The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.

<ol>
	<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+A+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+recombinant+proteins+fused+to+calmodulin+or+to+calmodulin-binding+peptides.">Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides.</a> Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).</li><li>Braisted, A. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+a+binding+domain+from+protein+A.">Minimizing a binding domain from protein A.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).</li><li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+etch+virus+protease:+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency.">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li><li>Nallamsetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+site-specific+processing+of+fusion+proteins+by+tobacco+vein+mottling+virus+protease+in+vivo+and+in+vitro.">Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro.</a> Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Howson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction,+verification+and+experimental+use+of+two+epitope-tagged+collections+of+budding+yeast+strains.">Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains.</a> Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).</li><li>Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells.</a> Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).</li><li>Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+partners+of+acyl+carrier+protein+detected+in+Escherichia+coli+by+tandem+affinity+purification.">New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification.</a> FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).</li><li>Tharun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+analysis+of+the+decapping+activator+Lsm1p-7p-Pat1p+complex+from+yeast.">Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast.</a> Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).</li><li>Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+method:+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification.">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy.">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Gottschalk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+U1+snRNP+reveals+five+novel+proteins.">A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins.</a> RNA. 4 (4), 374-393 (1998).</li><li>Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+proteins+of+the+yeast+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+by+mass+spectrometry.">Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).</li><li>Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+purification+of+a+stable+form+of+recombinant+tobacco+etch+virus+protease.">Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease.</a> Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה TAP מנצל שני תגים לאזן צורך חזק וסלקטיבי מחייב שרף זיקה עם רצון לשמור כולה במזג אוויר פתרון פיזיולוגי. איזון זה משמש כדי לשמר אינטראקציה יציבה (ים) של החלבון מתויג עם אינטראקצית גורם (ים) לאפיון שלאחר טיהור. בנוסף, TAP הפרט מתויג ORFs זמין ממקור מסחרי, כך שאף אחד יכול להשיג כל זן שמרים עם חלבון מתויג לכל מורכבות שמרים. שמירה על שלמות קומפלקס ואת הזמינות של משאבים כדי לבדוק שימוש של יחידות משנת חלבון מתויגות שונות במתחם לטיהור שני יתרונות עבור ניצול שיטת TAP לטיהור קומפלקס ילידים. עם זאת, פרוטוקול שיטת TAP המקורי לא המציא כדי להבטיח כי מטוהרי המתחם בעלי רכב מבני הומוגנית. שיטת TAP ולכן שונתה, כמפורט לעיל, כדי להשיג מטרה זו. שׁוֹנִיםשלבים בשיטת TAP הוערכו להקים את הגישה האופטימלית ותנאים לטהר הלחנה ומורכבת הומוגנית מבני. צעד קריטי בשלב מוקדם הוא תמוגה התא. שלב זה דורש איזון בין הרצון של אחד עבור תשואה גבוהה ובכך תמוגה מקסימלית, בעוד הם מבטיחים מורכב המתקבל הוא באיכות גבוהה, כלומר, הומוגנית. גישות שונות בתאי שמרים lysing נחקרו, לרבות באמצעות א-מקצף חרוז, מעבד נוזל טהור גבוהה, ואת טחנת הכדור. שימוש מטחנת הקפה היקר פחות היה פחות יעיל מאשר השיטות החלופיות (40 - 60% תמוגה), אבל במתחם מבודד ומטוהר הופיע monodisperse בעוד מספר הגישות הללו נראים טוהר מידות חלקיקים לטרוד או לגרום מידה מסוימת של צבירה. בסופו של דבר, מספר משמעותי של תאים לא היו lysed כדי להבטיח מורכבות באיכות גבוהה הושג. בעוד 40 - 60% תמוגה הוא אידיאלי עבור snRNP שמרים U1, אופטימיזציה הוא הציע בעת החלת פרוטוקול זה לחבר<html> מורכבים ביולוגיים חדשים. זה היה קריטי כדי לזהות את השלבים בשיטה שיכול לזרז טיהור על מנת להבטיח כי שלמות מורכבת לא נפגעה על ידי פרוטאזות הסלולר, דיסוציאציה למקטע כתוצאה מהדילול, והאריך דגירה על 18 מעלות צלזיוס במהלך מחשוף פרוטאז TEV. בצעד אחד פשוט להשיג זמן טיהור יעילה היה להבטיח כי שומנים לא לשאת מעל מן ההבהרה lysate מוקדם, מאז שומנים לעכב זרימה במהלך טיהור הכביד. צעדים אחרים כלל זיהוי איזון מיטבי של גודל / מידות שרף ועמודה כמות להשיג טיהור יעיל קצב זרימה מקסימלית. שלב קריטי במיוחד היה כדי לקצר את הזמן של על מחשוף טור ידי פרוטאז TEV. הפרוטאז TEV בשימוש היה מטוהר בבית כדי לוודא שהוא היה פרוטאז / nuclease חופשית בריכוז גבוה 17. כמויות משמעותיות של פרוטאז TEV שימשו להשיג מחשוף להשלים בתוך פחות משעה. ontent &quot;&gt; בשנת proteolysis purifications TAP הראשונית נצפה. Proteolysis במהלך הטיהור יכולה להיות מוגבל על ידי עובד ביעילות, הוספת סוללה של מעכבים, ולרבות שטיפות מלח גבוהות הטיהור. מגוון רחב של מעכבי פרוטאז שסופקו לעומת המחצית הראשונה של הטיהור שיפר מאוד את היציבות של TAP מתויג חלבון ומורכב. בנוסף, proteolysis היה ממוזער על ידי הגדלת ריכוז חד ערכי של 300 עד 500 מ&quot;מ במהלך תמוגה התא וצעדים IgG של טיהור. אפילו עם השינויים שצוינו לעיל שיטת TAP, רצופים eluted שברי הנחה של שרף זיקת CBP מגוונות תואר ההומוגניות הלחנה. לפיכך, איגום סלקטיבית של שברים משלב כרומטוגרפיה השני, CBP, היא מוצדקת. היבט של שיטת TAP שקבל דגש מיוחד היה את החשיבות של הניקוי שאינו יוני NP-40 טיהור מורכבת בריכוז מעל שלה CMC. הנוכחות של NP-40 בריכוז של 0.08% ומעלה היתה השפעה מועילה הכוללת על שלמות מורכבת לבין התשואה הסופית. ההשפעה החיובית לכאורה (הים) של NP-40 עשויה להיות בין שאר כתוצאה לצמצום אינטראקציות הלא ספציפיות בין שרף ואת המורכבות. בעוד NP-40 נראים כמי שיש לו השפעה חיובית במהלך הטיהור, שאפשר יהיה להסירו טיהור פוסט מבלי לגרום צבירה מורכבת. לבסוף, קריטי אופטימיזציה של שיטת TAP ללימוד מבני היו כמה מבחני משלימה שבה להעריך את היושרה והומוגניות של המתחם. פיזור אור אלה כללו, SDS ו עמוד יליד נחקר באמצעות נוגדן TAP ידי כתם המערבי ו / או מוכתמים עם צבעי ניאון, כמו גם במיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי. השינויים שבוצעו בשיטת TAP המפורטים כאן, ניב מורכבים הומוגנית על כמויות מספיקות עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. שינויים נוספים עשויים צריכות להתבצע לשיטת TAP עבור מתחמי אחרים, ובפרט להרתיעmination לחשיבות NP-40. לסיכום, שיטת טיהור TAP ניתן להשתמש בם כדי לטהר מתחמי macromolecular בהצלחה ממקור איקריוטיים באיכות מתאימה למחקר מבני. הקמנו גישה מתאימה טיהור של ס cerevisiae U1 snRNP ופרטי הצעדים שננקטו, כמו גם את הרציונל רב של שינויים אלה. עבור מתחמי אחרים, אנו ממליצים כי החוקר דומה לחקור את שלבי הפרוטוקול, אשר עשוי להניב כמויות ואיכות מורכבות נאותות. הצעדים שיש לבחון כוללים תמוגה התא, מלח וסוג כתוסף וריכוזי כולל חומרי ניקוי, ורגישות של המתחם כדי EGTA סידן ומתכת chelator. יתר על כן, קיימת חשיבות ראשונה במעלה מחקרים ארוכי טווח שמכלול אפשר להקפיא מופשר ללא מבנה מביך. חשוב לציין, צריך אחד כמה דרכים חלופיות כדי assay את המבנה של המתחם במהלך ובעקבות טיהור. ילידnd עמוד SDS, א.מ. כתמים שלילי, ופיזור האור שירתו אותנו נאמן בחקירה שלנו מהי הדרך הטובה ביותר לטהר קומפלקס הומוגנית בשיטת TAP.

תהליכים תאיים גדולים רבים מבוצעים על ידי קומפלקסי חלבונים גדולים החלבון-RNA 1. צוואר בקבוק משמעותי לעריכת מחקרי biophysical והמבניים של קומפלקסים כאלה הוא מקבל אותם באיכות מתאימה (כלומר, הומוגניות) ותמורת ריכוז מתאים. בידוד קומפלקס ממקור ילידים יש יתרונות רבים, כולל שמירת שינויים שלאחר תעתיק ו / או translational רלוונטיים של יחידות משנה וביטוח הרכבה מורכבת ראויה. עם זאת, מתחמי הסלולר גדולים הם בדרך כלל נוכח בתא לעבר מספר נמוך עותק ואת הטיהור חייבת להיות יעילה להתרחש בתנאים פיסיולוגיים ליד מנת לשמור על שלמות מורכבת נשמרה. טיהור קומפלקס ממקור איקריוטיים מאתגרת במיוחד ולא יכול להיות כלכלי מונע. לכן, אסטרטגיות או שיטות שאינן יעילים להניב מורכבים הומוגנית הן מאוד רצויות. אסטרטגיה כי כברמוצלח לטיהור מתחמי יליד מתאי איקריוטיים לאפיון הראשוני שלהם הוא טיהור זיקת טנדם 2,3 השיטה (TAP). שיטת TAP בתחילה תוכננה כדי לטהר חלבון יליד מן שמרי ניצנים (cerevisiae ס) בקומפלקס עם אינטראקצית גורם (ים) 2. שיטת TAP מנוצלת שני תגים, כל תג התמזג במקביל לאותו רצף גן מקודדי חלבונים. התגים נבחרו כדי לאזן צורך חזק וסלקטיבי מחייב שרף זיקה עם רצון לשמור כולה במזג אוויר פתרון פיזיולוגי. איזון זה משמש כדי לשמר אינטראקציה יציבה (ים) של החלבון מתויג עם אינטראקצית גורם (ים) לאפיון שלאחר טיהור. תג TAP משולב genomically הוצב בסוף (C-terminal) של גן מקודדי חלבונים וכלל רצף קידוד calmodulin מחייב פפטיד (CBP) ואחריו חלבון - תוספת של קצת יותר מ -20 kDa אל מתויג חֶלְבּוֹן. CBP הוא קצר, 26 חומצות אמינו, ומוכר על ידי ~ 17 kDa חלבון calmodulin (CAM) בנוכחות של סידן עם K D בסדר גודל של 10 -9 M 4. תג החלבון גדול, מורכב משתי חזרות של 58 שאריות עם מקשר קצר בין החזרות. כל חוזרות חומצה 58 אמינו הוא מוכר על ידי אימונוגלובולין G (IgG) עם -8 M 5 10 K D ~. בין שני אלה תגים התאגד אתר הכרת פרוטאז TEV, גידול endopeptidase מנגיף הטבק Etch 6,7. כמו באיור 1, בשלב זיקה הראשון של שיטת TAP מתויג חלבון מאוגד שרף IgG דרך א חלבון החלבון מתויג הוא eluted ידי על מחשוף טור על תוספת של פרוטאז TEV, אתר ספציפי ביקוע בין את שני התגים. זהו צעד הכרחי כאינטראקציה של IgG ו- A החלבון הוא חזק מאוד והוא יכול להיות רק מוטרד כראוי בתנאי פתרון denaturing. בהעדר Protein תג, החלבון הוא כבול שרף CAM בנוכחות סידן eluted משרף זה עם תוספת של EGTA chelator מתכת יון (חומצה tetraacetic אתילן גליקול) (איור 1). זמן קצר לאחר כניסתה של שיטת TAP, היא שימשה במחקר בקנה מידה גדול כדי ליצור &quot;מפה&quot; של יחסי הגומלין המורכבים ב ס cerevisiae 8. חשוב לציין, כתוצאה ממאמץ זה המסגרת כולו שמר-TAP Tagged להרחיב קריאה (ORF) ספרייה וכן TAP פרט מתויג ORFs 9 זמינים ממקור מסחרי. לכן, אפשר להשיג כל זן שמרים עם חלבון מתויג לכל מורכבות שמרים. השיטה TAP גם דירבן שינויים או וריאציות של תג TAP, כולל: השימוש בו לטיהור מתחמי מ איקריוטיים אחרים, כמו גם תאים חיידקיים 10,11; העיצוב של &quot;תג לפצל&quot;, שבה החלבון ו CBP מונחים על חלבונים שונים 12; ואת taGS השתנה, כדי להתאים את הצורך של החוקר, כגון רגישות של המתחם כדי Ca 2 + או EGTA 13. ההתקדמות שחלה באחרונה בשני המכשור ומתודולוגיה הובילו להתקדמות משמעותית ביישום של מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) לקביעת מבנה, שהובילו גבוהה, ליד תמונות ברזולוציה אטומית של מתחמי macromolecular 14. החלטת ההשגה של קומפלקס א&quot;מ, לעומת זאת, נותרת מותנית באיכות של המתחם נחקר. מחקר זה נצל את גישת תג TAP לטהר מ ס cerevisiae מספר U1 snRNP, א-למקטע 18 (~ 0.8 מד&quot;א) מורכב ribonucleoprotein נמוך עותק מספר כי הוא חלק 15,16 הספלייסוזום. מספר הצעדים ננקט כדי לטהר מורכב זה כזה שזה הומוגנית של ריכוז נאות. בעיות פוטנציאליות נתקלו בשלבים שונים של הטיהור מתוארות ואסטרטגיות נלקחו להתגבר challenges הדגיש. לפי הערכה ואופטימיזציה צעדים בזהירות הטיהור, U1 snRNP מטוהר הוא באיכות ובבית בכמות שנכנסה כתם שלילי אלקטרוני cryo מיקרוסקופיה (cryo-EM) מחקרים. פרוטוקול שיטת TAP אופטימיזציה עבור טיהור של מתחמי מקורית עבור מחקרים מבניים מתואר במסמך זה.

<table><tbody><tr><td>S. cerevisiae TAP tagged strain</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3&amp;Delta;1, leu2&amp;Delta;0, met15&amp;Delta;0, ura3&amp;Delta;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Coffee grinder</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Used for cell lysis</td></tr><tr><td>Hemocytometer, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Used to assess cell lysis</td></tr><tr><td>JA 9.100 centrifuge rotor&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to harvest the yeast cells</td></tr><tr><td>JA 20 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material</td></tr><tr><td>Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to further clear the soluble cell extract</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Temperature controlled shaker</td></tr><tr><td>Novex gel system</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG resin</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 fast flow</td></tr><tr><td>Calmodulin resin</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Affinity resin</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, mini tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, large tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Dissolved in isopropanol</td></tr><tr><td>2 ml Bio-spin column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7326008</td><td>Used to pack and wash the Calmodulin resin</td></tr><tr><td>10 ml poly-prep column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Used to pack and wash the IgG resin</td></tr><tr><td>Precast native PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>NativeMark protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 &amp;mu;l for a silver stained gel and 5 &amp;mu;l for a SYPRO Ruby stained gel</td></tr><tr><td>Precast SDS PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Unstained protein standard used for Western blotting</td></tr><tr><td>SDS running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td></tr><tr><td>TAP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Primary antibody against CBP tag</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dialaysis units</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td></tr><tr><td>Centrifugal filter units, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td></tr><tr><td>Detergent absorbing beads</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 absorbants</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm</td></tr><tr><td>Copper grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method

גישות טיהור זיקה הצליחו לבודד מתחמי יליד לאפיון proteomic. ההטרוגניות מבנית ומידה של ההטרוגניות הלחנה של קומפלקס בדרך כלל לא לעכב את ההתקדמות בביצוע מחקרים כאלה. לעומת זאת, קומפלקס המיועד אפיון מבניים צריך להיטהר בתוך מדינה שהיא גם בעלי הרכב הומוגני מבחינה מבנית כמו גם בריכוז גבוה מהנדרש עבור חקר החלבונים. לאחרונה, חלה התקדמות משמעותית ביישום של מיקרוסקופיה אלקטרונית לקביעת מבנה של קומפלקסי macromolecular גדולים. זה הגביר עניין גישות לטהר מתחמי יליד באיכות מספקת וכמות לקביעה מבנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. טיהור זיקה טנדם (TAP) השיטה בצורה מיטבית כדי לחלץ ולטהר 18-למקטע, ~ 0.8 הרכבה ribonucleoprotein מד&quot;א שמרים ניצני (שמר האפייה) </em&gt; מתאים כתם שלילי מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים. במסמך זה מפורט את השינויים שבוצעו בשיטת TAP, רציונל ביצוע שינויים אלה, ואת הגישות שננקטו כדי assay קומפלקס בעלי רכב המבני הומוגנית.

שיטת TAP שונה שמשה לטהר מ ס cerevisiae מספר U1 snRNP, תסביך ribonucleoprotein 18-למקטע. טיהור TAP ראשונית של המתחם בעקבות 2,3 הפרוטוקול שפורסם ניב קומפלקס שהופיע הטרוגנית, נודדות כמו שלוש להקות על כסף מוכתמות ג&#39;ל polyacrylamide ילידים (איור 2 א). סבבים רבים של אופטימיזציה של שיטת TAP, ניב מקומפלקס הגר בעיקר כלהקה יחידה על ג&#39;ל יליד מעיד על הרכבה הומוגנית יותר (איור 2 א). באמצעות צבעי ניאון להכתים עבור חלבון וגם חומצות גרעין, נקבע כי המתחם המטוהר היה שניהם biopolymers הנוכחי (תרשים 2B). המתחם מטוהרים גם נותח על ידי עמוד SDS ו המערבי סופג באמצעות נוגדן תג TAP (איור 3 א). בקנה אחד עם נתיve תוצאה ג&#39;ל, במתחם מטוהרים לפי הפרוטוקול שפורסם הציג proteolysis של TAP מתויג חלבון (Snu71). כמות proteolysis, לעומת זאת, צומצם משמעותית עם שינויים של השיטה TAP. כמעט כל שבע עשרה חלבונים במתחם U1 snRNP נפתרו על ידי עמוד SDS ו זיהה בוודאות על ידי ספקטרומטריית מסה MALDI (איור 3 ב). כמו גם יליד עמוד SDS, איכות מורכבת הוערכה בשלבים שונים של הטיהור על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הכתמים שלילי (איור 4). חלקיקי monodispersed שנצפו איור 4 א &#39;וב&#39; אך נעדרו מן 4C הם דוגמאות מדגם טוב ללימוד מבני. שיטת ניתוח זה סיפק תובנה קריטית לגבי ההשפעה של שינויים בשיטת TAP. שיטת TAP קוראה להכללת הניקוי שאינו היוני NP-40 ו בכל קונצרט כלשהוentration מעל זה של ריכוז micelle הביקורתי שלה (CMC). על חוסנו של השיטות להערכת האיכות המורכבת שתואר בפרוטוקול מודגם היטב על ידי ניסוי שבו גליצרול zwitterionic הפעיל שטח הבחורים, או שום דו-ממס החליף עבור NP-40 בכל המאגרים (איור 5). לפי דף יליד א.מ. השלילי, U1 snRNP מופיע ביותר הומוגנית ויציבת NP-40 עם ירידת יציבות מ בחורים כדי גליצרול ללא שיתוף ממס הוסיף. זה יכול להיות כי snRNP שמרים U1 יש פן הידרופובי ואת הנוכחות של צבירה מונע NP-40 על ידי ציפוי פני שטח זה. למרבה הצער, NP-40 לא ניתן להסיר על ידי דיאליזה וריכוז המתחם יהיה אז לרכז את NP-40. בעוד NP-40 הגבוהים לא נראו לטרוד את המורכבות, זה לא להשפיע לרעה על הקפאת החלקיק בקרח זגוגי עבור cryo-EM אגרגטים micelle הגדולים הדמוי נצפו. חרוזים קליטים דטרגנט שמשו בהצלחת rסר רוב NP-40 מן המדגם U1 snRNP מבלי שייראה כאילו היא להשפיע על מבנה מורכב. בעקבות הטיהור של המתחם בשינויים המפורטים בפרוטוקול, מתחם מתאים הוא כתם שלילי קריו-EM הושג, כפי שמעיד תמונות של הדשא של חלקיקים וממוצעים בכיתת נציג ייחודי (איור 6). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה כללית של טיהור טנדם זיקה (TAP) שיטה. (א) סכמטי של שיטת TAP שני שלבים. קומפלקס של עניין (אפור) כולל TAP מתויג למקטע (שחור; U1 snRNP למקטע Snu71) התמזגו genomically עם רצף מורכב של פפטיד כריכה calmodulin (CBP, ירוק), אתר הכרה הפרוטאז אתר ספציפי TEV (כחול), ושני IgG מחייב אזורים של חלבון (Pr<html> , אדום). בשלב 1, lysate תא מודגרות עם שרף IgG ואת המורכבות נשמרות באמצעות האינטראקציה שלה עם חלבון רצף. המתחם הוא שוחרר מן השרף ידי מחשוף בתיווך TEV. בשלב 2, המתחם הוא מודגרות עם שרף calmodulin, תגובה תלויה Ca 2 +. המתחם הוא שוחרר באמצעות תוספת של EGTA chelator Ca 2+. (ב) כתם המערבי בעקבות TAP מתויג חלבון דרך השלבים לטיהור שמודגם (א). נלקחו דגימות של lysate התא, לאחר שלב 1, ואחרי שלב 2 של שיטה TAP. החלבון תגובתי שנצפתה lysate תא נודד מהר אחרי שלב 1, לאחר מחשוף TEV פרוטאז ובכך אובדן של חלבון רצף. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יור 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,389 / 54389fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. אופטימיזציה של שיטת TAP. (א) כסף מוכתם ג&#39;ל יליד מתחמי מטוהרים TAP. עמוד יליד: תקן חלבון (מסלול 1); מורכב מטוהרים פי שיטת 3 TAP המקורי (מסלול 2), שלוש להקות ציין (ראשי חץ); שלושה elutions רצופים מאותו טיהור TAP הבא שינויי חיץ, שתי להקות ציין (ראשי חץ) (נתיבים 3 - 5); שינויים נוספים בשיטת TAP, מניב להקה מורכבת אחת בעיקר נודד ב ~ 800 kDa (מסלול 6). (ב) ניתוח של רכב קומפלקס מטוהר על ידי צביעת נתיב ג&#39;ל יחיד עם חלבון וגם כתמי תגובתי RNA. עמוד יליד: תקן חלבון (מסלול 1) מוכתם בכתם פלורסנט חלבון; מורכבות צילמו עם כתם פלורסנט חלבון (מסלול 2), שתי להקות נצפו; שביל אותו בנתיב 2, עכשיו צלם עם כתם פלורסנט חומצות גרעין (מסלול 3), שתי להקות נצפו; ניאון האות לאורךשכבה של מורכבות מוכתמות במסלולים 2 ו -3 (מסלול 4). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig3.jpg" /> איור 3. אופטימיזציה של שיטת TAP. (א) ניתוח כתם המערבי של שיפור איכות מורכבת, TAP הבא מתויג למקטע Snu71 ומשש עם נוגדן α-TAP. כמה להקות proteolyzed גלויות בתחילה (מסלול 1) אבל שיפורים להפחית את כמות להקות נמוכות משמעותי (נתיבים 2 ו -3). (ב) ג&#39;ל SDS נציג מוכתם בכתם ג&#39;ל חלבון פלואורסצנטי. ג&#39;ל פותר 12 של 17 יחידות משנת החלבון של המתחם. זהות חלבון הלהקות הוקמה על ידי ספקטרומטריית מסה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג larg</a>גרסה אה של נתון זה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig4.jpg" /> איכות איור 4. לדוגמא בשלבים בשיטת TAP מוערכת על ידי שלילי כתם מיקרוסקופי אלקטרוני הערכה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הכתמים שלילי של אחרי מורכבים:. (א) שלב st 1 של TAP; (ב) שלב 2 nd של TAP; (ג ) מורכבות ערער. סרגל קנה מידה, 125 ננומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig5.jpg" /> השפעת איור 5. על איכות מדגם של תוספות הווה חוצצי שיטת TAP Lanes 1 -. 4 הם הארבעה elutions הראשון של השלב האחרון או 2 nd של טיהור TAP של גomplex מטוהר בנוכחות: (א) phenoxypolyethoxylethanol nonyl הניקוי שאינו יוני (NP-40), ונותח על ידי עמוד ילידים (עליון) ו א.מ. כתמים שליליים (למטה); (ב) חומר ניקוי zwitterionic 3 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (פרקים), ונותח על ידי עמוד ילידים (עליונה) ואת הכתם שלילי EM (למטה); (ג) גליצרול, ונותח על ידי עמוד ילידים (עליון) ו א.מ. כתמים שלילי (למטה); ו (ד) לא תוסף, ונותחו על ידי עמוד הילידים (העליון) ואת הכתם שלילי EM (למטה). סרגל קנה מידה, 50 ננומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig6.jpg" /> ויזואליזציה איור 6. שיטת TAP מטוהרת מורכבת. (א) למעלה, תמונה מייצגת של microsco אלקטרונים כתם שלילימיקרוסקופ py (EM). לנצפה הוא דשא של חלקיקים בעלי עיצוב דומה, שתיים התאגרפו, מטוהר בשיטת TAP המותאמת. תחתון, מבחר של ממוצעים בכיתה הנלקחים של החלקיקים המדגישים תכונות הבחנת חלקיקים. סרגל קנה מידה, 50 ננומטר. (ב) למעלה, תמונה מייצגת של מיקרוסקופ קריו-EM. נצפים הם אזורים של נציג ניגודיות גבוה של חלקיקים, לראות שני אזורים כגון התאגרף. ממוצעים תחתונים, בכיתה של חלקיקים נבחרים קפוא בקרח זגוגית. סרגל קנה מידה, 50 ננומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method at JoVE.com

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  Brandeis University. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies. 

Video: Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>מיטוב FPLC לטיהור יעיל של חלבון FEN1 המתויג שלו

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: אופטימיזציה של כרומטוגרפיית זיקה לחלבון FEN1 המתויג שלו

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב