The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.

Nota: O seguinte protocolo foi concebido para a purificação de um complexo a partir de 4 L de cultura de células, aproximadamente 40 g de peso molhado de células. Uma vez preparada, todos os tampões devem ser armazenadas a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês da sua preparação. Redutores inibidores de protease e agente são apenas adicionados aos buffers imediatamente antes da utilização. 1. Preparação do extracto celular total para purificação de afinidade em tandem <ol><li> Crescimento de S. células cerevisiae <ol><li> Streak a TAP desejado marcado S. cerevisiae do armazenamento (-80 ° C) em uma dextrose de levedura peptona (YPD) placa. Incubar durante 3 - 5 dias (30 ° C), até que as células fúngicas aparecem em branco e fofo. </li><li> Inocular uma sequência de cerca de 2 mm 2 das células frescas de placa em 10 ml de meio YPD em um tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico. Agitar o tubo a 180 revoluções por minuto (rpm) durante a noite (30m ° C). </li><li> Inocular 2 ml da sobrecultura noite, por litro de meio YPD em um L Erlenmeyer 2 ou frasco cónico. Agitar a 180 rpm (30 ° C). Monitorizar o crescimento celular a uma densidade óptica de 600 nm (OD 600) até a fase log tardia, OD 600 entre 1,8 e 2, tipicamente 20-24 horas. </li></ol></li><li> Colheita S. células cerevisiae <ol><li> Células colheita por centrifugação a 5400 xg durante 15 minutos (4 ° C). </li><li> decantar o sobrenadante rapidamente e manter as células a 4 ° C ou sobre gelo. </li><li> Suspender cada litro de pelete de células com 2 ml refrigeradas tampão de lise (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 300 mM; KCl 10 mM; EDTA 0,2 mM, pH 8,0; imidazole 5 mM, pH 8,0; 10% de glicerol; 0,1% v de NP-40 / v). Suspender as células por agitação e / ou de repetição pipetagem usando uma pipeta de 10 ml sorológica. Nota: A importância de NP-40 no que se refere à qualidade do complexo e a análise pós-purificação é discutido abaixo. </li><li> Transferir a suspensão de células para um vazio de 50 ml de polipropileno cónico tubo de centrífuga KEPT no gelo. Lava-se cada frasco de centrífuga com um adicional de 2 ml de tampão de lise arrefecida e adicionar a suspensão de células no tubo de 50 ml. </li><li> Determinar o peso húmido do sedimento celular por pesagem do tubo e subtraindo o peso do tubo vazio, bem como o tampão de lise adicionado. Nota: Um litro de cultura de células tendo uma densidade óptica de 1,8 a 600 é de aproximadamente 10 g. </li><li> Criar um banho de azoto líquido num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico. Desenhar células em suspensão em uma seringa de 5 ml. Conectar uma agulha G 16 da seringa. Congelar a suspensão de células por passagem através de seringa / agulha para gerar células de &quot;gotículas&quot;. Velocidade de congelação deve ser de aproximadamente 1 min / mL. </li><li> Armazenar gotículas de células congeladas (-80 ° C) ou proceder à lise. </li></ol></li><li> Lise Células e Lysate Esclarecimento <ol><li> Lyse as células de levedura usando um moedor de café. células Lyse oito a nove vezes com 25 segundos de moagem rajadas, agitando o cmoedor offee. Antes de usar, pré-resfriar o moedor de café com nitrogênio líquido. De dois em dois ciclos de moagem, adicionar uma camada superficial de azoto líquido para o moinho e permitir que ela se evapore. </li><li> Mexa com uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado como necessário para manter as células de aglomeração. Tome cuidado para evitar o descongelamento das células, o que pode resultar em agregação celular. As células devem aparecer como um pó branco fino após a lise. Uma pelete de células máximo de 4 L de cultura de levedura (~ 40 g) pode ser moído de cada vez. Nota: Observações sobre método de lise são discutidas abaixo. </li><li> Avaliar o grau de lise de células utilizando um hemocitómetro ou método de contagem celular alternativa. Para fornecer uma análise adequada, tomar as seguintes amostras: (1) antes de lise; (2) após quatro rondas de lise; e (3) após a lise. Para verificar essas amostras, tomar uma pequena quantidade de células com um nitrogênio espátula refrigerados líquido e coloque em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Uma vez que as células são descongeladas, de pipeta 5 ul de célulase misturar com 495 ul de água. Se 40 - é observada 60% de lise de células, avance para o próximo passo no protocolo. Nota: Observações relativas efeito de longos períodos de lise são discutidos abaixo. </li><li> Uma vez lise adequada é observada, loja lisadas células (-80 ° C) ou prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Preparar dois tubos de 50 ml de centrífuga de polipropileno cónico de 15 ml, cada um com um tampão de lise, incluindo 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF), 1 mM de ditiotreitol (DTT), e um cocktail comercialmente disponíveis de inibidores de protease. Nota: Se a proteólise é observada significativa, considerar o uso de uma estirpe deficiente em protease. </li><li> Use uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado para colher o pó de células lisadas congelada nos preparados tubos de 50 ml. Adicionar o pó celular / sólido incrementalmente ao tampão de lise, contendo tanto um redutor e inibidor (es) da protease. </li><li> Rodar os tubos de 50 ml suavemente à TA, a fim de descongelar / dissolver as células, mas também para evitar a formação de bolhas. UMAé o pó celular / sólido dissolve-se, adicione célula adicional sólido / pó. </li><li> Encher cada um dos dois tubos de 50 ml até que cada um tem aproximadamente 20 g de células ou todas as células adicionadas. Continuar a descongelação / dissolve-se até que não existam aglomerados de células congeladas observadas nos tubos de 50 ml. Isso deve levar cerca de 50 min. </li><li> Centrifuga-se o ligado de células em suspensão durante 20 minutos a 25000 xg (4 ° C). Bem células lisadas podem apresentar uma pequena quantidade de precipitado negro. </li><li> Transferir os 50 ml de sobrenadante para policarbonato tubos ultra-centrifugação (26,3 ml tubos usados) e adicionar 10 ul PMSF 200 mM a cada tubo cheio. </li><li> Centrifugar durante 1 h a 100000 xg (4 ° C). Quatro camadas deve ser visível, de baixo para cima: (1) um sedimento duro clara, contendo complexos ribossomais; (2) um sedimento macio ricos em lípidos; (3) uma grande camada amarelo-clara tingido contendo a maioria de proteínas e complexos solúveis da célula; e (4) uma camada de topo &#39;escamosa&#39; que consiste em lípidos. </li><li> Executar todas as spassos ubsequent em uma sala fria (4 ° C). Remover o máximo da camada lipídica topo &#39;escamosa &quot;quanto possível, utilizando uma pipeta de 1 mL e rejeitar. Usar uma pipeta de 10 ml serológico para recuperar a maior parte da camada amarelo, claro. </li><li> Recuperar os últimos ml desta camada usando uma pipeta de 1 ml para evitar perturbar as duas camadas inferiores. A partir de 40 g de sedimento celular húmido, cerca de 48 ml da camada do meio é tipicamente recuperado e 8 ml de camada lipídica removido / descartado. Nota: A purificação em coluna de fluxo é muito dificultado pela presença de lípidos, que também pode reduzir a qualidade do complexo, discutido abaixo. </li></ol></li></ol> 2. Coluna etapa de purificação 1: IgG Cromatografia <ol><li> Resina de Equilíbrio e encadernação <ol><li> Prepare um 300 ml IgG Sepharose suspensão por 40 g de sedimento celular. Cortar a extremidade de uma pipeta de 1 ml de ponta para facilitar a pipetagem da lama. Lavagem / equilibrar a resina de IgG três vezes, cada vez com 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl a 150 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 0,1% v / v de NP-40; 1 mM de DTT; um comprimido de inibidor de protease por 50 ml de volume). <ol><li> Centrifugação para sedimentar a 160 xg (4 ° C) entre as lavagens e remover o sobrenadante. </li></ol></li><li> Girar a resina de IgG com o sobrenadante da fase de meio e dois comprimidos de inibidor de protease de mini por 40 g de células, utilizando um rotor adequado, durante 2 h (4 ° C). Esta é a solução do lote de IgG. </li><li> Prepare duas colunas de 10 ml de poli-prep para utilização, cortando a extremidade da coluna para produzir um corte plano. Para acelerar a embalagem e lavagem da coluna de fluxo por gravidade, carregar um máximo de 200 ul de IgG de resina embalada ou ~ 25 ml da solução de lote de IgG por 10 ml de coluna. </li><li> Verter a solução do lote de IgG à coluna e permitir a sedimentar por gravidade. Se a sedimentação demora mais do que 30 minutos, não mais provável era a contaminação lipídica ao recuperar a fase intermédia do centrifugador tUBEs. </li><li> Lava-se a coluna empacotada com quatro sucessivos volumes de 10 ml de Tampão IgGD150. </li></ol></li><li> Por clivagem de TEV Coluna <ol><li> Selar o fundo da coluna e adicionar 1 ml de tampão IgGD150 e 100 ul de protease de TEV (0,6 mg / ml, variante mutante S219V de TEV produzido internamente). Fecha-se o topo da coluna e mistura-se durante 20 min (18 ° C) usando um misturador térmico, agitando a 750 rpm. Ressuspender a resina e misturar outra vez durante 20 minutos, repetir uma vez mais para um total de 1 hora de incubação. Nota: É crítico para manter o tempo de incubação para um mínimo. </li><li> Retorno da coluna a 4 ° C e elui-se a proteína / complexo por gravidade. Eluir o volume morto com um adicional de 200 mL de tampão IgGD150. </li></ol></li></ol> 3. coluna de purificação Passo 2: Cromatografia de Afinidade A calmodulina <ol><li> Resina de Equilíbrio e encadernação <ol><li> Preparar 200 ul de resina de afinidade com calmodulina por 40 g de célulassedimentar. Lava-se a resina três vezes, cada vez com 5 mL de calmodulina Tampão de Ligação (Tris 10 mM-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 2 mM de CaCl2; 0,1 % v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol), centrifugação a 160 xg (4 ° C) para sedimentar para cada lavagem. </li><li> Para cada 1 ml de eluato IgG, adicionar 3 volumes de calmodulina tampão de ligação. Para manter constante o nível de cálcio, adicionar CaCl2 e β-mercaptoetanol para explicar a falta destes componentes na eluição de IgG. As concentrações finais devem ser CaCl2 2 mM e mM β-mercaptoetanol 10. </li><li> Adicionar a amostra para a resina de calmodulina e ligam-se durante 1 hora (4 ° C) usando um rotor tubo. </li></ol></li><li> Embalagens e eluição, da calmodulina Resina <ol><li> Prepara-se uma coluna de 2 ml de poli-prep por 100 ul de suspensão de calmodulina, cortando a extremidade da coluna para criar uma abertura plana. Carregue não mais do que 100 ï¿½ calmodulina suspensão por column para minimizar a quantidade de resina a amostra entra em contacto durante a eluição com. </li><li> Encher a coluna pela força da gravidade e lava-se a resina na coluna três vezes com 5 mL de calmodulina Binding Buffer. </li><li> Elui-se a proteína com a adição de 200 uL calmodulina eluição tampão (Tris-HCl a 10, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8,0; EGTA 4 mM, pH 8,0; 0,08% v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol). Repita seis vezes a adição de 200 ul de tampão de eluição A calmodulina. </li><li> Para eluições 1 a 3, aplicam-se o volume para a coluna e recolher o eluato imediatamente. Para a eluição 4, vedar a parte inferior da coluna e incuba-se com tampão de eluição durante 2,5 min e, em seguida, desselar e deixa-se eluir por gravidade. Para a eluição 5, incubar durante 5 min e, em seguida, desselar e eluir. Para a eluição 6, incubar durante 10 minutos e, em seguida, desselar e eluir. Nota: A integridade do complexo pode variar entre eluiï¿½es / frações (ver secção resultados representante) &lt;./ Li&gt; <li> Dialisar eluições 2 a 6 individualmente durante a noite utilizando um método de diálise micro apropriado. Dialisar as fracções contra tampão de diálise (Tris-HCl a 10, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanol). Nota: O NP-40 não passam sensivelmente, se de todo, através da membrana de diálise. </li></ol></li></ol> 4. As análises pós-purificação para avaliar a qualidade do Complexo <ol><li> Native Gel e prata Coloração <ol><li> Prepara-se uma 4 - gel nativo prefabricados de 16% para análise do complexo de acordo com as instruções do fabricante. Usar um padrão de proteína de peso molecular apropriado e de carga de 15 ul de cada uma das fracções de calmodulina de eluição / dialisadas no gel. </li><li> Electroforese o gel a 150 V durante cerca de 3 h (4 ° C). </li><li> Silver Stain o gel para avaliar a qualidade de cada uma das seis eluições. Como alternativa, use comercial igualmente sensíveismancha fluorescente (s). Nesta fase, a concentração do complexo é muito provavelmente abaixo do nível de detecção por coloração com azul de Coomassie. </li></ol></li><li> Métodos de análise adicional do gel <ol><li> Para detectar a proteína por transferência de Western, resolver o complexo de SDS ou por PAGE nativa e, em seguida sondar o gel para o epitopo calmodulina Binding Peptide (CBP), utilizando um anticorpo etiqueta TAP de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Usando um corante fluorescente específico (s), confirmar a presença e a integridade de proteínas e / ou ácido nucleico num complexo da torneira purificada. Tome cuidado para que nenhuma sobreposição espectral é detectada entre estas manchas. </li></ol></li><li> Negativo Visualization Stain Electron Microscopy <ol><li> Use grades de carbono contínuas glow-descarregada a -15 mA durante 30 segundos, no prazo de 30 min de aplicação complexa. </li><li> Aplicar 3 ul de TAP complexo purificado (tipicamente a uma concentração de 1 nM) a grade. Incubar durante um minuto. blot fROM O lado da rede para remover o excesso de tampão. </li><li> Lavar duas vezes com 20 gotas de ua desionizada. blot lado entre as lavagens. </li><li> Aplicar grade para um 50 pi queda coloração negativa e incubar durante um min. A coloração com acetato de uranilo (2%) ou formato de uranilo (0,75%) é recomendado. Cuidado: sais e soluções uranyl são fracamente radioativa e contêm metais pesados. Estes devem ser manuseados com cuidado e todo o material que entra em contato com estas soluções devem ser eliminados de seguir as orientações de resíduos recomendados institucionais. </li><li> Aplicar grade para um 50 pi queda coloração negativa fresco, sem borrar. Incubar durante um minuto, em seguida, blot lado, e, finalmente, o ar seco e visualizar. </li></ol></li><li> Cryo Electron Microscopy (crio-EM) Visualization <ol><li> Execute crio-EM com a TAP purificado complexo, apesar de otimização pode ser necessário, de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: A presença de detergente em concentrações elevadas MAy impedir o progresso e é discutido abaixo. </li></ol></li></ol> 5. armazenamento Complex <ol><li> Preparando Complexo de Armazenamento <ol><li> Concentra-se o complexo, se necessário, utilizando-se um filtro centrífugo com um peso molecular de corte adequado para o complexo. Girar a 14.000 xg por 1 min incrementos até a concentração desejada seja atingida. Nota: concentração de NP-40 aumentarão em concentração durante a concentração, uma vez que não passa através da membrana do filtro, nem a diálise. </li><li> Flash congelar o complexo em 30 mL alíquotas em azoto líquido ou gelo seco arrefecido banho de etanol e, em seguida, armazena-se a -80 ° C. </li></ol></li><li> Opcional remoção pós-purificação de detergente </li></ol> Nota: A presença de um detergente tal como NP-40 e com uma concentração acima da sua concentração crítica de micelas podem impedir ou inibir o progresso para algumas aplicações. As consequências de sua remoção do protocol, bem como a substituição com outros aditivos ou co-solventes são discutidos abaixo. Se não NP-40 for desejado, uma opção é a utilização de uma aplicação comercial para a remoção de, por exemplo, Bio-beads. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pré-equilibrar disponíveis comercialmente de detergente em grânulos absorventes tampão de diálise. Misture cinco pérolas por 30 ul de complexo (geralmente em concentração de 10 nM). </li><li> Incubar esferas equilibradas do Passo 5.2.1 com TAP complexo purificado durante 15 minutos em gelo. Use complexo dentro de algumas horas após a remoção do detergente. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O método TAP utiliza duas marcas que equilibram a necessidade de rigorosa e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. Além disso, a TAP indivíduo com etiquetas ORFs estão disponíveis a partir de uma fonte comercial, de modo que pode obter-se qualquer estirpe de levedura com uma proteína etiquetada por qualquer complexo de levedura. A preservação da integridade de um complexo e a disponibilidade de um recurso para testar a utilização de diferentes subunidades proteicas marcadas em um complexo para a purificação são duas vantagens para a utilização do método de TAP para purificar um complexo nativo. No entanto, o protocolo TAP método original não foi concebido para assegurar que o complexo é purificado em termos de composição e estruturalmente homogénea. O método TAP tem, portanto, sido modificada, tal como descrito acima, para atingir este objectivo. Váriospassos no método TAP foram avaliados para determinar a melhor abordagem e as condições para purificar uma composição complexa e homogênea estrutural. Um passo crítico precoce é a lise celular. Este passo requer um equilíbrio entre o nosso desejo de um rendimento elevado e assim a máxima lise, ao mesmo tempo assegurando que o complexo obtido é de alta qualidade, isto é, homogénea. abordagens diferentes para células de levedura lise foram exploradas, incluindo o uso de um talão-batedor, processador de alta fluido pura, e moinho de bolas. Uso do moinho de café menos caro foi menos eficiente do que os métodos alternativos (40 - 60% de lise), mas o complexo isolado e purificado apareceu monodispersa enquanto várias destas abordagens apareceu a integridade de partícula, quer perturb ou provocar um certo grau de agregação. No final, um número significativo de células não foram submetidas a lise, de modo a assegurar complexo de alta qualidade foi obtida. Enquanto 40 - 60% de lise é ideal para o snRNP levedura U1, otimização é sugerido ao aplicar este protocolo a um<html> novo complexo biológico. Era essencial identificar os passos do método que pode acelerar a purificação para assegurar que a integridade do complexo não foi comprometida por proteases celulares, a dissociação da subunidade, como resultado da diluição, e estendido de incubação a 18 ° C durante a clivagem de protease de TEV. Um simples passo para atingir o tempo de purificação eficiente era assegurar que os lipídios não transitar a partir do início de esclarecimento lisado, visto que os lipídeos impedir o fluxo durante a purificação gravidade. Outras medidas incluíram a identificação de um equilíbrio óptimo entre a resina montante e coluna tamanho / dimensões para alcançar a purificação eficiente e um caudal máximo. Um passo particularmente importante foi o de reduzir o tempo de clivagem em coluna de protease de TEV. A protease TEV utilizado foi purificado em casa para garantir que ele foi protease / nuclease livre e em uma alta concentração 17. Quantidades significativas de protease de TEV foram usadas para obter clivagem completa em menos de uma hora. Observou onteúdo &quot;&gt; Em inicial proteólise purificações TAP. A proteólise durante a purificação pode ser limitada por trabalhar de forma eficiente, a adição de uma bateria de inibidores, e incluindo na purificação lavagens elevadas de sal. Uma ampla gama de inibidores de protease fornecidos através da primeira metade da purificação bastante melhorada a estabilidade da torneira com etiquetas proteína e complexas. Além disso, a proteólise foi minimizado aumentando a concentração monovalente de 300 a 500 mM durante a lise celular e passos de IgG de purificação. Mesmo com as modificações acima para o método TAP, sucessiva elua frações fora da resina de afinidade CBP variou em seu grau de homogeneidade composicional. Assim, pooling seletiva de frações de segundo, o CBP etapa de cromatografia, se justifica. Um aspecto do método da torneira que recebeu especial atenção foi a importância do detergente não iónico NP-40 a purificação complexa e com uma concentração acima da sua CMC. A presença de NP-40 a uma concentração de 0,08% ou superior teve um efeito benéfico sobre a integridade complexo e o rendimento final. O efeito benéfico aparente (s) de NP-40 pode ser devida, em parte, para a redução de interacções não específicas entre a resina e o complexo. Enquanto NP-40 parece ter um efeito benéfico no processo de purificação, pode ser removido após a purificação, sem causar agregação complexo. Finalmente, crítica para optimizar o método TAP para estudo estrutural foram utilizados vários ensaios complementares para avaliar a integridade e a homogeneidade do complexo. Estes dispersão de luz incluídos, SDS PAGE nativa e sondado utilizando o anticorpo TAP por transferência de Western e / ou corada com corantes fluorescentes, bem como microscopia electrónica de coloração negativa. As alterações feitas no método TAP aqui detalhado, rendeu um complexo homogênea em quantidades suficientes para microscopia eletrônica. Outras alterações podem precisar de ser submetido ao método de TAP para outros complexos, em particular um dissuadirminação da importância de NP-40. Em resumo, o método de purificação da torneira pode ser utilizado para purificar com sucesso complexos macromoleculares de uma fonte eucariótica de qualidade adequada para estudo estrutural. Nós estabelecemos uma abordagem adequada para a purificação do S. cerevisiae U1 snRNP e detalhes as medidas tomadas, bem como a razão para muitas dessas mudanças. Para outros complexos, sugerimos que o investigador semelhante explorar os passos do protocolo, que pode produzir quantidades e qualidade do complexo adequadas. Os passos que devem ser examinadas incluem a lise celular, sal e tipo de aditivo e concentrações, incluindo detergente, e sensibilidade do complexo de cálcio e metal quelante EGTA. Além disso, é importante para os estudos de longo prazo que o complexo pode ser congelado e descongelado, sem perturbar a estrutura. Mais importante, deve-se ter várias formas alternativas para ensaiar a estrutura do complexo durante e após a purificação. Native umnd SDS PAGE, EM coloração negativa, e espalhamento de luz têm nos servido bem na nossa investigação sobre a melhor forma de purificar um complexo homogênea utilizando o método TAP.

Muitos processos celulares importantes são realizadas por grandes complexos de proteínas e de ARN-proteína 1. Um gargalo significativo para a realização de estudos biofísicos e estruturais destes complexos é a sua obtenção de uma qualidade adequada (isto é, a homogeneidade) e numa concentração adequada. Isolamento de um complexo a partir de uma fonte nativa tem muitas vantagens, incluindo a retenção de modificações pós-transcricionais e / ou traducionais relevantes de subunidades e segurar a montagem complexa adequada. No entanto, grandes complexos celulares estão frequentemente presentes em uma célula de um número de cópias baixo e a purificação deve ser altamente eficiente e ocorrem sob condições fisiológicas próximo para assegurar a integridade do complexo é mantido. Purificando um complexo de uma fonte eucariótica é particularmente desafiador e pode ser financeiramente proibitivo. Assim, as estratégias ou métodos que sejam eficientes e produzem um complexo homogênea são altamente desejado. Uma estratégia que tem sidosucesso na purificação complexos nativos de células eucarióticas para sua caracterização inicial é o Tandem Affinity Purification (TAP) Método 2,3. O método TAP foi inicialmente concebido para purificar a proteína nativa a partir da levedura de brotamento (S. cerevisiae) em complexo com a interação dos fatores (s) 2. O método utilizado TAP duas etiquetas, cada etiqueta fundidos em conjunto para a mesma sequência do gene que codifica a proteína. As etiquetas foram seleccionados de forma a equilibrar a necessidade de apertado e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. A etiqueta TAP genomicamente incorporada foi colocada na extremidade (C-terminal) de um gene de codificação da proteína e consistia de uma sequência de codificação para um Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguido de Proteína A - uma adição de pouco mais de 20 kDa ao etiquetado proteína. CBP é curto, 26 aminoácidos, e reconhecido pela ~ 17 kDa de proteína calmodulina (CaM), na presença de cálcio com um K D na ordem de 10 -9 M 4. A Proteína A etiqueta é maior, que consiste de duas repetições de 58 resíduos com um curto ligante entre as repetições. Cada repetição ácido amino 58 é reconhecido pela imunoglobulina G (IgG) com um K D ~ 10 -8 M 5. Entre estas duas etiquetas foi incorporado um local de reconhecimento para a protease de TEV, uma endopeptidase do Vírus do tabaco Etch 6,7. Tal como ilustrado na Figura 1, no primeiro passo de afinidade do método da TAP etiquetado proteína é ligado a uma resina de IgG através da Proteína A. A proteína é eluída com etiquetas por clivagem em coluna após a adição de protease de TEV, Site-especificamente a clivagem entre as duas marcas. Este é um passo necessário como a interacção de IgG e proteína A é muito forte e pode apenas ser adequadamente perturbado sob condições desnaturantes solução. Na falta de um Protein uma etiqueta, a proteína está ligada a resina CaM na presença de cálcio e eluído a partir desta resina com a adição de EGTA quelante de iões metálicos (ácido tetracético de etileno-glicol) (Figura 1). Logo após a introdução do método da TAP, que foi utilizado num estudo em larga escala para gerar um &quot;mapa&quot; de interacções complexas em S. cerevisiae 8. É importante notar, como uma consequência deste esforço uma biblioteca inteira Quadro levedura-TAP Tagged de leitura aberta (ORF), bem como a TAP indivíduo com etiquetas ORFs 9 estão disponíveis a partir de uma fonte comercial. Assim, pode-se obter qualquer cepa de levedura com uma proteína marcadas para qualquer complexo levedura. O método TAP também estimulou modificações ou variações da etiqueta TAP, incluindo: a sua utilização para a purificação de complexos de outros eucariotas, bem como as células bacterianas 10,11; a criação de uma &quot;tag dividido&quot;, em que a proteína A e PFC são colocados em diferentes proteínas 12; eo taGS alterado, de modo a acomodar a necessidade do investigador, tais como a sensibilidade do complexo de Ca 2+ ou de EGTA 13. Recentes avanços em ambos instrumentação e metodologia levaram a avanços significativos na aplicação de microscopia eletrônica (EM) para determinação da estrutura, que levaram à alta, perto imagens de resolução atômicas de complexos macromoleculares 14. A resolução de um complexo obtido por EM, no entanto, permanece depende da qualidade do complexo em estudo. Este estudo utilizou a abordagem tag TAP para purificar de S. cerevisiae U1 snRNP, um baixo número de cópias do complexo ribonucleoproteico 18 da subunidade (~ 0,8 MDA) que faz parte do spliceossoma 15,16. Um número de passos foram tomados para purificar este complexo de tal forma que é homogénea e de uma concentração adequada. Os potenciais problemas encontrados em várias fases da purificação são descritos e estratégias para superar feita challEnges destaque. Com cuidado avaliar e optimizar etapas na purificação, o U1 snRNP purificado é de uma qualidade e em quantidade adequada para coloração negativa e eletrônica crio microscopia (crio-EM) estudos. Um método TAP protocolo optimizado para a purificação de complexos de nativas para estudos estruturais é aqui descrito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae TAP tagged strain</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>YSC1177</td>
			<td>This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3&#916;1, leu2&#916;0, met15&#916;0, ura3&#916;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee grinder</td>
			<td>Mr. Coffee</td>
			<td>IDS77</td>
			<td>Used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Used to assess cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA 9.100 centrifuge rotor&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to harvest the yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA 20 fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to further clear the soluble cell extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>R5355</td>
			<td>Temperature controlled shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex gel system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td>Sepharose 6 fast flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin resin</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>214303</td>
			<td>Affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail, mini tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>589297</td>
			<td>Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail, large tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5892953</td>
			<td>cOmplete ultra EDTA-free tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolved in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Bio-spin column</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>7326008</td>
			<td>Used to pack and wash the Calmodulin resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep column</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>7311550</td>
			<td>Used to pack and wash the IgG resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast native PAGE Bis-Tris gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>BN1002</td>
			<td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 &#956;L for a silver stained gel and 5 &#956;L for a SYPRO Ruby stained gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDS PAGE Bis-Tris gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Unstained protein standard used for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS running buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td>Primary antibody against CBP tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31341</td>
			<td>Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34042</td>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialaysis units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88401</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units, 100kDa MWCO</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC5100008</td>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent absorbing beads</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>1523920</td>
			<td>Bio-bead SM-2 absorbants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S-7564</td>
			<td>Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-12000</td>
			<td>Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G400-CP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method

abordagens de purificação por afinidade foram bem sucedidos em isolar complexos nativas para a caracterização proteômica. heterogeneidade estrutural e um grau de heterogeneidade de composição de um complexo não costumam impedir o progresso na realização de tais estudos. Em contraste, um complexo destinado a caracterização estrutural deve ser purificado num estado que é tanto em termos de composição e estruturalmente homogénea, bem como a uma concentração mais elevada do que o necessário para proteómica. Recentemente, tem havido avanços significativos na aplicação da microscopia de electrões para a determinação da estrutura de grandes complexos macromoleculares. Isso tem aumentado o interesse em abordagens para purificar complexos nativas de qualidade e quantidade suficiente para a determinação estrutural por microscopia eletrônica. O método Tandem Affinity Purification (TAP) foi otimizado para extrair e purificar a 18 subunidade, ~ 0,8 Mda montagem ribonucleoproteï¿½a a partir de levedura de brotamento (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; adequado para coloração negativa e microscopia crio elétron. Aqui está detalhado as modificações feitas com o método TAP, a justificativa para fazer essas alterações, e as abordagens tomadas para ensaio para um complexo de composição e estruturalmente homogênea.

Um método TAP modificado foi usado para purificar a partir de S. cerevisiae U1 snRNP, um complexo ribonucleoproteico-18 subunidade. Uma purificação inicial da TAP complexo seguindo o protocolo publicado 2,3 produziu um complexo que apareceu heterogénea, que migra como três bandas sobre um gel de poliacrilamida corado com prata nativa (Figura 2A). Múltiplos ciclos de optimização do método TAP, produziu um complexo que migrou como uma única banda, principalmente num gel nativo indicativo de um conjunto mais homogéneo (Figura 2A). Usando corantes fluorescentes para manchar tanto para proteínas e ácidos nucleicos, estabeleceu-se que o complexo purificado tinha os dois biopolímeros presentes (Figura 2B). O complexo purificado foi também analisado por SDS-PAGE e Western blotting utilizando um anticorpo etiqueta TAP (Figura 3A). Consistente com os native resultado de gel, o complexo purificado de acordo com o protocolo publicado exibiu proteólise da proteína etiquetada TAP (Snu71). A quantidade de proteólise, contudo, foi significativamente reduzida com modificações do método TAP. Quase todos os dezassete proteínas no complexo U1 snRNP foram resolvidas por SDS-PAGE e positivamente identificado por espectrometria de massa MALDI (Figura 3B). Bem como nativa e SDS-PAGE, a qualidade do complexo foi avaliada em diferentes fases da purificação por microscopia electrónica de coloração negativa (Figura 4). As partículas monodispersas observados na Figura 4A e B, mas ausentes do 4C são exemplos de boa amostra para o estudo estrutural. Este método de análise fornecida uma visão crítica quanto ao impacto de mudanças no método TAP. O método TAP requer a inclusão do detergente não iónico NP-40 e a uma concentration acima da sua concentração crítica de micelas (CMC). A robustez dos métodos de avaliação da qualidade do complexo descrito no protocolo são bem demonstrado por uma experiência em que o surfactante zwitteriónico CHAPS, glicerol ou sem co-solvente foram substituídos para o NP-40 em todos os tampões (Figura 5). Por PAGE nativa e EM coloração negativa, o U1 snRNP aparece mais homogênea e estável em NP-40 com a diminuição da estabilidade de CHAPS a glicerol a nenhum co-solvente adicionado. Pode ser que a levedura U1 snRNP tem uma face hidrofóbica e a presença de NP-40 previne a agregação, revestindo esta superfície. Infelizmente, NP-40 não pode ser removido por diálise e a concentração do complexo, então, concentrar-se a NP-40. Enquanto a maior NP-40 não pareceu perturbar o complexo, que tinha um impacto negativo no congelamento da partícula de gelo no vítreo para Cryo-EM e grandes agregados de micelas semelhantes foram observados. Detergentes grânulos absorventes foram usadas com sucesso para remova a maioria do NP-40 a partir da amostra U1 snRNP sem aparecer para impactar o complexo estruturalmente. Após a purificação do complexo com as modificações descritas no protocolo, um complexo adequado tanto para coloração negativa e crio-EM foi obtido, como evidenciado por imagens da relva e de partículas médias de classe representativos distintas (Figura 6). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral da Tandem Affinity Purification (TAP) Método. (A) Representação esquemática do método de dois passos TAP. Complexo de interesse (cinza) inclui um TAP com etiquetas subunidade (preto; U1 snRNP subunidade Snu71) genomically fundido com uma sequência composta por um calmodulina Binding Peptide (CBP, verde), um local de reconhecimento para a protease específica do local TEV (azul), e dois IgG regiões da proteína A de ligação (Pr A<html> , Vermelho). No primeiro passo, o lisado de células é incubada com uma resina de IgG e o complexo é retido por meio da sua interacção com a proteína A sequência. O complexo é libertado da resina por clivagem de TEV mediada. No segundo passo, o complexo é incubado com uma resina de calmodulina, uma reacção dependente de Ca 2+. O complexo é libertado através da adição de EGTA quelante do Ca2 +. (B) Western Blot seguindo uma torneira com etiquetas proteína através dos passos de purificação ilustrados em (A). Foram tomadas amostras de ligado celular, depois do primeiro passo, e depois o segundo passo do método da TAP. A proteína reativa observada em lisado celular migra mais rapidamente após a primeira etapa, após clivagem TEV protease e, portanto, perda da Proteína A sequência. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ure 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54389 / 54389fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. A optimização do método de TAP. (A) de prata manchado gel nativo de complexos torneira purificada. PAGE materna: padrão de proteína (pista 1); complexos purificados de acordo com o método original Toque 3 (pista 2), três bandas observadas (pontas de seta); três eluiï¿½es consecutivos a partir da mesma purificação TAP seguintes alterações para o buffer, duas bandas observadas (setas) (pistas 3 - 5); novas alterações do método TAP, produzindo principalmente uma única banda complexa migração em ~ 800 kDa (pista 6). (B) Análise da composição de um complexo purificado por coloração uma única pista gel com proteínas e RNA manchas reativos. PAGE materna: padrão de proteína (pista 1) marcadas com um corante fluorescente proteína; fotografada complexo com a proteína mancha fluorescente (pista 2), duas bandas observadas; mesma pista na pista 2, agora fotografada com um corante fluorescente ácido nucleico (pista 3), duas bandas observadas; e sinal fluorescente ao longoleigos do complexo corado nas pistas 2 e 3 (pista 4). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig3.jpg" /> Figura 3. Optimização do método TAP. (A) análise de transferência de Western de melhoria na qualidade do complexo, após a TAP etiquetado subunidade Snu71 sondadas com anticorpo α-TAP. Várias bandas proteolisada são visíveis inicialmente (pista 1) mas as melhorias reduzir a quantidade de bandas mais baixas consideravelmente (pistas 2 e 3). (B) um gel de SDS corado com um representante de mancha de gel de proteína fluorescente. Gel resolve 12 das 17 subunidades de proteína do complexo. Identidade da proteína nas faixas foi estabelecida por espectrometria de massa. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma larg</a>versão er desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig4.jpg" /> Figura 4. Qualidade Amostra em diferentes fases do Método TAP avaliada por Negative Stain Electron Microscopy Avaliação por microscopia eletrônica de coloração negativa de depois complexa:. (A) do st etapa da TAP 1; (B) o passo 2º da TAP; (C ) complexo desestabilizado. Barra de escala, 125 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig5.jpg" /> Figura 5. Impacto na qualidade da amostra de aditivos presentes em TAP Método Buffers Lanes. 1 - 4 são as primeiras quatro eluições da etapa final ou 2 nd de purificação TAP de complex purificado na presença de: (A) o detergente não iónico de nonil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analisados ​​por PAGE nativa (em cima) e EM coloração negativa (inferior); (B) o detergente zwitteriónico 3 - [(3- colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS), analisados ​​por PAGE nativa (em cima) e coloração negativa EM (inferior); (C) glicerol, analisadas por PAGE nativa (em cima) e EM coloração negativa (inferior); e (D) sem aditivo, analisado por PAGE nativa (em cima) e coloração negativa EM (parte inferior). Barra de escala, 50 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig6.jpg" /> Figura 6. Método de visualização da torneira purificada Complexo. (A) superior, uma imagem representativa de um microsco elétrons coloração negativapy (EM) micrografia. Observado é um gramado de partículas com forma semelhante, dois estão em caixa, purificado pelo método TAP otimizado. Bottom, uma seleção de médias de classe tomadas das partículas que destacam características distintivas das partículas. Barra de escala, 50 nm. (B) Top, uma imagem representativa de uma micrografia de crio-EM. Observados são regiões de maior representante contraste de partículas, ver duas dessas regiões enquadradas. Fundo, médias classe de partículas selecionados congeladas no gelo vítreo. Barra de escala, 50 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K visualizações.  Brandeis University. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies. 

Vídeo: Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologia

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...