Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. הכנת פתרונות ומשך מחט זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 25x של Tricaine (3-אמינו אתיל אסתר חומצה בנזואית, המכונה גם אתיל 3-aminobenzoate) בשעה 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב 20 מ&quot;מ טריס pH 8.8 ולהביא פתרון זה ב- pH 7. Aliquot ב -4 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C. הערה: Tricaine ההרדמה פועל באופן מועדף על תעלות נתרן מתח מגודרות עצביות ובכך חוסם שרירי עוויתות ותנועה 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של Tricaine בריכוז סופי של 0.17 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במדיום העובר E3. 7 הערה: הפוך את Tricaine פתרון עובדת מראש כמו ה- pH של פתרון זה נסחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את נקודת התכה נמוכה agarose לריכוז סופי של 1.5% בטווח הבינוני העובר E3 בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל על ידי חימום הפתרון במיקרוגל. תנו פתרון זה לאזן ל -42 - 45 ° C באחת באמבט מים או בחממה הספסל העליון. אם מכינים מנות גדולות עבור אנכיהדמית אור גיליון (שלב 4), לבצע 25 מיליליטר נוסף של 1% היתוך תקן agarose במדיום עובר E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זכוכית בורוסיליקט עם נימים נימה עם ממדים של 1.20 מ&quot;מ OD, מזהה 0.69 מ&quot;מ, אורך 10 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נימים נמשכים לסוג חולץ מחט חימום-נימה שמתואר בטבלה של ציוד ריאגנטים, השתמש את ההגדרות הבאות: חום 600, משיכת 120, מהירות 50, זמן 225, לחץ 500. עם זוג מלקחיים חדים, הפסקה המחט בעבר רק את הנקודה שבה זה מכופף ליצור מחט נקי וחד עבור orientating עוברים והסרת agarose עודף. אזמל מיקרו-כן, ניתן להשתמש כדי להסיר agarose עודף. </li></ol> Embedding 2. עוברים על הפוך או מיקרוסקופי Upright <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העוברים עד השלב המתאים במדיום העובר E3. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב נדרש, עובר dechorionate עם זוג מלקחיים חדים מתחת dissec המשקףמיקרוסקופ טינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים dechorionated עבור 5 דקות לפחות הפתרון עובד Tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון agarose מומסת מתקרר ל -45 מעלות צלזיוס, השתמש פיפטה זכוכית פסטר להעביר את העובר dechorionated ישירות לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל עם העברת מינימלי של מדיום E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר העובר יחד עם כ 1 מ&quot;ל של הרכבה בינונית ומוסיפים כ. 100 μl של הרכבה בינונית יחד עם העובר למעגל המרכזי של צלחת פטרי 35 מ&quot;מ עם תחתית זכוכית עם microwell 10 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל הרכבה בינונית שוקעת, להזיז את העובר עד קצה המעגל של agarose עם הזנב כלפי חוץ (איור 1 א). השתמש מחט הנימים לשמור על העובר בכיוון לרוחב הרצוי עד ג&#39;ל מוגדר לחלוטין. כדי פיתוח גוף התמונה האחורי, לטפל להתמצא העובר כמו לרוחב אוריינטציה ככל האפשר. לכן, לשמור על העובר בתפקיד זה על ידי adjustmen הזהירts עם המחט נימי. הערה: ניתן להוסיף עוברים מרובים כדי בצלחת גוברת בשלב זה, אם נדרש. אם זה המקרה, להעביר את נמוכה להמיס agarose לתוך המנה הראשונה ולהוסיף את העוברים למרכז הירידה agarose. לאחר מכן, דחף את העוברים אל הקצוות של הטבעת הזכוכית להתמצא לתוך המיקום הרצוי. עד שישה עוברים יכול להיות מותקן בדרך זו לפני agarose הופך הקרושה. </li></ol> הסרת 3. עודף Agarose סביב הגוף האחורי הערה: סעיף זה מתאר את ההליך שבאמצעותו agarose יוסר האזור שמסביב הגוף האחורי. במקרה של התארכות הגוף האחורי, חשוב להבטיח כי הזנב יכול לגדול-אאוט כרגיל. על ידי הסרת agarose לאחר שהעובר נכללה לחלוטין על ידי agarose, העובר ונותר מוקפת באזור הראש כמחצית שק החלמון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ירידת agarose קבעה, להציף את di פטריsh עם הפתרון עובד Tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ המשקפת לנתח עם בסיס מועבר-אור, להתאים את המיקום במראה זווית אור האירוע כזה כי הניגוד החזק מאפשר קיצוץ agarose להיראות בבירור במהלך כל הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע לחתוך 1 (איור 1), השתמש מחט נימי או-אזמל מיקרו לחתוך את אמצע הדרך agarose לאורך חלמון, מתוך עמדה רק האחורי לשדה הלב להרכיב את עמדת somite 5 (5 th somite הקדמי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את החתך הראשוני סמוך ללב להרכיב כמוצג, והדרך מלאה דרך agarose אל הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את נימי או מיקרו-אזמל עמוק בתוך agarose, וראיתי לאט ולמטה תוך מתחילים לעשות חתך ארוך על העובר כפי שמוצג באיור 1. גזור קרוב לעובר ככל האפשר ללא ניקוב העובר או חלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לבצע חתכים 2 ו -3 (איור 1 </strong&gt;), החל מעמדת נגד העובר ועם לחתוך הולך כל הדרך למטה אל הכוס תחתית צלחת. הפוך לחתוך 2 כך שהוא משיק 5 somites הראשון, המאפשר dorsalward מלא התגלגלות של הגוף האחורי. הפוך לחתוך 3 בזווית של 90 מעלות עם משטח החלמון החל HEARTFIELD. הערה: חיתוך agarose עד קצה עיגול זכוכית (כפי שמוצג באיור 1) עזרי בהסרת agarose כבלוק שלם (שלב 3.6). עם זאת, זה לא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בצומת של חתכים 1 ו -3, לעשות חתך אלכסוני איטי לקראת סוף לחתוך 2 תוך הרמת לאט כלפי מעלה על מנת לשחרר את הכיכר של agarose המקיפים את הגוף האחורי. הערות: במקרים מסוימים, זה ישוחרר בבלוק אחד בתום הניתוח בבת אחת. במקרים אחרים, זה עלול לקחת כמה ניסיונות דיס-Lodge כל agarose סביב העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מלקחיים חדים, להסיר את b וחלצהמנעולים של agarose מן המדיום העובר. כדי לסייע בתהליך זה, להעביר את חתיכות agarose אל דופן הכלי ולהשתמש קיר צלחת פטרי כתמיכה תוך הרמת את חתיכות agarose. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> איור 1: תרשימים של גדר קופצת שמה. (א) התרשים מראה את המיקום של העובר רכוב בתוך טבעת זכוכית במרכז צלחת פטרי. מימין זום של העובר עם כל חתך רצוף דרך הסובבים לראות agarose עם קווים אדומים dottted. (ב) עוברי הרכוב diagrammed לאור לרוחב הצגת קלות הגישה לשתי מטרות הפוכות וזקופות. (ג) digram דומה מראה כיצד עובר יכול להיות מותקן עבור קופצים להגדיר הדמית גיליון אור אנכית. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">אנא CL</a>איכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התכווצויות שרירים אינה חסומה לחלוטין בנקודה זו, להוסיף טיפות Tricaine מפתרון המניות של 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל, pH 7. </li></ol> 4. הרכבה של עוברים אנכיים אור גיליון מיקרוסקופי הערה: זוהי וריאציה על השיטה שתוארה לעיל המאפשרת הגישה של יעדים מרובים עבור הדמיה של דגימות ידי SPIM אנכית-חוקית. הרעיון מאחורי וריאציה זו הוא להרים המדגם גבוה במעט התחתונה של המנה, כדי לאפשר גישה קלה של שתי מטרות הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לדגום הרכבה, מעיל צלחת פטרי פלסטיק 100 מ&quot;מ עם agarose 1% בטווח הבינוני E3 עד לגובה של 5 מ&quot;מ ולאפשר להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של 1 מ&quot;ל agarose נקודת התכה נמוכה אל מרכז הצלחת ולאפשר להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים שבץ agarose נקודת התכה נמוכה כמו בסעיף 2. עם זאת, הפעם, להסיר את העובר מהצינור 50 מ&quot;לagarose של עם ירידה קטנה של פתרון (0.5 מ&quot;ל) ומקום טיפה קטנה זו על גבי 1 מ&quot;ל לרדת במרכז המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מחט הנימים למקם את העובר במרכז הטיפה הקטנה ולשמור הכיוון הנכון שלה עד מוגדר ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציף את המנה עם פתרון Tricaine עבודה להסיר את agarose העודף כאמור בסעיף 3 אבל בלי לחתוך דרך הכרית של 1% agarose הסטנדרטי. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

טכניקה זו מאפשרת הרכבה עוברת להישמר עדיין במהלך העברת המיקרוסקופ ושוב לטווח ארוך ניסויי הזמן לשגות הדמיה שמטרתה הבאה התארכות גוף אחורית בסקאלות אורך המרובה. יתר על כן, זה הוא תכליתי בכך שהיא מאפשרת הדמיה משני מיקרוסקופיה זקוף הפוך בחרו קופץ, וכן המלצה ניתנת למען איך זה יכול להיות מותאם נוסף כדי SPIM אנכית חוקית. שלב קריטי פרוטוקול זה הוא ההסרה הזהירה של agarose העודף סביב הגוף האחורי כי חשוב המאפשר התפתחות התקינה של מבנה זה. חשוב לטפל כאן לא לפגוע בעובר, במיוחד בעת הסרת agarose סביב החלק העליון של החלמון. בנוסף, יש להקפיד בעת ההסרה לחסום agarose לחתוך מרחבי העובר, כמו שלפעמים אפשר לאבד את העובר מן העובש במהלך תהליך זה. מסיבות אלה, זה הוא tha שיטה נמוכה תפוקהt אינו מתאים ההרכבה של עוברי דג זברה רבים בעת ובעונה אחת, בניגוד כבר שפורסם שיטות ניצול תבניות פלסטיק מודפס 3D. 8, 9 עם זאת, הם עוברים יציבים מאוד על ידי שיטת הרכבה זה ולכן יכולים להיות מועבר המיקרוסקופ הרבה יותר קל, לשמור את כיוון 3D שלהם ברחבי התארכות גוף אחורי. עוד צעד קריטי הוא הדיוק של האורינטציה לרוחב הראשונית של העובר, הימנעות מכל-אחורי אנטרו או הטיה dorso- גחון. כך או הטיה לא תמנע את החזון לרוחב של הארכת הגוף האחורי, המהווה את הזווית הנוחה ביותר מבט לניתוח נוסף. נטיית אנטרו-אחורי תהיה בתוצאת תוספת בגוף האחורי גדלה למעלה או למטה ביחס במישור האופקי, אשר יהווה את רכישת ערימות גבוהות ב z וכך זמן פג עם רזולוצית זמן נמוכה. שיטה זו היא versatile אפשרה הדמיה של שיעורי חלוקת התא עם השימוש של קו 5 Fucci, 10 וכן morphometric רב-סקלר מנתח. עם זאת 5, בהתחשב העקירה הכוללת הדרמטית של tailbud במהלך ההתארכות של ציר הגוף האחורי, רק יחסית מטרות בהגדלה נמוכות ניתן להשתמש כדי ללכוד את כל התהליך כמו שמוצגות באיור 2. הסיבה לכך היא כי תוצאות בהגדלה גבוהות יותר באזור של עניין לעזוב את שדה הראייה תוך 3 - 4 שעות של רכישה (וידאו איור 1). לכן, דרך אחת נוספת כדי לשפר את ההדמיה של tailbud היא להיות אלגוריתם מעקב אוטומטי שיכולים לעקוב אחר תנועת הכוללת של tailbud ולהתאים את x, y, z המיקום של הבמה מיקרוסקופ במהלך הרכישה. בהינתן היציבות המוגברת של העובר בכל הממדים הציריים עם שיטת ההרכבה המתוארת כאן, זה צריך להיות מקובלגישה כזו.

התארכות גוף האחורית היא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו העובר משתרע מהווה חלק גדול של ציר הגוף. זוהי דוגמא של תהליך מורכב המוךפו&quot;גנטי שהולך שבאמצעותו התנהגויות תאים מרובות לפעול בצורה מתואמת כדי ליצור את morphogenesis ברמה של רקמות פרט. דפורמציות רקמות הפרש אלה ולאחר מכן לפעול יחד כדי ליצור את ההתארכות של הגוף האחורי ברמת המבנה כולו. כדי להבין כיצד תהליכים אלה נשלטים ומתואמים במהלך פיתוח, אנחנו חייבים להיות מסוגלים לעקוב אחר התהליכים האלה בקני מידה מרובות (כלומר ברמה של מולקולות, תאים, אוכלוסיות תאים ורקמות) ולהתייחס זה ישירות morphogenesis של המבנה כולו . עוברי דג זברה הם אידיאליים עבור התארכות גוף אחורי הדמיה כמו השקיפות האופטית שלהם והגודל קטן מאפשרים ליישום הדמית אור פולשנית מתקרבים גם מתאים ליבהדמית דואר. 1 זה כבר שמעיד סדרת הפרסומים האחרונים כי שפכו אור על התפתחות גוף אחורית ברמה של מולקולות, 2 תאים בודדים, 3 והתנהגויות בין רקמות, 4 וכן ברמה של אוכלוסיית תא כולו איברים. 5 שיטות הדמיה מתקדמות כגון confocal, מיקרוסקופיה-פוטון רב מיקרוסקופיה תאורת מטוס סלקטיבית (SPIM) מאפשרות הדמיה לטווח הארוך של תהליכים התפתחותיים עם ירידת ההשפעה רעילה אור צילום לבן. טכניקות חזקות עבור ההרכבה של דגימות חיות נדרשות להשיג שלוש מטרות: 1) תמיכה מספקת כדי לשמור על דגימות בכיוון הנכון במהלך העברה המיקרוסקופ במהלך רכישה, 2) חופש מספיק תנועה של המדגם כדי לאפשר את התולדה של באזור הגוף האחורי מבלי להשפיע devel הרגילopment, ולבסוף 3) במידה מסוימת ב צדדי של שיטת ההרכבה לאפשר הדמיה על סט-אפ הדמיה המגוון. פרוטוקול זה מציג טכניקת הרכבת הדמיה בפיתוח של דג הזברה ד rerio. טכניקה זו כרוכה הרכבה עוברים כך אזורים שק ראש וחלמון כמעט כלולים כולו agarose, תוך השארת באזור הגוף האחורי להאריך ולהתפתח באופן תקין. ככזה, הוא גם בשיטה מתאימה ההדמיה לטווח הארוך של אזורים אחרים בגוף מתפתח כמו agarose מאפשר הדמיה על ידי שיטות הדמית אור רגילות. פרוטוקול זה מדגים הרכבה של עוברים בכיוון לרוחב, אם כי אפשר גם לעלות עוברים אוריינטציות alterative. עוד יציגו כיצד להתאים את השיטה עבור זקוף, פנימה ובמאונך setups מיקרוסקופ אור גליון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35-1.5-10-C</td>
			<td>35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td>&#160;Sutter&#160;</td>
			<td>BF 120-94-10</td>
			<td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>P-715</td>
			<td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps&#160;</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&#160;</td>
			<td>11252-30&#160;</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller&#160;</td>
			<td>Sutter&#160;</td>
			<td>P97</td>
			<td>Heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 Apo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

עוברי דג זברה להציע מערכת ניסיונית אידיאלית ללמוד תהליכים מורכבים המוךפו&quot;גנטי שהולכים בשל קלויות נגישות ושקיפות אופטית שלהם. בפרט, התארכות גוף האחורי הוא תהליך חיוני בהתפתחות עוברית שבאמצעותו דפורמציות רקמות מרובות לפעול יחד כדי לכוון את ההיווצרות של חלק גדול של ציר הגוף. על מנת להתבונן בתהליך זה על ידי הדמיה לטווח ארוכת זמן לשגות יש צורך לנצל טכניקת הרכבה המאפשרת תמיכה מספקת כדי לשמור על דגימות בכיוון הנכון במהלך העברת המיקרוסקופ והרכישה. בנוסף, ההרכבה חייבת גם לספק חופש מספיק תנועה של התולדה של אזור הגוף האחורי מבלי להשפיע ההתפתחות התקינה שלו. לבסוף, חייב להיות מידה מסוימת ב צדדי של שיטת ההרכבה לאפשר הדמיה על סט-אפ הדמיה המגוון. כאן, אנו מציגים טכניקת הרכבת הדמיה בפיתוח elongatio גוף האחוריn של דג הזברה ד rerio. טכניקה זו כרוכה הרכבה עוברת כך אזורי צק הראש והחלמון כמעט כלולים כולו agarose, ומותיר מחוץ לו באזור הגוף האחורי להאריך ולהתפתח באופן תקין. אנו נראים כיצד זה יכול להיות מותאם עבור קופצים להגדיר מיקרוסקופ זקוף, הפוך ואנכי אור גיליון. בעוד פרוטוקול זה מתמקד הרכבה עוברת הדמיה של הגוף האחורי, זה יכול בקלות להיות מותאם עבור הדמית החיה של היבטים רבים של פיתוח דג זברה.

הפרוטוקול שתואר לעיל פרטי שיטה תכליתית עבור ההרכבה של עוברי דג זברה עבור הדמית הזמן לשגות לטווח ארוך. דוגמא לכך היא שמוצגת באיור 2 א ו בסרטון אנימציה / וידאו איור 1. עוברים הוזרקו בשלב 1 תא עם mRNA המקודד את החלבון פלורסנט photoconvertible kikumeGR. בשלב 15 somite הם היו רכובים כמתואר לעיל צילמו במשך 12 שעות על מיקרוסקופ confocal הפוכה עם מטרה 10X. ערימות confocal וכתוצאה הוקרנו מקסימאלי שיוצגו כמוצג. סרט זה מראה בבירור כי הגוף האחורי מותר לנוע בחופשיות לכל אורך הסרט ומראה שינויים דומים במורפולוגיה כפי שניתן לראות עובר שהורשה להתפתח באופן חופשי של הסיסי שלהם בתנאי תרבות נורמלים. דוגמה נוספת מוצג 2B igure Fאנימציה / וידאו איור 2. כאן, עוברים הוזרקו בשלב 16 תאים עם שילוב של mRNAs קידוד היסטון חלבון 2B-mCherry (כי תוויות הגרעינים) ו eGFP: תיבת CAAX (כי תוויות ממברנות, לפרטים ראה התייחסות 5). הם היו צילמו אז על מיקרוסקופ multiphoton זקוף עם מטרה 25x טבילה במים כמו ניתח באיור 1 ב. תמונות צולמו על 3 שעות מתוך 10 בשלב somite כדי להמחיש התנהגויות הסלולר במהלך היווצרות tailbud. תאים יכולים לראות כדי יצירת בליטות פעילות ותנועות כיוונית כמו צורות tailbud כרגיל. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig2.jpg" /> איור 2: דוגמאות של הזמן לשגות הדמיה של התארכות אחורי גוף ב 10 X גדלים. (א) מסגרות רצופותשל סרט נציג מכסה את תהליך ההתארכות צירית. עובר מוצגים תצוגה לרוחב עם אחורי בצד ימין של התמונה. (ב) מסגרות רצופות של סרט בהגדלה גבוה מראה התנהגויות תאים בודדות במהלך היווצרות tailbud. עובר מוצגים תצוגה לרוחב עם אחורי בצד הימין. קווים מקווקווים להתוות את tailbud טביעה. קווים צבעוניים קטנים להיראות מסלולים של גרעינים לעקוב אחר תנועות תא יחידות. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="וידאו 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210video1.jpg" /> אנימציה / וידאו איור 1: סרט זמן לשגות של התארכות גוף האחורית של mRNA KikumeGR מוזרק עובר דג זברה על ידי מיקרוסקופי Confocal. עובר מוצג עם קדמי שמאלה פוסטרIOR ימינה. תמונות צולמו ב 10 מרווחי דקות בהגדלה 10X. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="וידאו 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210video2.jpg" /> אנימציה / וידאו איור 2: סרט זמן לשגות של התארכות אחורי גוף של עובר הגרעיני-mCherry ו ממברנה-GFP Labelled דג הזברה צלם ידי מיקרוסקופי שני פוטונים. העובר מוצג עם הקדמי בצד ימין ואת האחורי בצד שמאל. תמונות צולמו ב 2 מרווחי דקות בהגדלה 25x. קווים צבעוניים להציג מסלולים של תאים במשך עשרת זמן הצעדים האחרונים עבור כל תא מעקב. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development at JoVE.com

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Views.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Video: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...