The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.

Hinweis: Das folgende Protokoll zur Reinigung eines Komplexes von 4 l Zellkultur entwickelt wurde, etwa 40 g Nassgewicht der Zellen. Nach der Vorbereitung sollten alle Puffer bei 4 ° C gelagert und innerhalb eines Monats nach ihrer Herstellung verwendet. Reduktionsmittel und Proteaseinhibitoren werden nur Puffer zugesetzt unmittelbar vor der Verwendung. 1. Herstellung von Gesamtzellextrakt für Tandem Affinity Purification <ol><li> Das Wachstum von S. cerevisiae - Zellen <ol><li> Streak die gewünschte TAP markiert S. cerevisiae - Stamm aus dem Speicher (-80 ° C) auf eine Hefe - Pepton Dextrose (YPD) Platte. Inkubieren für 3 - 5 Tage (30 ° C), bis Hefezellen weiß und flauschig erscheinen. </li><li> Beimpfen einen Streifen von etwa 2 mm 2 der frische Zellen von der Platte in 10 ml YPD - Medium in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Das Röhrchen wird bei 180 Umdrehungen pro min (UpM) über Nacht (30 m ° C). </li><li> Impfen 2 ml der überNachtkultur pro Liter YPD Medium in einem 2-L Erlenmeyer oder Erlenmeyerkolben. Schütteln bei 180 rpm (30 ° C). Überwachen Zellwachstum bei einer optischen Dichte von 600 nm (OD 600) bis zum späten logarithmischen Phase, OD 600 von 1,8 bis 2, typischerweise von 20 bis 24 Stunden. </li></ol></li><li> Ernten S. cerevisiae - Zellen <ol><li> Ernte die Zellen durch Zentrifugation bei 5.400 xg für 15 Minuten (4 ° C). </li><li> Schnell den Überstand dekantieren und halten Zellen bei 4 ° C oder auf Eis. </li><li> Suspend jeden Liter Zellpellet mit 2 ml gekühlt Lysis-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl; 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM Imidazol, pH 8,0; 10% Glycerin; 0,1% v / v NP-40). Suspend-Zellen durch Verwirbelung und / oder Wiederholungs Pipettieren 10 ml serologische Pipette. Hinweis: Die Bedeutung von NP-40, wie es komplexe Qualität und Nachreinigung Analyse bezieht sich auf unten diskutiert wird. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in eine leere 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen kept auf Eis. Waschen Sie jeden Zentrifugenflasche mit weiteren 2 ml gekühlt Lysepuffer und fügen Sie in der 50-ml-Röhrchen zur Zellsuspension. </li><li> Bestimmen das Naßgewicht Zellpellet durch das Rohr mit einem Gewicht und das Gewicht des leeren Rohrs sowie die hinzugefügte Lysis Buffer subtrahieren. Hinweis: Ein Liter Zellkultur eine OD 600 von 1,8 mit ca. 10 g. </li><li> Erstellen eines Bad aus flüssigem Stickstoff in einem 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zeichne suspendierten Zellen in eine 5 ml Spritze. Schließen Sie eine 16 G-Nadel an der Spritze. Einfrieren der Zellsuspension, indem sie durch die Spritze / Nadel vorbei Zelle zu erzeugen, &quot;Tröpfchen&quot;. Gefriergeschwindigkeit sollte etwa 1 min / ml betragen. </li><li> Lagerung tiefgefroren Zell Tröpfchen (-80 ° C) oder zur Lyse stattfindet. </li></ol></li><li> Lyse von Zellen und Lysate Klärung <ol><li> Lyse der Hefezellen mit einer Kaffeemühle. Lyse Zellen acht bis neun Mal mit 25 sec platzt Schleifen, während die C Schüttelnoffee Mahlwerk. Vor der Verwendung vorge kühlen Sie die Kaffeemühle mit flüssigem Stickstoff. Alle zwei Runden von Schleifen, eine flache Schicht aus flüssigem Stickstoff zu der Mühle hinzufügen und verdampfen lassen. </li><li> Rühren Sie mit einem flüssigen Stickstoff gekühlt Spatel nach Bedarf Zellen von Verklumpung zu halten. Vorsicht geboten Auftauen von Zellen zu verhindern, die in Zell Verklumpung führen kann. Die Zellen sollten als feines weißes Pulver nach Lyse erscheinen. Eine maximale Zellpellet von 4 l Hefekultur (~ 40 g) geschliffen zu einer Zeit sein. Hinweis: Beobachtungen in Bezug auf Verfahren der Lyse werden im Folgenden erörtert. </li><li> Beurteilen Sie den Grad der Zell-Lyse einer Zählkammer oder alternative Zelle Zählmethode verwendet. Um eine angemessene Analyse liefern, nehmen Sie die folgenden Beispiele: (1) vor der Lyse; (2) nach vier Runden der Lyse; und (3) nach Lyse. Um diese Proben zu überprüfen, nehmen Sie eine kleine Menge an Zellen mit einem flüssigen Stickstoff gekühlt Spachtel und in ein 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Sobald Zellen aufgetaut werden, Pipette 5 ul Zellenund mit 495 &amp; mgr; l Wasser mischen. Wenn 40-60% Lyse von Zellen beobachtet wird, mit dem nächsten Schritt im Protokoll verfahren. Hinweis: Anmerkungen hinsichtlich Wirkung von langen Perioden der Lyse werden im Folgenden erörtert. </li><li> Sobald eine angemessene Lyse beobachtet wird, zu speichern lysierten Zellen (-80 ° C) oder mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Bereiten zwei 50 ml konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit jeweils 15 ml Lysis-Puffer, bestehend aus 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Dithiothreitol (DTT) und eines handelsüblichen Cocktail von Proteaseinhibitoren. Hinweis: Wenn signifikante Proteolyse beobachtet wird, die Verwendung eines Protease-defiziente Stamm betrachten. </li><li> Verwenden Sie ein mit flüssigem Stickstoff gekühlt Spachtel das gefrorene lysierte Zell Pulver in die vorbereiteten 50-ml-Röhrchen zu schöpfen. Fügen Sie die Zelle Pulver / Feststoff schrittweise zu dem Lysepuffer, sowohl ein Reduktionsmittel und Protease-Inhibitor (en) enthält. </li><li> Drehen Sie die 50-ml-Röhrchen vorsichtig bei RT, um aufzutauen / die Zellen aufzulösen, sondern auch Blasen Bildung zu verhindern. EINs die Zelle Pulver / Feststoff löst, zusätzliche Zelle fest / Pulver hinzufügen. </li><li> Füllen Sie jede der beiden 50-ml-Röhrchen, bis jeweils etwa 20 g Zellen hat oder alle hinzugefügten Zellen. Weiter Auftauen / Auflösung, bis es keine gefrorenen Zellklumpen in den 50-ml-Röhrchen beobachtet werden. Dies sollte etwa 50 Minuten dauern. </li><li> Zentrifugieren des suspendierten Zelllysat für 20 Minuten bei 25.000 × g (4 ° C). Gut lysierten Zellen kann eine kleine Menge von schwarzem Niederschlag aufweisen. </li><li> Übertragen Sie die 50 ml Überstand Ultrazentrifugenröhrchen auf Polycarbonat (26,3 ml-Röhrchen verwendet wird) und dann werden 10 &amp; mgr; l 200 mM PMSF zu jeder vollen Rohr. </li><li> Zentrifuge für 1 Stunde bei 100.000 × g (4 ° C). Vier Schichten sollte sichtbar sein, von unten nach oben: (1) eine harte klare Pellet, ribosomale Komplexe enthält; (2) eine weiche lipidreichen Pellet; (3) eine große, klare gelb-gefärbten Schicht die meisten der Zelle lösliche Proteine ​​und Komplexe enthalten; und (4) eine &quot;schuppig&quot; Deckschicht, bestehend aus Lipiden. </li><li> Führen Sie alle subsequent Schritte in einem kalten Raum (4 ° C). Entfernen Sie so viel von der Spitze &quot;schuppig&quot; Lipidschicht wie möglich eine 1 ml-Pipette und entsorgen. Verwenden Sie eine 10 ml serologische Pipette die meisten der gelbe, klare Schicht zu erholen. </li><li> Recover die letzten paar ml dieser Schicht mit einer 1 ml Pipette stören die beiden unteren Schichten zu vermeiden. 40 g Nasszellpellet wird in etwa 48 ml der mittleren Schicht typischerweise gewonnen und 8 ml der Lipidschicht entfernt / verworfen. Hinweis: Säulenreinigung Fluss stark durch die Anwesenheit von Lipiden behindert wird, die auch die Qualität des Komplexes verringern kann, wie unten diskutiert. </li></ol></li></ol> 2. Spalte Reinigungsschritt 1: IgG-Chromatographie <ol><li> Resin Equilibrierung und Bindung <ol><li> Bereiten Sie eine 300 ul IgG Sepharose Aufschlämmung 40 g Zellpellet. Schneiden Sie das Ende einer 1 ml Pipettenspitze Pipettieren der Aufschlämmung zu erleichtern. Wash / äquilibrieren die IgG-Harz drei Mal, jedes Mal mit 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl; 1 mM MgCl 2; 5 mM Imidazol, pH 8, 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, ein Protease - Inhibitor - Tablette pro 50 ml Volumen). <ol><li> Spin bei 160 xg (4 ° C) zwischen den Wäschen zu pelletieren und zu entfernen Überstand. </li></ol></li><li> Drehen, um die IgG-Harz mit der mittleren Phasenüberstand und zwei Mini Protease-Inhibitor Tabletten pro 40 g der Zellen, einen entsprechenden Rotator, 2 Stunden (4 ° C) verwendet wird. Dies ist die IgG-Batch-Lösung. </li><li> Bereiten Sie zwei 10 ml Poly-Prep-Säulen für die Verwendung durch das Ende der Säule Schneiden eines flachen Schnitt zu erzeugen. Um die Verpackung und Waschen der Säule durch Schwerkraftfluss zu beschleunigen, laden ein Maximum von 200 ul gepackten IgG-Harz oder ~ 25 ml der IgG-Batch-Lösung pro 10 ml-Säule. </li><li> Gießen Sie die IgG batch-Lösung in die Säule gegeben und durch die Schwerkraft zu sedimentieren. Wenn Sedimentation länger dauert als 30 min, da die meisten wahrscheinlich Lipid Kontamination, wenn die mittlere Phase aus der Zentrifuge t erholtUBEs. </li><li> Waschen Sie die gepackten Säule mit vier aufeinanderfolgenden 10 ml-Volumina von IgGD150 Buffer. </li></ol></li><li> Auf Spalte TEV - Spaltung <ol><li> Verschließen Sie den Boden der Säule und 1 ml IgGD150 Puffer und 100 ul TEV-Protease (0,6 mg / ml Lager, mutierten Variante S219V von TEV produziert in-house). Verschließen Sie den Kopf der Kolonne und mischen für 20 min (18 ° C) mit einem Thermomischer bei 750 Umdrehungen pro Minute schütteln. Resuspendieren Harz und 20 min wieder mischen, noch einmal wiederholen für insgesamt 1 Stunde Inkubation. Hinweis: Es ist wichtig, auf ein Minimum Zeit der Inkubation zu halten. </li><li> Liefert die Säule auf 4 ° C und Eluieren des Protein / Komplex durch die Schwerkraft. Eluieren der Totraumvorrichtung mit zusätzlichen 200 ul IgGD150 Buffer. </li></ol></li></ol> 3. Spalte Reinigung Schritt 2: Calmodulin-Affinitätschromatographie <ol><li> Resin Equilibrierung und Bindung <ol><li> Bereiten 200 ul Calmodulin-Affinitätsharz pro 40 g Zellpelletieren. Das Harz wird dreimal, jedes Mal mit 5 ml Calmodulin Bindungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl 2; 5 mM Imidazol, pH 8; 2 mM CaCl 2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-Mercaptoethanol) bei 160 xg (4ºC) zentrifugiert für jede Wäsche zu pelletieren. </li><li> Zu je 1 ml IgG-Eluat, fügen Sie 3 Volumen Calmodulin Bindungspuffer. Um die Calciumspiegel konstant zu halten, fügen CaCl 2 und β-Mercaptoethanol für das Fehlen dieser Bestandteile in der IgG - Elution zu berücksichtigen. Endkonzentrationen sollte 2 mM CaCl 2 und 10 mM β-Mercaptoethanol sein. </li><li> Fügen Sie die Probe auf das Harz und Calmodulin binden, für 1 Stunde (4 ° C) unter Verwendung eines Rohr-Rotator. </li></ol></li><li> Verpackung und Eluieren von Calmodulin Harz <ol><li> Bereiten Sie eine 2 ml Poly-Prep-Säule pro 100 ul Calmodulin Aufschlämmung durch das Ende der Säule Schneiden einer flachen Öffnung zu schaffen. Legen Sie nicht mehr als 100 &amp; mgr; l Calmodulin Slurry pro column die Menge des Harzes, die Probe in Kontakt mit während der Elution kommt, zu minimieren. </li><li> Packen Sie die Spalte durch die Schwerkraft und waschen das Harz in der Säule dreimal mit 5 ml Calmodulin Bindungspuffer. </li><li> Eluieren Protein unter Zugabe von 200 ul Calmodulin Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl 2; 5 mM Imidazol, pH 8,0, 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-Mercaptoethanol). Wiederholen sechsmal die Zugabe von 200 ul Calmodulin Elutionspuffer. </li><li> Für Elutionen 1 bis 3, um das Volumen auf die Säule übernehmen und das Eluat sofort sammeln. Zur Elution 4 dichten den Boden der Säule und Inkubation mit Elutionspuffer für 2,5 min und dann entsiegeln und ermöglichen es durch die Schwerkraft zu eluieren. Zur Elution 5, 5 min inkubieren und dann entsiegeln und ausströmen. Zur Elution 6, 10 min inkubieren und dann entsiegeln und ausströmen. Hinweis: Die Integrität des Komplexes kann variieren zwischen Eluierungen / Fraktionen (siehe repräsentative Ergebnisse Abschnitt) &lt;./ Li&gt; <li> Dialysiere Eluierungen 2 bis 6 einzeln über Nacht eine geeignete Mikrodialyseverfahren. Dialysieren um die Fraktionen gegen Dialysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl 2; 5 mM Imidazol, pH 8; 10 mM β-Mercaptoethanol). Hinweis: NP-40 nicht nennenswert weitergeben, wenn überhaupt, durch die Dialysemembran. </li></ol></li></ol> 4. Nachreinigung Analysen Komplexe Qualität beurteilen <ol><li> Nativen Gel und Silberfärbung <ol><li> Bereiten Sie ein 4 - 16% Fertig nativen Gel zur Analyse des Komplexes gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden eines geeigneten Molekulargewicht-Proteinstandards und Last 15 ul von jedem der dialysierten Calmodulin Elution / Fraktionen auf das Gel. </li><li> Elektrophorese, das Gel bei 150 V für etwa 3 Stunden (4 ° C). </li><li> Silberfärbung des Gels, die Qualität von jedem der sechs Elutionen zu beurteilen. Alternativ dazu können Sie ebenso sensible GeschäftsFluoreszenzfarbstoff (en). In diesem Stadium ist die Konzentration des Komplexes wahrscheinlich unterhalb der Nachweisgrenze für die Coomassie-Blau-Färbung. </li></ol></li><li> Zusätzliche Gel - Analyse - Methoden <ol><li> Um Protein durch Western Blot erkennen, zu lösen des Komplexes durch SDS oder native PAGE und die Sonde dann das Gel für die Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) Epitop ein TAP-Tag Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Verwendung eines spezifischen Fluoreszenzfarbstoff (e), bestätigen das Vorhandensein und die Integrität des Proteins und / oder Nukleinsäure in einer TAP gereinigten Komplexes. Achten Sie darauf, dass keine spektrale Überlappung zwischen diesen Flecken festgestellt wird. </li></ol></li><li> Negative Stain Elektronenmikroskopie Visualisierung <ol><li> Verwenden Sie kontinuierliche Kohlenstoff Gitter glow-entladen bei -15 mA für 30 Sekunden, innerhalb von 30 Minuten von komplexen Anwendung. </li><li> Bewerben 3 ul TAP gereinigt Komplex (typischerweise bei einer Konzentration von 1 nM) auf Gitter. Inkubieren für eine Minute. Blot fROM mit der Seite des Gitters überschüssigen Puffer zu entfernen. </li><li> Wasche zweimal mit 20 &amp; mgr; l Tropfen entionisiertes Wasser. Side-Blot zwischen Wäschen. </li><li> Bewerben Gitter auf eine 50 &amp; mgr; l Negativfärbung Tropfen und Inkubation für eine min. Färbung mit Uranylacetat (2%) oder Uranyl-formiat (0,75%) empfohlen. Achtung: Uranylsalzen und Lösungen sind schwach radioaktiv und enthalten Schwermetall. Diese sollten mit Sorgfalt und alle Materialien bearbeitet werden, die mit diesen Lösungen in Kontakt kommt, sollte der folgenden institutionellen empfohlen Abfallrichtlinien entsorgt werden. </li><li> Wenden Sie Gitter in ein frisches 50 ul negativen Fleck Tropfen, ohne Blotting. Inkubieren für eine min, dann Seite Blot, und schließlich an der Luft trocknen und zu visualisieren. </li></ol></li><li> Cryo - Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Visualisierung <ol><li> Führen Kryo-EM mit TAP gereinigten Komplex, obwohl Optimierung erforderlich sein kann, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Hinweis: Das Vorhandensein von Reinigungsmittel in hohen Konzentrationen may behindern Fortschritt und wird unten diskutiert. </li></ol></li></ol> 5. Komplexe Speicher <ol><li> Vorbereiten Complex für Storage <ol><li> Konzentriere das komplexe, falls erforderlich, unter Verwendung eines zentrifugalen Filters ein geeignetes Molekulargewicht cut-off für den Komplex ist. Spin bei 14.000 × g für 1 min-Schritten, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Hinweis: NP-40-Konzentration wird in Konzentration erhöhen während die Konzentration, da es nicht durch den Filter noch Dialysemembran nicht passieren. </li><li> Blitzeis der Komplex in 30 ul Aliquots in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis gekühlt Ethanol-Bad und dann bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Optional Nachreinigung Entfernung von Waschmittel </li></ol> Hinweis: Die Anwesenheit eines Detergens, wie NP-40 und in einer Konzentration über der von seiner kritischen Mizellenkonzentration behindern oder inhibieren Fortschritt für einige Anwendungen. Die Folgen der Entnahme aus dem Protocol sowie Austausch mit anderen Additiven oder Cosolventien werden im Folgenden erörtert. Wenn kein NP-40 erwünscht ist, ist eine Option für die Entfernung einer kommerziellen Anwendung zu verwenden, beispielsweise Bio-beads. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pre-Equilibrat im Handel erhältlichen Waschmittel absorbierenden Perlen in Dialysepuffer. Mischen Sie fünf Perlen pro 30 ul-Komplex (in der Regel bei 10 nM Konzentration). </li><li> Inkubieren ins Gleichgewicht gebracht Perlen aus Schritt 5.2.1 mit TAP gereinigt Komplex für 15 Minuten auf Eis. Verwenden Komplex innerhalb weniger Stunden nach dem Entfernen des Waschmittels. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die TAP-Methode verwendet zwei Tags, die eine Notwendigkeit für strenge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten leichen. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Darüber hinaus markiert einzelne TAP ORFs von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind, so dass man jeden Hefestamm mit einem markierten Proteins für jede Hefe-Komplex erhalten. Erhaltung der Integrität eines Komplexes und die Verfügbarkeit einer Ressource Verwendung verschiedener tagged Protein-Untereinheiten in einer Anlage für die Reinigung sind zwei Vorteile für die Verwendung des TAP Verfahren zur Reinigung eines nativen Komplexes zu testen. Jedoch wurde die ursprüngliche TAP-Methode Protokoll nicht, um sicherzustellen, entwickelt, dass der Komplex gereinigt kompositionell und strukturell homogen ist. Die TAP-Verfahren wurde deshalb geändert worden ist, wie oben beschrieben, um dieses Ziel zu erreichen. VerschiedeneSchritte in TAP-Methode bewertet wurden, die optimale Vorgehensweise und Bedingungen zu schaffen, eine Zusammensetzung und strukturelle homogene Komplex zu reinigen. Eine frühe kritische Schritt ist Zell-Lyse. Dieser Schritt erfordert ein Gleichgewicht zwischen einem Wunsch nach einer hohen Ausbeute und damit maximale Lyse, während sichergestellt wird, daß der Komplex von hoher Qualität erhalten, das heißt, homogen ist . Verschiedene Ansätze zur Lyse Hefezellen wurden untersucht, darunter mit einem Wulst-Beater, hohe schiere Flüssigkeit Prozessor und Kugelmühle. Verwendung des weniger teuren Kaffeemühle war weniger effizient als die alternative Methoden (40-60% Lyse), aber der Komplex isoliert und gereinigt erschien monodisperse während mehrere dieser Ansätze erschien ein Aggregationsgrad entweder perturb Partikelintegrität oder verursachen. Am Ende wurden lysiert eine signifikante Anzahl von Zellen nicht, um eine hohe Qualität sicherzustellen Komplex erhalten wurde. Während 40 - 60% Lyse für die Hefe U1 snRNP ideal ist, Optimierung vorgeschlagen wird, wenn dieses Protokoll eine Anwendung<html> neue biologische Komplex. Es war wichtig, die Schritte des Verfahrens zu identifizieren, die Reinigung zu beschleunigen könnte, um sicherzustellen, dass komplexe Integrität nicht durch zelluläre Proteasen kompromittiert wurde, -Untereinheit Dissoziation infolge der Verdünnung und verlängert Inkubation bei 18 ° C während der TEV-Protease-Spaltung. Eine einfache Schrittzeit effiziente Reinigung zu erreichen war, um sicherzustellen, dass Lipide nicht tragen mehr als aus dem frühen Lysat Klärung, da Lipide Fluss während der Schwere Reinigung behindern. Andere Schritte enthalten eine optimale Balance der Menge Harz und Spaltengröße / Abmessungen identifizieren, um eine effiziente Reinigung und einen maximalen Durchsatz zu erzielen. Ein besonders kritischer Schritt war Zeit von Spalten Spaltung durch TEV-Protease zu reduzieren. Die TEV - Protease verwendet wurde , im Haus gereinigt , es war Protease / nukleasefreiem und bei einer hohen Konzentration 17 zu gewährleisten. Signifikante Mengen von TEV-Protease wurden in weniger als einer Stunde zu erhalten, eine vollständige Spaltung verwendet. ontent &quot;&gt; In ersten Proteolyse TAP purifications beobachtet wurde. Die Proteolyse während der Reinigung effizient durch Arbeiten begrenzt werden kann, das Hinzufügen einer Batterie von Inhibitoren, einschließlich in den Reinigungs hohen Salz Wäschen. Eine breite Palette von Protease-Inhibitoren in der ersten Hälfte der Reinigung zugeführt stark verbesserte Protein und komplexer die Stabilität des TAP markiert. Zusätzlich Proteolyse durch Erhöhung der einwertige Konzentration von 300-500 mM während der Zelllyse und IgG Reinigungsschritte minimiert wurde. Selbst bei den obigen Modifikationen an der TAP-Methode eluierte Fraktionen des CBP-Affinitätsharz in ihrem Grad der kompositorischen Homogenität variiert. So selektive Bündelung von Fraktionen aus der zweiten, CBP Chromatographieschritt ab, gerechtfertigt ist. Ein Aspekt der TAP-Methode, die insbesondere Fokus erhalten, war die Bedeutung des nicht-ionischen Detergens NP-40 bis zu komplexen Reinigung und bei einer Konzentration oberhalb seiner CMC. Das Vorhandensein von NP-40 bei einer Konzentration von 0,08% oder höher hatte eine Gesamtvorteilhafte Wirkung auf komplexe Integrität und die Endausbeute. Die scheinbare positive Wirkung (en) von NP-40 kann teilweise zur Verringerung der nicht-spezifischen Wechselwirkungen zwischen Harz und dem Komplex zurückzuführen sein. Während NP-40 eine vorteilhafte Wirkung bei der Reinigung zu haben scheint, könnte es ohne dass komplexe Aggregations Nachreinigung entfernt werden. Schließlich kritisch, die TAP-Methode für die strukturelle Studie wurden mehrere komplementäre Assays zur Optimierung verwendet, um die Integrität und Homogenität des Komplexes zu bewerten. Dazu gehörten Lichtstreuung, SDS und native PAGE sondiert den TAP-Antikörper durch Western-Blot und / oder gefärbt mit Fluoreszenzfarbstoffen, sowie negative stain Elektronenmikroskopie. Die Änderungen an den TAP-Verfahren hierin detailliert, ergab eine homogene Komplex in ausreichender Menge für die Elektronenmikroskopie. Weitere Änderungen müssen insbesondere für andere Komplexe, an die TAP-Verfahren hergestellt werden, eine davon abhaltenmung der Bedeutung von NP-40. Zusammenfassend kann die TAP-Reinigungsverfahren verwendet werden, makromolekulare Komplexe aus einer eukaryotischen Quelle geeigneter Qualität für die Strukturuntersuchung, um erfolgreich zu reinigen. Wir haben ein geeigneter Ansatz für die Reinigung des S. etabliert cerevisiae U1 snRNP und detailliert die Schritte , sowie die Gründe für viele dieser Änderungen übernommen. Für andere Komplexe, schlagen wir vor, dass der Prüfer in ähnlicher Weise die Schritte in dem Protokoll zu erkunden, die ausreichende Mengen und Qualität komplexer ergeben kann. Die Schritte, die umfassen Zelllyse untersucht werden sollten, Salz und additive Art und Konzentrationen einschließlich Detergens und Empfindlichkeit des Komplexes an Calcium- und Metallchelator EGTA. Ferner ist es von entscheidender Bedeutung für Langzeitstudien, dass der Komplex eingefroren und aufgetaut werden können, ohne Struktur stören. Wichtig ist, dass man mehrere alternative Möglichkeiten, die Struktur des Komplexes zu untersuchen, während und nach der Reinigung. Einheimische einnd SDS-PAGE, negativen Fleck EM und Lichtstreuung haben uns gut gedient in unserer Untersuchung, wie am besten zu einem homogenen Komplex mit dem TAP-Verfahren zu reinigen.

Viele wichtige zelluläre Prozesse werden 1 von großen Protein- und Protein-RNA - Komplexen durchgeführt. Ein wesentlicher Engpass biophysikalische und strukturelle Untersuchungen solcher Komplexe zur Durchführung wird sie in geeigneter Qualität (dh Homogenität) und in einer geeigneten Konzentration zu erhalten. Isolieren eines Komplexes aus einer natürlichen Quelle hat viele Vorteile, einschließlich der Beibehaltung relevanten posttranskriptionales und / oder translationale Modifikationen von Untereinheiten und die richtige komplexe Montage sicherstellt. Jedoch sind große Zellkomplexe oft in einer Zelle bei einer niedrigen Kopienzahl und die Reinigung müssen unter nahezu physiologischen Bedingungen sehr leistungsfähig und treten komplex Integrität sicherzustellen aufrechterhalten wird. Reinigung eines Komplexes aus einer eukaryotischen Quelle ist eine besondere Herausforderung und kann finanziell untragbar sein. So Strategien oder Methoden, die eine homogene komplexe effiziente und ergeben sind sehr erwünscht. Eine Strategie, die warerfolgreiche einheimische Komplexe aus eukaryotischen Zellen für ihre anfängliche Charakterisierung bei der Reinigung ist die Tandem Affinity Purification (TAP) Methode 2,3. Die TAP - Methode wurde zunächst mit zusammenwirkenden Faktor (en) 2 ein natives Protein aus der Bäckerhefe (S. cerevisiae) in Komplex zu reinigen , erdacht. Die TAP-Methode zwei Tags verwendet, jedes Tag in tandem mit dem gleichen Protein-kodierenden Gensequenz fusioniert. Die Tags wurden so ausgewählt, dass eine Notwendigkeit für enge und selektive Bindung an ein Affinitätsharz mit dem Wunsch, in der Nähe von physiologischen Lösung Bedingungen aufrechtzuerhalten auszubalancieren. Diese Balance dient, mit zusammenwirkenden Faktor (en) für die Nachreinigung Charakterisierung stabile Wechselwirkung (en) des markierten Proteins zu bewahren. Die genomisch integriert TAP-Tag am Ende (C-terminal) einer Protein-kodierenden Gens plaziert wurde, und bestand aus einer Sequenz, codierend für ein Calmodulin bindendes Peptid (CBP), gefolgt von einer Protein - ein Zusatz von etwas mehr als 20 kDa zu dem markierten Eiweiß. CBP ist kurz, 26 Aminosäuren und durch die ~ 17 kDa Protein Calmodulin (CaM) in Gegenwart von Calcium mit einem K D in der Größenordnung von 10 -9 M 4 erfasst. Das Protein A-Tag größer ist, bestehend aus zwei Wiederholungen von 58 Resten mit einer kurzen Linker zwischen den Wiederholungen. Jeweils 58 Aminosäure repeat wird durch Immunglobulin G (IgG) mit einer K D ~ 10 -8 M 5 erfasst. Zwischen diesen beiden Tags wurde eine Erkennungsstelle für TEV - Protease eingebaut, eine Endopeptidase aus dem Tabakätzvirus 6,7. Wie in Figur 1 dargestellt ist , in der ersten Affinitätsschritt des Verfahrens wird die TAP - Protein markiert ist mit einem IgG - Harz über das Protein A gebunden Das markierte Protein , das durch Spaltung an der Säule bei der Zugabe von TEV - Protease eluiert, ortsspezifisch zu spalten zwischen die beiden Tags. Dies ist ein notwendiger Schritt, da die Interaktion von IgG und Protein A ist sehr stark und nur hinreichend unter denaturierenden Lösungsbedingungen gestört werden kann. In Ermangelung eines Protein : Tag wird das Protein zu CaM Harz in Gegenwart von Calcium gebunden und aus diesem Harz unter Zugabe des Metallionenchelator EGTA (Ethylenglykoltetrasäure) (Abbildung 1) eluiert. Bald nach der Einführung des TAP - Methode, es in einer groß angelegten Studie verwendet wurde , eine &quot;Karte&quot; der komplexen Wechselwirkungen in S. zu erzeugen cerevisiae 8. Wichtig ist markiert, als Folge dieser Bemühungen eine ganze Hefe-TAP Tagged Open Reading Frame (ORF) Bibliothek sowie einzelne TAP ORFs 9 von einer kommerziellen Quelle erhältlich sind. Somit kann man jede Hefestamm mit einem markierten Proteins für jede Hefe-Komplex erhalten. Die TAP - Verfahren angetrieben auch Modifikationen oder Variationen des TAP - Tag, einschließlich: seine Verwendung zur Reinigung von Komplexen aus anderen eukaryotischen als auch Bakterienzellen 10,11; der Entwurf eines &quot;Split - Tag&quot;, bei dem das Protein A und CBP auf verschiedene Proteine ​​12 platziert sind; und tags verändert, um so die Notwendigkeit des Prüfers, wie Empfindlichkeit des Komplexes zu Ca 2+ oder EGTA 13 aufzunehmen. Jüngste Fortschritte in sowohl Instrumentierung und Methodik haben zu erheblichen Fortschritten bei der Anwendung der Elektronenmikroskopie (EM) führte zur Strukturbestimmung, die zu hohen, in der Nähe von atomarer Auflösung Bilder von makromolekularen Komplexen 14 geführt. Die erreichbare Auflösung eines Komplexes von EM bleibt jedoch, die von der Qualität des Komplexes untersucht. Diese Studie hat die TAP - Tag Ansatz genutzt von S. zu reinigen cerevisiae die U1 snRNP, ein 18-Untereinheit (~ 0,8 MDA) geringer Kopienzahl Ribonukleoproteinkomplex , die Teil des Spliceosoms 15,16 ist. Eine Reihe von Schritten wurden unternommen, um diesen Komplex zu reinigen, so daß sie homogen und einer ausreichenden Konzentration vorliegt. Potenzielle Probleme in verschiedenen Stadien der Reinigung begegnet werden beschrieben und Strategien chall zu überwinden ergriffenEnges hervorgehoben. Durch die sorgfältige Bewertung und Schritte bei der Reinigung zu optimieren, gereinigt das U1 snRNP ist von einer Qualität und einer Menge geeignet für negative Färbung und Elektronen Kryo (Kryo-EM) Studien. Eine optimierte TAP Methode Protokoll für die Reinigung von nativen Komplexe für Strukturuntersuchungen wird hier beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae TAP tagged strain</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>YSC1177</td>
			<td>This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3&#916;1, leu2&#916;0, met15&#916;0, ura3&#916;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coffee grinder</td>
			<td>Mr. Coffee</td>
			<td>IDS77</td>
			<td>Used for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer, Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Used to assess cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA 9.100 centrifuge rotor&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to harvest the yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JA 20 fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to further clear the soluble cell extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>R5355</td>
			<td>Temperature controlled shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex gel system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td>Sepharose 6 fast flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin resin</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>214303</td>
			<td>Affinity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail, mini tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>589297</td>
			<td>Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail, large tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5892953</td>
			<td>cOmplete ultra EDTA-free tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolved in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Bio-spin column</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>7326008</td>
			<td>Used to pack and wash the Calmodulin resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL poly-prep column</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>7311550</td>
			<td>Used to pack and wash the IgG resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast native PAGE Bis-Tris gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>BN1002</td>
			<td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 &#956;L for a silver stained gel and 5 &#956;L for a SYPRO Ruby stained gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast SDS PAGE Bis-Tris gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26614</td>
			<td>Unstained protein standard used for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS running buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAB1001</td>
			<td>Primary antibody against CBP tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31341</td>
			<td>Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34042</td>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialaysis units</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88401</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units, 100kDa MWCO</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC5100008</td>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent absorbing beads</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>1523920</td>
			<td>Bio-bead SM-2 absorbants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S-7564</td>
			<td>Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-12000</td>
			<td>Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G400-CP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method

Affinitätsreinigung Ansätze wurden erfolgreich für Proteomik Charakterisierung zu isolieren nativen Komplexe. Strukturelle Heterogenität und ein gewisses Maß an Heterogenität der Zusammensetzung eines Komplexes nicht behindern in der Regel Fortschritte in solchen Studien durch. Im Gegensatz dazu ist ein Komplex für die strukturelle Charakterisierung bestimmt sind, sollten in einem Zustand gereinigt werden, die sowohl kompositionell und strukturell homogener als auch in einer höheren Konzentration als für die Proteomik erforderlich ist. Seit kurzem gibt es für die Strukturbestimmung großer makromolekularer Komplexe in der Anwendung von Elektronenmikroskopie signifikante Fortschritte. Dies hat das Interesse an Ansätzen erhöhte auf native Komplexe von ausreichender Qualität und Quantität für die Strukturbestimmung mittels Elektronenmikroskopie zu reinigen. Die Tandem Affinity Purification (TAP) Verfahren optimiert wurde , um eine 18-Untereinheit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein Montage von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) zu extrahieren und zu reinigen </em&gt; geeignet für negative Färbung und Elektronen Kryo-Mikroskopie. Hierbei wird detailliert die an die TAP-Methode vorgenommenen Änderungen, die Gründe für diese Änderungen vorgenommen haben, und die Ansätze für eine kompositorisch und strukturell homogenen Komplex Assay genommen.

Eine modifizierte TAP Methode wurde verwendet , von S. zu reinigen cerevisiae die U1 snRNP, einen 18-Untereinheit Ribonukleoproteinkomplex. Eine anfängliche TAP Reinigung des Komplexes nach dem veröffentlichten Protokoll 2,3 ergab einen Komplex, der heterogene erschienen, die Migration als drei Bänder auf einem silbergefärbten nativen Polyacrylamidgel (2A). Mehrere Runden der Optimierung des TAP - Methode ergab einen Komplex, der in erster Linie als eine einzelne Bande auf einem nativen Gel , welches eine homogenere Anordnung (2A) migriert. Fluoreszenzfarbstoffe Verwendung sowohl für Protein und Nukleinsäure zu färben, wurde festgestellt , dass das gereinigte Komplex beide Biopolymere hatte vorhanden (2B). Der gereinigte Komplex wurde auch durch SDS PAGE und Western - Blotting unter Verwendung eines TAP - Tag - Antikörper (3A) analysiert. In Übereinstimmung mit den native Gel Ergebnis zeigte der Komplex gereinigt gemäß dem veröffentlichten Protokoll markiert Proteolyse des TAP-Protein (Snu71). Die Menge der Proteolyse wurde jedoch signifikant mit Änderungen des TAP-Methode reduziert. Fast alle der siebzehn Proteine ​​in der U1 snRNP - Komplexes wurden durch SDS - PAGE aufgelöst und positiv durch MALDI - Massenspektrometrie (3B) identifiziert. Sowie nativen und SDS PAGE, wurden komplexe Qualität in verschiedenen Stadien der Reinigung durch Negativfärbung - Elektronenmikroskopie (Abbildung 4) bewertet. Die monodispersen Teilchen beobachtet in 4A und B , aber abwesend von 4C sind Beispiele für eine gute Probe für strukturelle Studie. Diese Analysemethode kritische Meinung über die Auswirkungen von Änderungen an den TAP-Methode. Die TAP-Methode fordert die Einbeziehung des nicht-ionischen Detergens NP-40 und bei einer concentration über dem von seiner kritischen Mizellenkonzentration (CMC). Die Robustheit der Verfahren zur Beurteilung der Qualität des Komplexes in dem Protokoll beschrieben sind , auch durch ein Experiment gezeigt , in dem das zwitterionische Tensid CHAPS, Glycerin oder kein Cosolvens für NP-40 ersetzt wurden in allen Puffern (Abbildung 5). Durch die native PAGE und negative Fleck EM, wird die U1 snRNP meisten homogen und stabil in NP-40 mit abnehmenden Stabilität von Chaps kein Co-Lösungsmittel zugegeben zu Glycerin. Es könnte sein, dass die Hefe U1 snRNP eine hydrophobe Fläche aufweist, und das Vorhandensein von NP-40 verhindert die Aggregation durch diese Oberflächenbeschichtung. Leider NP-40 nicht durch Dialyse und Konzentrierung des Komplexes entfernt werden, wird dann die NP-40 konzentrieren. Während die höhere NP-40 nicht um den Komplex zu stören schienen, hat es sich negativ auf das Einfrieren des Partikels in glasartigem Eis für Kryo-EM und großen Mizellen-ähnliche Aggregate auswirken beobachtet wurden. Waschmittel absorbierenden Kügelchen wurden erfolgreich r verwendetemove die Mehrheit der NP-40 von der U1 snRNP Probe ohne auftretende den Komplex strukturell auswirken. Nach der Reinigung des Komplexes mit den Detailmodifikationen in dem Protokoll, ein Komplex geeignet für sowohl negative stain und Kryo-EM wurde erhalten, wie von Bildern des Rasens von Partikeln und Unterscheidungs ​​repräsentative Klasse Mittelwerte (Abbildung 6) belegt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig1.jpg" /> Abbildung 1. Übersicht über Tandem Affinity Purification (TAP) Methode. (A) Schematische Darstellung des Zwei - Schritt - TAP - Methode. Komplexe von Interesse (grau) eine TAP markierte Untereinheit (schwarz; U1 snRNP Untereinheit Snu71) genomisch mit einer Sequenz eines Calmodulin-Bindungspeptid (CBP, grün), eine Erkennungsstelle für die ortsspezifische Protease TEV (blau) umfasste verschmolzen, und zwei IgG-Bindungsregionen von Protein A (Pr A<html> , Rot). Im ersten Schritt wird Zelllysat mit einem IgG-Harz inkubiert, und der Komplex wird durch seine Wechselwirkung mit dem Protein A-Sequenz beibehalten. Der Komplex wird aus dem Harz durch TEV vermittelte Spaltung freigesetzt. Im 2. Schritt wird der Komplex mit einem Harz Calmodulin inkubiert, einem Ca 2+ abhängigen Reaktion. Der Komplex wird durch Zugabe des Chelators EGTA Ca 2+ freigelassen. (B) Western - Blot nach einem TAP markierte Protein durch die Reinigungsschritte in (A) dargestellt ist . Proben wurden von Zelllysat genommen, nach dem ersten Schritt, und nach dem zweiten Schritt des TAP-Methode. Das reaktive Protein in Zellysat beobachtet wandert schneller nach dem ersten Schritt, Spaltung folgende TEV - Protease und damit Verlust der Protein - A - Sequenz. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ure 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54389 / 54389fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Optimierung der TAP - Methode. (A) Silber gefärbten nativen Gel von TAP - Komplexe gereinigt. Native PAGE: Proteinstandard (Spur 1); Komplex gereinigt nach original TAP Methode 3 (Spur 2), drei Banden beobachtet (Pfeile); drei aufeinanderfolgenden Elutionen aus demselben TAP Reinigung folgende Änderungen zu puffern, zwei Banden beobachtet (Pfeile) (Bahnen 3 bis 5); weitere Änderungen an der TAP - Methode, die Migration bei ~ 800 kDa in erster Linie eine einzige komplexe Bande ergibt (Spur 6). (B) Analyse der Zusammensetzung eines gereinigten Komplex , der durch einen einzelnen Gelspur mit sowohl Protein- und RNA reaktiven Flecken Anfärbung. Native PAGE: Proteinstandard (Spur 1) mit einem Protein fluoreszierenden Farbstoff gefärbt; Komplex abzubildenden mit Protein Fluoreszenzfarbstoff (Spur 2), zwei Banden beobachtet; Fahrspur in Spur 2, jetzt mit einer Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoff (Spur 3) abgebildet wird, zwei Banden beobachtet; und Fluoreszenzsignal überlag von gefärbten Komplex in den Bahnen 2 und 3 (Bahn 4). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig3.jpg" /> Abbildung 3. Optimierung der TAP - Methode. (A) Western - Blot - Analyse der Verbesserung der komplexen Qualität, etikettiert folgende TAP - Untereinheit Snu71 mit α-TAP - Antikörper sondiert. Mehrere proteolysiertes Banden sichtbar sind zunächst (Spur 1) , aber Verbesserungen reduzieren die Menge der unteren Bänder erheblich (Bahnen 2 und 3). (B) Eine repräsentative SDS - Gel mit einem fluoreszierenden Protein - Gel - Färbung gefärbt. Gel löst 12 der 17 Proteinuntereinheiten des Komplexes. Identität des Proteins in den Banden wurde durch Massenspektrometrie etabliert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig3large.jpg" target="_blank">eine larg anzuzeigen</a>er Version dieser Figur. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig4.jpg" /> Abbildung 4. Probenqualität in den Stadien in der TAP - Methode ermittelt durch Negative Stain Elektronenmikroskopie Beurteilung durch eine Negativfärbung - Elektronenmikroskopie komplexer nach. (A) die 1. Stufe des TAP, (B) der 2. Stufe von TAP; (C ) Komplex destabilisiert. Maßstabsbalken, 125 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig5.jpg" /> Abbildung 5. Auswirkungen auf die Probenqualität Zusatzstoffe in TAP Methode Puffer Lanes . 1 - 4 sind die ersten vier Eluierungen des letzten oder 2. Stufe der TAP Reinigung von complex in Gegenwart von gereinigtem: (A) das nicht-ionische Waschmittel Nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analysiert durch native PAGE (oben) und negativen Fleck EM (unten), (B) das zwitterionische Waschmittel 3 - [(3- Cholamidopropyl) dimethylammonium] -1-propansulfonat (CHAPS), analysiert durch native PAGE (oben) und negativen Fleck EM (unten), (C) Glycerin, analysiert durch native PAGE (oben) und negativen Fleck EM (unten); und (D) kein Additiv, analysiert durch native PAGE (oben) und negativen Fleck EM (unten). Maßstabsbalken, 50 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54389/54389fig6.jpg" /> Abbildung 6. Visualisierung von TAP - Methode gereinigt Complex. (A) nach oben, ein repräsentatives Bild eines negativen Fleck Elektronen microscopy (EM) mikroskopische Aufnahme. Beobachtet ist ein Rasen von ähnlich geformten Teilchen, zwei sind eingerahmt, durch die optimierte TAP-Verfahren gereinigt. Unten, eine Auswahl der Klasse Mittelwerte der Partikel genommen, die Partikelscheidungsmerkmale hervorzuheben. Maßstabsbalken, 50 nm. (B) nach oben, ein repräsentatives Bild eines Kryo-EM mikroskopische Aufnahme. Beobachtete sind Bereiche höherer Kontrast repräsentativ für Teilchen, boxed zwei solche Regionen zu sehen. Unten, Klasse Mittelwerte von ausgewählten Teilchen in glasigen Eis gefroren. Maßstabsbalken, 50 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54389/54389fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Aufrufe.  Brandeis University. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies. 

Serie: Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

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Biologie

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...