אנו מודים משתתפי המחקר מיאמי WIHS על נכונותם להשתתף בעבודה זו. נתונים בכתב היד הזה היו שנאספו במסגרת פרויקט HIV Interagency של מיאמי נשים (WIHS). התכנים של פרסום זה הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב (NIH). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות ולימוד זיהום HIV Interagency לנשים (WIHS) [AI103397 U01 מספר מענק], המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכון הלאומי לבריאות [מספר מענק P30AI073961], המרכז הלאומי לקידום מדעי translational לבין המכון הלאומי לבריאות המיעוט ופערים הבריאות, המכון הלאומי לבריאות [מספר מענק UL1TR000460 ו 1KL2TR000461], המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, המכון הלאומי לבריאות [K23HD074489 מספר מענק].

פעילויות המחקר התקיים באוניברסיטת יחידת המחקר מיאמי HIV בשיתוף עם לחקר בין-HIV נשים מיאמי (WIHS) והמרכז מיאמי לאיידס מחקר (וכפר) המועצה לביקורת .Institutional (אוניברסיטת מיאמי מילר מבית הספר לרפואה) התקבל אישור מראש לגיוס וכל נהלים בנושא הערכה או מחקר. 1. אוסף דוגמאות האנדוצרוויקאלית מברשת הערה: משתתפים עברו בדיקת גינקולוגית מבוצעת על ידי MD המאומן או גינקולוג וגבייה לימפוציטים intraepithelial בוצעו תחת בחינת ספקולום ידי החדרת cytobrush. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפיינים משתתפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגייס משתתפי נשים בגילי 18 עד 45 שנים של גיל, פעילים מינית, לא בהריון ולא על תרופות מניעות או עם התקן תוך רחמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני בדיקת גינקולוגית, המשתתפים צריכים לעבור לקיחת דם 10 מ&quot;ל בירוק<html> vacutainers הפרין העליון עבור תא דם היקפיים mononuclear (PBMC) בידוד. כדי לשמש כביקורת לניתוח 9 intraepithelial האנדוצרוויקאלית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף של דגימות האנדוצרוויקאלית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס ספקולום סטרילי בגודל המתאים לנרתיק ללא שימון. השתמש במים חמים כדי להקל על הכניסה של ספקולום גזה סטרילי כדי לנקות את הריר. עמדת ספקולום מאפשרת להדמיה מלאה של מערכת ההפעלה ectocervix. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מברשת האנדוצרוויקאלית לתוך תעלת האנדוצרוויקאלית עד שרק הזיפים קרובים מצד גלויים. סובב עם כיוון השעון מברשת 360 °. מעבירים את המברשת לתוך צינור 15 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל של מדיום IMDM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר איסוף, במקום צינור המכיל cytobrush על הקרח. כדי להשיג כדאיות גבוהה של תאים intraepithelial שנאספו, לספק את cytobrush למעבדה תהליך בתוך 1 שעות. </li></ol></li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 2. האנדוצרוויקאלית עיבוד מדגם Cytobrush <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור וורטקס המכיל cytobrush האנדוצרוויקאלית החלת 4 משייכות קצרות (10 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור, המכיל cytobrush, במשך 10 דקות ב 250 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את cytobrush מהצינור (לא להפריע את הכדור בחלק התחתון של הצינור) ולהוסיף 1 מ&quot;ל של התקשורת IMDM ולמקם את הצינור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את cytobrush על מסננת תא 100 מ&quot;מ על החלק העליון של הצינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את cytobrush עם IMDM 20 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 250 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ותאי pelleted resuspend ב 1 מ&quot;ל IMDM ולשלב עם גלולה מחדש תלויה כבר המתואר 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי 10 או לספור את התאים באמצעות hemocytometer על ידי שילוב 10 μL של השעית התא עם 10 μL של צבע כחול trypan. בעדינות pipet למעלה ולמטה עשר פעמים כדי לערבב את התאים לצבוע. טען 10 μLשל התערובת לתוך הפתח של אחד משני תאי hemocytometer. לספור את כל התאים בחמשת תחומי הרשת. שמור ספירה נפרדת של תאי קיימא ושאינו קיימא. לקבוע את כדאיות התא באמצעות הנוסחא הבאה: תאי חי% = ללא קיימא תאים x 100 / תאים מספר תאים כוללים. קבע את ריכוז התא עוקב לכל מיליליטר (ואת המספר הכולל של תאים) באמצעות החישובים הבאים. תאים סה&quot;כ לכל מ&quot;ל = תאים הכולל x נספר (גורם לדילול / מספר מרובע נספר) x 10,000 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא תאים האנדוצרוויקאלית מבודדים באמצעות מדיום הקפאה המכיל 10% DMSO ו -90% FBS. </li></ol> 3. Cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות 1-3 x 10 5 תאים אנדוצרוויקאלי ב 100 חיץ μL FACS (PBS המכיל אלבומין בסרום שור 1% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μL / 10 6 חי / מת ניתן לתקן ערכת כתם Cell מלח צהובה ונוגדנים עבור סמני משטח בריכוזים המתוארים בטבלת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים למשך 30 דקות ב +4 ° C, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל חיץ FACS והתאים וצינורות צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 XG </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות תא גלולה ב 300 paraformaldehyde 1% μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שולט פיצוי באמצעות חרוזים ונוגדנים המשמשים מכתים ידי הוספת 100 μL של חיץ FACS וטיפה אחת של חרוזי הריכוז הזהה של הנוגדנים המשמשים מכתים מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת חרוזים ודוגמאות מוכתם על cytometer זרימה, מצויד 405 ננומטר, 488 ננומטר, ו 635 nm לייזרים. </li></ol> 4. בידוד תא האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד חרוז מגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות תא גלול אנדוצרוויקאלי (≤10 7 תאים בסך הכל), מתואר 2.6, ב 40 μL של החיץ הכלול בערכת microbead דלתא גמא TCR בהפניה של טבלת החומרים ריאגנטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל בהתאם להוראות ערכה עבור פרוטוקול מכתים שני שלבים: הראשון, שנינותדלתא גמא אנטי TCR h hapten-נוגדן והשני, עם אנטי hapten microbeads-FITC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 15 דקות ב 4-8 מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של חיץ צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות. למזוג supernatant על ידי היפוך הצינור, והקש יבש בעזרת פיסת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התא הגלול ב 500 μL של חיץ הניתן ולהכין בעמודה המגנטית על ידי צבת אותו מפריד מגנטי מתאים על פי הפרוטוקול של הספק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ההשעיה התא על עמודה ולאסוף תאים ללא תווית שעוברים ולשטוף טור 3x עם הכמות המתאימה של חיץ (500 μL). בצע שלבי כביסה ידי הוספת חיץ שלוש פעמים, בכל פעם פעם מאגר הטור ריק. אסוף בשפכים הכולל. זהו שבריר התא ללא תווית, שלילי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהווים את מפריד מגנטי פיפטה 1 מ&quot;ל של חיץ על הטור ומיד לשטוף את השבר עם התווית מגנטיתאד תאים על ידי החלת הבוכנה מסופקת עם הטור בתקיפות. הערה: תאי T דלתא גמא מבודד כבר מגואלות fluorescently לניתוח זרימה cytometric מאז microbeads מתויג מגנטית אנטי hapten הם מצומדות עם FITC צבע פלואורסצנטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיון תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיון תא, תאי האנדוצרוויקאלית תווית עם למות כדאיות ולוח נוגדן כמתואר בסעיף 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שערים אלקטרוניים על חי, CD45 + CD3 + ו דלתא גמא תאים חיוביים ולבצע מיון התא. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genital+tract+immune+milieu:+an+important+determinant+of+HIV+susceptibility+and+secondary+transmission.">The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission.</a> J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).</li><li>Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+early+infection+to+prevent+HIV-1+mucosal+transmission.">Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission.</a> Nature. 464, 217-223 (2010).</li><li>Hayday, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma][delta]+cells:+a+right+time+and+a+right+place+for+a+conserved+third+way+of+protection.">gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection.</a> Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).</li><li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+gamma/delta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection.">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).</li><li>Autran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+gamma/delta++lymphocyte+subsets+during+HIV+infection.">T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection.</a> Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).</li><li>Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+Cells+in+HIV+Disease:+Past,+Present,+and+Future.">gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future.</a> Front Immunol. 5, 687 (2014).</li><li>Hayday, A. C., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+immunity.">Barrier immunity.</a> Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).</li><li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes.">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).</li><li>Strbo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Intra-Epithelial+Endocervical+Gamma+Delta+(GD)+1+T+Cells+in+HIV-Infected+Women.">Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women.</a> AJRI. 75, 134-145 (2016).</li><li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+measurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells.">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).</li><li>Alcaide, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Vaginosis+Is+Associated+with+Loss+of+Gamma+Delta+T+Cells+in+the+Female+Reproductive+Tract+in+Women+in+the+Miami+Women+Interagency+HIV+Study+(WIHS):+A+Cross+Sectional+Study.">Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study.</a> PloS one. 11, e0153045 (2016).</li><li>Masson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+genital+tract+cytokine+signatures+of+sexually+transmitted+infections+and+bacterial+vaginosis+in+women+at+high+risk+of+HIV+infection:+a+cross-sectional+study.">Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study.</a> Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+(IL)-1,+IL-6,+and+IL-8+predict+mucosal+toxicity+of+vaginal+microbicidal+contraceptives.">Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives.</a> Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).</li><li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+isolation,+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples.">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> JoVE. , (2014).</li><li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials:+an+international+multi-site+study.">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, e85675 (2014).</li><li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells.">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).</li></ol>

מחברים אין עמותה מסחרית או אחרת שעלולים להציב ניגוד העניינים (למשל, בעלות על מניות תרופות, ייעוץ, חברות בועדה מייעצות, פטנטים רלוונטיים, או למימון מחקר).

הערכת הפגיעות ריריות בדרכי נשית תחתונות איברי מין היא מרכיב חיוני של מחקרים קליניים פונים סיכון רכישת HIV ושידור. בדרך כלל פגיעות FGT מפני הדבקה ב- HIV מוערכות על ידי מדידת מאפננים חיסוניים מסיסים הפרשות איברי מין (ציטוקינים, chemokines ופפטידים מיקרוביאלית) 12, 13. עם זאת, סמנים אלה מצביעים רק של דלקת בנרתיק, הם מושפעים מאירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים, ואינם מייצגים תמיד נזק הרירית ישיר. על מנת לשפר את הבנתנו כיצד גורמים ריריים להגביר את הסיכון של רכישת העברת HIV, סמנים תאיים של ניזק רירית צריכים להיות מפותחים. תאי GD intraepithelial T נמצאים FGT, intercalate בין תאי אפיתל, והם חשבו לתרום הומאוסטזיס וכן קו הגנה ראשון נגד אתגרים סביבתיים. יש תאי T אלוקים poten<html> TiAl להוות סמן ביולוגי נוסף כדי להעריך את פגיעות ריריות של FGT. בפרוטוקול זה, הוא הראה כיצד להכין לימפוציטים intraepithelial ממדגם cytobrush האדם האנדוצרוויקאלית והוא שולט בקלות. הנקודה הקריטית ביותר של תהליך זה היא לשמור על כדאיות התא על ידי עיבוד מהיר של המדגם וכן על ידי שמירה על התאים על הקרח במהלך ההליך כולו. תשואת התא תהיה תלויה טכניקת אוסף cytobrush, טיפול מיומנות, כמו גם את מצב זיהומיות (ההידבקות ב- HIV או זיהומים נגיפיים אחרים, חיידקים או זיהומים פטרייתיים). הקבוצה שלנו ואחרים פרסמו מחקרים שונים המתארים אוכלוסיות לימפוציטים שונות בדרכי אדם גניטלי 9, 14, 15. בידיים שלנו, מדגם cytobrush אנדוצרוויקאלי אחד יכול לספק 0.5-5 x 10 6 תאים עם הכדאיות 80-90%. לשם השוואה עם שיטת הבידוד הנפוצהclass = &quot;Xref&quot;&gt; 14, 15, בשיטה שלנו התשואה הכדאית ותא הוא גדל. שיטה זו מספקת חזק כלי יעיל ללמוד דלתא גמא האנדוצרוויקאלית intraepithelial לימפוציטים מסוג T ו- יכול לספק תובנות לגבי תאי חיסון אחרים הנודדים אל תא זה במהלך זיהום ו / או דלקת. תפקידיו של מוסד vivo הרכב הסלולר של רקמות ריריות הוא לעתים קרובות קשה לחקור באופן מקיף וכמותיים. טכניקות כגון אימונוהיסטוכימיה ותזרים cytometry מוגבלות על ידי הזמינות של נוגדנים חד שבטיים אנטיגן ספציפיים ועל ידי המספר הקטן של מדידות מקבילות שניתן לבצע על כל תא יחיד. מבחני תפוקה גבוהה מסורתיים, כגון מערכי ביטוי גנים, כאשר היא מבוצעת על רקמות כולו, לספק מידע על רמת ביטוי גנים ממוצעת, והוא יכול להיות מתואם בעקיפין רק שינויים כמותיים בתת אוכלוסיות הסלולר.מגבלות אלה הופכים במיוחד קשות להתגבר כאשר לומדים אוכלוסיות מיעוט, או אוכלוסיית התאים חסרות סמנים בלעדיים. על ידי שילוב של &quot;קרינה מופעלת מיון תא&quot; (FACS) ו &quot;בניתוח גנטי ביטוי תא בודד PCR&quot; אחד יכול לבצע ניתוח תעתיק תפוקה גבוהה של תאי T GD intraepithelial ב endocervix. שיטה זו מנצלת את היכולת של cytometers זרימה מודרני למיין תאים בודדים בודדים בקפדנות ובדייקנות, יחד עם שימוש בטכנולוגיות microfluidic כדי preform רגישות גבוהה PCR מרובב מן כמויות זעירות של mRNA, ובכך לאפשר ניתוח מקביל של הביטוי של עד 96 גנים עבור כל תא יחיד 16.

פיתחנו מתודולוגיה של שימוש בדגימות מברשת האנדוצרוויקאלית להעריך תאים GD T intraepithelial. התעלה האנדוצרוויקאלית מצופה בשכבה אחת של אפיתל עמודי. לימפוציטים intraepithelial מייצגים לימפוציטים חזית המתגוררים בתוך שכבת האפיתל שיכול ליזום תגובה חיסונית במהירות כשנתקלה 7 חיידקים פתוגניים, 8. הבנת האירועים אימונולוגיים של תא האנדוצרוויקאלית intraepithelial חשוב בעיצוב של אסטרטגיות אפקטיביות כדי למנוע זיהומים, כולל איידס. השיטה שלנו יכול להיות מיושם על דגימות האנדוצרוויקאלית אדם טרי שנאספו כמו גם תאים אנדוצרוויקאלי קפוא כדי להמשיך לחקור את התפקיד של תאי T GD intraepithelial בנשים עם זיהום HIV או בסיכון הידבקות ב- HIV. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לגלות אירועים אימונולוגיים רומן תא intraepithelial האנדוצרוויקאלית וכדי evaluatדואר GD תגובות תא T כסמן של פגיעות ריריות בנשים עם זיהום HIV. הפערים המשמעותיים בידע סביב חסינות FGT נובעים בחלקם הקושי לאסוף בהצלחה ועיבוד דגימות ריריות. יתר על כן, ההטרוגניות המורכבות של תאים חיסוניים ריריים, ואת הקשרים הפנימיים שלהם אחד עם השני, הם אתגרים מרכזיים לזיהוי מדידות רלוונטיות קליני המשקפים המדינה ואת היכולת של המערכת החיסונית. פתחנו שיטה להשיג תאים מטוהרים intraepithelial מאוד GD T שיכול להיות עוד יותר לנתח באמצעות טכנולוגיות מרובבות ביותר, תא בודד שעשויה להיות קריטי לזיהוי המנגנונים של חסינות FRT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytobrush Plus GT&#160;</td>
			<td style="width:147px;">(CareFusion, San Diego, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">IMDM,Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium&#160;</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">496178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS, Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen, Gibco</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen, Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies,</td>
			<td style="width:119px;">L349S9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fortessa flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraComp eBeads</td>
			<td style="width:147px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Milteny Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:119px;">130-050-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS column</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;">103-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS separator</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">4124</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and flow cytometric analysis of human endocervical gamma delta t cells

באיברי הרבייה הנקביים (FRT) הרירית מערכת החיסון משמש כקו ההגנה הראשון. להכיר טוב יותר את רירית איברי המין ולכן הוא חיוני להבנת פתוגניות של פתוגנים שונים כולל איידס. דלתא גמא (GD) ותאי T הם האבטיפוס של &quot;בלתי שגרתיים&quot; תאי T והם מייצגים קבוצה קטנה יחסית של תאי T מוגדר על ידי הביטוי שלהם של קולטני תאי T heterodimeric (TCRs) מורכב שרשראות גמא דלתא. זה שמבדיל אותם מתאי הקלסיים הרבה יותר טוב ידוע CD4 + T מסייע תאי CD8 + T ציטוטוקסיים המוגדרים על-ידי TCRs בטא-אלפא. תאי GD T לעתים קרובות להראות לוקליזציה רקמות ספציפיות ומועשרים ב האפיתל. תאי GD T לתזמר תגובה חיסונית דלקת, מעקב גידול, מחלות זיהומיות, אוטואימוניות. כאן, אנו מציגים שיטה לבודד reproducibly ולנתח לימפוציטים GD T האנדוצרוויקאלית האדם intraepithelial. אנו חהve דגימות cytobrush האנדוצרוויקאלית בשימוש מנשים שהשתתפו במחקר זיהום נשים בין-HIV (WIHS). יש ידע על אינטראקציות תאי GD T במהלך תנאים שבם יש עלבון הרירי בנרתיק יכול להיות מיושם על כל ניסוי קליני נוסף בו פגיעות ריריות הופנה, כולל הפיתוח בנוסף microbicides.In נרתיק, ידע על תגובות תא הרירי GD T פוטנציאל היישום של טיפול החיסוני מבוסס תאי GD T בטיפול במחלות זיהומיות.

לאחרונה, ניתחנו תאים GD T intraepithelial האנדוצרוויקאלית והיינו הראשון לדווח על הפסד של תאי T דלתא גמא אנדוצרוויקאלי בנשים הנגועים באיידס 9, 11. כאן אנו מתארים פרוטוקול לבודד ולנתח את המשנה של תאי T דלתא גמא האנדוצרוויקאלית. כפי שניתן לראות בתרשים 1, תאי GD T ניתן לאתר בקלות את דגימות תאי האנדוצרוויקאלית אדם. אוכלוסייה ייחודית של תאי V1 דלתא גמא אנדוצרוויקאלי (GD1) T תוארה באמצעות multiparametar cytometry זרימה המבוסס immunophenotyping (איור 1). אסטרטגית gating נציג המדגם האנדוצרוויקאלית נגוע ב- HIV מוצגת באיור 1. הניתוח בוצע על תאי האנדוצרוויקאלית הכולל על ידי קביעת שער אלקטרוני על פיזור קדימה / Side (איור 1 א) ואחריו tהוא הדרת כפילויות תא (איור 1B). תאי חיים הוגדרו על ידי הרחקה של תאים מתים באמצעות Live / Dead ניתן לתקן צהוב אמין כתם תאים מת (איור 1 ג). ניתוח של ביטוי CD45 בוצע על תאים מגודרים חיים (איור 1D), ואחריו הניתוח של ביטוי CD3 (האיור 1E). דלתא 1 גמא (GD1) או גמא דלתא 2 (GD2) תאים חיוביים הוגדרו subpopulation של CD3 + תאים המבטאים GD TCR (דלתא גמא TCR V1 או דלתא גמא TCR V2). יתר על כן, הוא אישר כי רק תאים CD3 + T לבטא דלתא גמא TCR מאז CD3 מגודרת - תאי T מחווים V1 דלתא גמא TCR או V2 דלתא. ניתוח פנוטיפי של מגודרת CD3 + GD1 + תאי גילה (איור 1G), כי רוב תאי GD1 (~ 74%) הם CD4 - CD8 -. במחקר הנוכחי, היתכנות של ניצול endoceדגימות מברשת rvical לתאי intraepithelial GD T מטוהרים באמצעות ברירה מגנטית חיובית הודגמו (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55038/55038fig1.jpg" /> איור 1: דלתא גמא (GD) תת-אוכלוסייה של תאי T ב רירית האנדוצרוויקאלית ונותחו על ידי cytometry הזרימה. בעקבות אסטרטגית gating שמשה אוכלוסיות תאי T האנדוצרוויקאלית מזוהות: (א) תאי cytobrush האנדוצרוויקאלית היו מגודרים בהתאם לגודל הגרעיניות (FSC, פיזור צד קדימה לעומת SSC, פיזור צד). (ב) כפילויות Cell נפסלו על ידי קביעת השערים האלקטרוניים-A FSC (אזור) לעומת SSC-W (רוחב). (ג) תאי חיים הם מגודרים על אוכלוסיית צבען שלילי הכדאיות. (ד) שער אלקטרוני נקבע על חי, תאים חיוביים CD45. (ה) שער אלקטרוני עבור תאים חיוביים CD45 נקבעה על תאים חיוביים CD3(F) TCRVD1 (GD1) ו TCRVD2 (GD2) ביטוי נותח על תאי CD3 +. (G) CD4 ו CD8 ביטוי נותח על תאים + GD1. (H) TCRVD1 וביטוי TCRVD2 נותח על תאים שלילי מגודרת CD3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55038/55038fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55038/55038fig2.jpg" /> איור 2: בידוד של תאי T דלתא גמא אנדוצרוויקאלי (GD) על ידי פרדה מגנטית חיובית. תדירות של תאי האנדוצרוויקאלית GD T אושרה לפני ואחרי פרדה מגנטית חיובית. תאים האנדוצרוויקאלית תויגו הראשון עם הנוגדן דלתא גמא אנטי TCR ולאחר מכן עם fluorescently מוכתם אנטי hapten microbeads-FITC. אחוז תאים + T TCR GD נמסר לפני ואחרי מטרהפרדת agnetic. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55038/55038fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells at JoVE.com

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical-gamma-delta-t

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.7K Views.  Miller School of Medicine, University of Miami. We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Video: Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...