטי ויסות תפקוד חלבון עצבי באמצעות UAA photoresponsive. אנו מצפים פרוטוקול זה כדי להקל על אימוץ הטכנולוגיה in vivo UAA עבור הנוירולוגיה מחקרים ביולוגיים optogenetic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:301px;">Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm</td>
			<td style="width:455px;">Carolina Biologicals</td>
			<td style="width:301px;">633029</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:455px;">Corning Discovery Labware</td>
			<td style="width:301px;">354210</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:301px;">G8769</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Iris Spatula-curved</td>
			<td style="width:455px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:301px;">10092-12</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Dissecting Knife - Fine Angled Tip</td>
			<td style="width:455px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:301px;">10056-12</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td style="width:455px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:301px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">MITO+ Serum Extender</td>
			<td style="width:455px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:301px;">355006</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Falcon 40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td style="width:455px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:301px;">352340</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:301px;">BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:301px;">B6420</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">LED LIGHT SOURCE &#8211; Black LED 385</td>
			<td style="width:455px;">Prizmatix Ltd.</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:301px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td style="width:455px;">Promega</td>
			<td style="width:301px;">V2111</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical control of a neuronal protein using a genetically encoded unnatural amino acid in neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

כדי גנטי לשלב UAA לתוך חלבון בנוירונים, הצעד החשוב הראשון הוא לעצב גן מתאים בונה למסור ולהביע גנים ביעילות בנוירונים. ישנם שלושה מרכיבים גנטיים עבור התאגדות UAA: (1) גן המטרה עם קודון עצירה ענבר TAG הציג באתר הנבחר עבור התאגדות UAA (2) tRNA מאונך להכיר קודון עצירה TAG מוטציה, ו (3) aminoacyl מאונך -tRNA synthetase לחייב את UAA על tRNA המאונך. כל רכיב צריך להיות מונע על ידי האמרגן המתאים. קלטות גנים שלוש אלה יכולים להיכלל פלסמיד אחד או מופרדות בכמה פלסמידים. כדי להביע PIRK בנוירונים, התמונה-reactive UAA CMN הוא שולב Kir2.1 באמצעות מאונך tRNA Leu CUA / CmnRS (synthetase CMN-tRNA) זוג התפתח להיות ספציפי עבור CMN 21,29. שאריות Cys169 של הגן Kir2.1 עובר מוטציה אל קודון עצירה ענבר TAG (Kir2.1-TAG), ואת חלבון פלואורסצנטי mCitrine הוא קיבע את הסופית- C של Kir2.1 לדמיין ביטוי PIRK בתרבות העצבית (איור 1). קבלת תרבות עצבית באיכות הטובה היא תנאי הכרחי ניסויי PIRK מוצלחים. יום לאחר לידה 1-4 גורי החולדה ספראג Dawley משמשים בדרך כלל עבור הכנת תרבות עצבית, עדיין עובר חולדה גם משמשים לעתים קרובות. כאשר מצופים על coverslips ב 24 גם צלחות ב 1.0-1.5 x 10 5 תאים / גם צפיפות, אפשר לראות עוד נוירונים בריאים מופרדים היטב עם לא יותר מדי microglia או פסולת אחרת (איור 2 א). יש נוירונים בריאים תהליכים נרחבים, ואת גופי תא (soma) הם שמנמנים (תרשים 2B). במובהק גלוי מבנה suborganelle הוא בדרך כלל סימן של תרבות הבריאה. תרבות עצבית יכולה להישמר במשך 2-3 שבועות ב 35 ° C ב 5% CO 2: חממת humidified אוויר 95%. Cפוספט alcium (Ca-P) transfection היא שיטת transfection עדינה מאוד מתאימה לתרבות העצבית רגישה. עם זאת, זה דורש דיוק וזהירות רבים כדי להשיג יעילות transfection גבוהה בנוירונים. פתרונות המניות צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, וערבבו לעשות חיץ BBS 2x ביום transfection. התאמת pH מדויקת היא מפתח כדי להשיג תוצאות מוצלחות reproducibly. הפתרון 2.5 M CaCl 2 צריך גם להיעשות טרי ביום transfection. כל המאגרים צריכים להיות מסוננים. יתר על כן, פלסמידים DNA הטריים עם טוהר גבוה ואיכות לשפר את התוצאות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ניתן לקבל מיני-הכין DNA טרי לא תרבות Escherichia coli מגודל (~ 12 שעות ב 37 ° C בחממה הרועדת). אחרי הכל המאגרים מוכנים, להביא את הפתרונים בשכונה בתרבית הרקמה ולהתכונן transfection. בעזרת מערבולת במהירות נמוכה, להתסיס פתרון transfection תוך ערבוב. מייד להוסיף הפתרון המעורב אל המ&quot;ק העצביlture, ולהביא את מנת התרבות בחזרה אל האינקובטור. עצור את transfection לאחר 45 דקות -1 שעה, ולהוסיף את תקשורת הצמיחה המקורית בחזרה לתרבות לאינקובטורים רציף. הנוירונים transfected ניתן דמיינו מ -6 שעות לאחר transfection מסתיימת (איור 3). בנוכחות CMN בתקשורת תרבות, PIRK מתבטא ונוירונים להביע PIRK ירוקים-ניאון בשל החלבון mCitrine התמזגו בטרמינל C-של PIRK (איור 3D). יש PIRK-להביע עצב פיזיולוגית בסיס נורמלי הם מסוגלים לירות פוטנציאל פעולה בתגובת זרמים מוזרקים (איור 4). עם זאת, הסדרה הזו של פוטנציאל פעולה מדוכאת מייד עם דופק אור קצר זרח אל התא (איור 4 א). כאשר 0.5 מ&quot;מ BaCl 2, מעכב ספציפי Kir2.1, מתווסף באמבטיה, הירי העצבי יתחדש אז, המציין כי דיכוי הקודם נבע הפעלת Kir2.1 ידי light (איור 4B). נוירונים מלאים untransfected אינם מגיבים לאור או Ba 2 + (האיור 4C, D). כדי להביע PIRK in vivo, פלסמידים DNA טהור מרוכז מאוד (2-5 מיקרוגרם / μl) צריך להיות מוכן. פלסמידים מסוימים המשמשים בניסויים אלה מוצגים איור 5 א. בנוסף זוג CUA / CmnRS tRNA Leu מאונך ואת הגן Kir2.1-TAG היעד, גן קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק עם מוטציה TAG (GFP-TAG) הוא גם שיתוף electroporated ככתב ניאון. איתור של הקרינה GFP המצביע על כך שיש מסירה מוצלחת של כל שלושת פלסמידים, מאז דיכוי TAG ב GFP ידרוש הן CUA tRNA Leu ואת CmnRS; התאגדות CMN ב-TAG GFP הייתי מציעה שילוב CMN ב Kir2.1-TAGas היטב, כי הגנים הן נמצאים באותו התא. שלושת המבנים הגן הם כל Injected לתוך החדר לרוחב של עוברי עכברים על E14.5 (איור 5 ב, פאנל משמאל). לאחר electroporation, להחזיר את העוברים אל חלל הבטן על מנת לאפשר את העוברים להמשך פיתוח. יומיים לאחר מכן, להזרים כ 2-5 CMN-עלא μl (500 מ&quot;מ) לצד electroporated או שני הצדדים של החדר לרוחב, באופן דומה כמו הזרקת DNA (איור 5 ב, פאנל באמצע). שוב, להחזיר את העוברים אל חלל הבטן עבור פיתוח מתמשך. עוברים ניתן לקצור על E17.5 הדמיה או מבחני אלקטרו. כצפוי, רק עם הזרקת CMN-עלא, תאים ירוקים ניאון הם נצפו הניאוקורטקס העכבר. תאים עם שתי קרינה אדומה וירוקה צריכים CMN שולבו-TAG Kir2.1 לעשות ערוצי PIRK (איור 6 א). הקלטת כל התא מן הפרוסה neocortical העוברית נעשית באופן דומה כפי שהיא נעשית על תרבות עצבית. הנוירונים פלואורסצנטי ירוק ואדום אין זרם פנימה ב negative מחזיק פוטנציאל, אבל דופק קצר של אור במהירות מפעיל את הזרם פנימה (איור 6). הזרם חסום לחלוטין על ידי הוספת Ba 2 +, המאשר כי הוא נוצר על ידי PIRK. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig1.jpg" /> איור 1: סט פלסמיד ביטוי PIRK לתרבות נוירון Scheme מראה עיצוב פלסמיד למופת לביטוי PIRK בתרבות העצבית.. פלסמיד למעלה מקודד הגן Kir2.1 (אפור) עם מוטציה בחומצה אמינית בודדת באתר C169 תחת ציטומגלווירוס האמרגן (CMV). C169 הוא מוטציה אל קודון עצירה ענבר TAG, שבו UAA CMN היה להיות משולב. גן Kir2.1 ואחריו גן mCitrine (ירוק). mCitrine הוא קיבע את מסוף C של הגן Kir2.1 לדמיין תאים המבטאים PIRK. פלסמיד התחתית מקודד CmnRS (ורוד), את synthetase הספציפי CMN, מונע על ידי אמרגן העכבר phosphoglycerate kinase-1 (mPGK). tRNA <sup<html> &gt; Leu CUA (כחול), את מאונך tRNA 21, בא לידי ביטוי גם הוא באותו פלסמיד מונע על ידי אמרגן H1, אבל בכיוון הפוך. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig2.jpg" /> איור 2: עכברוש בהיפוקמפוס תרבות עצבית עיקרית תמונות למופת מראות תרביות נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש בריא.. (א) תמונת DIC תרבות העצבית על 10 ימים במבחנה (DIV). נוירונים בוגרים כפי שהוא להסתעף דנדריטים אקסונים. תאי Microglia (תאים קטנים ועגולים ללא תהליכים) להתקיים אך לא להציף את התרבות. (ב) תמונת DIC מוגדלת של נוירונים בתרבית בריאים. תא עצב בריא מפגין גוף התא שמנמן (soma) והכריז דנדריטים / אקסונים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53818/53818fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> _content &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig3.jpg" /> איור 3:. הביטוי PIRK בנוירונים ראשוניים בתרבית דסק&quot;ש ותמונות הקרינה של נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש בתרבית במבחנה טרנספקציה עם בונה גנים מתואר באיור 1 לביטוי PIRK. כאשר CMN הוא לא הוסיף בתרבות לאחר transfection (A ו- B), אין פלואורסצנטי ירוק מזוהה מן הנוירונים. בנוכחות CMN (1 מ&quot;מ) בתקשורת הצמיחה, נוירונים transfected מסוגלים לבטא חלבונים באורך מלא PIRK-mCitrine, ובכך מראים קרינה ירוקה (C ו- D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53818/53818fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> .jpg &quot;/&gt; איור 4:. הפעלת אור PIRK גם מדכאת ירי מתוך נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש (א) פולס האור יחיד מדכא פעילות הנוירון בהיפוקמפוס להביע PIRK. עקבות מתח נציג נרשמות ברציפות נוכחית מהדקת. פעולת ירי פוטנציאל הם נובעים 20 רשות נוכחית הזרקה (I-צעד). אור חשיפה (385 ננומטר, 40 mW / cm 2, 1 שניות; מסומן בחץ) במהירות ובאופן מוחלט מדכא ירי עצבי. ירי משוחזר עם תאיים 500 מ&quot;מ BaCl 2, אשר מעכב באופן סלקטיבי ערוצי Kir2.1. (B) הסגול (UV) תאורה (385 ננומטר, 40 mW / cm 2, 6 שניות; מצוין עם תיבה צהובה) אינה משנה רגיש שליטה, נוירונים untransfected. פעולת ירי פוטנציאל הם נובעים 50 רשות נוכחית הזרקה (I-צעד). (C ו- D) לא תאורה UV ולא BaCl 2 (500 מ&quot;מ) משפיע רגישות של נוירונים שליטה. פעולה חזקהial הם נובעים 50 הזריקה הנוכחית PA (I-צעד). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig5.jpg" /> איור 5: פרוצדורות לביטוי PIRK ב הניאוקורטקס עכבר in vivo. (א) PIRK ביטוי פלסמיד להגדיר. פלסמיד למעלה: הפלסמיד עבור CmnRS מונע על ידי אמרגן CAG ו mCherry באמצעות אתר כניסה הריבוזום (IRES). הקרינה mCherry היה לבדוק את הביטוי המוצלח של CmnRS. פלסמיד התיכון: הפלסמיד עבור גן Kir2.1 יחד עם שלושה עותקים של tRNA Leu CUA, את tRNA המאונך עבור התאגדות CMN 21. פלסמיד תחתונה: הפלסמיד עבור TAG GFP_Y182. הגן על ה- GFP מהונדס עם קודון עצירת ענבר באתר Tyr182 מתירנית (TAG GFP_Y182) כדי לחזות התאגדות מוצלחת של CMN לתייג אתרים 21. (ב) קריקטורה shoהאגף בהליך ניסיוני לביטוי PIRK in vivo. בונה ג&#39;ין לביטוי PIRK מוזרקים לתוך הניאוקורטקס העכבר (E14.5) ו electroporated ברחם (פאנל משמאל). יומיים לאחר מכן, CMN-עלא מוזרק אל החדר בצד electroporated או בשני צידי אונות המוח (פאנל באמצע). ניתן לבצע הדמיה לחתוך assay אלקטרו על-E18.5 E17.5 (פאנל מימין). <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig6.jpg" /> איור 6: ביטוי PIRK ב הניאוקורטקס עכבר הפעלת אור. (א) תמונות הקרינה של נוירונים בקליפת המוח העוברי העכבר מראה את ההתאגדות של CMN לתוך GFP וחלבונים Kir2.1 in vivo. שלושת המבנים הגן באיור 5A הם electroporated ברחם. קרינת mCherry מדגימה ביטוי מוצלח של Synthe CMN הספציפיגן הבורסה, CmnRS. GFP הקרינה מזוהה רק עם הזרקת CMN-עלא (למטה), המציין ההתאגדות CMN ב TAG GFP ושילוב CMN סביר TAG Kir2.1. לכן, קרינה ירוקה ואדום מציינת ביטוי מוצלח של כל שלושת פלסמידים התאגדות CMN. (ב) עלילת IV של זרמים רשמו מעכברים נוירונים neocortical מראים הפעלת אור התלויה של PIRK. יומיים לאחר בונה הגן באיור 5A היו electroporated, CMN-עלא הוזרק ברחם; 12-48 שעות לאחר הזרקת CMN-עלא, פרוסות חריפות neocortical הוכנו מן העוברים. PIRK להביע נוירונים הפרוסים, זוהו על ידי שתי הקרינה האדומה וירוקה, נרשמים לפני (שחור) ואחרי (כחול) חשיפה לאור (385 ננומטר, 8 mW / 2 סנטימטר, 10 שניות לחשיפה רוויה). BaCl 2 (500 מ&quot;מ) מתווסף לאמת זרמים ספציפיים PIRK לאחר photoactivation (כתום).

Watch this Scientific Journal Video about Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons at JoVE.com

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

optical-control-neuronal-protein-using-genetically-encoded-unnatural

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.9K Views.  Tufts University. Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Video: Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

ההדמיה תאית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בstriatal האסטרוציטים מעכברים בוגרים באמצעות אינדיקטורים סידן מבחינה גנטית מקודדים

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...