בתמיכת DA034783 NIH / NIDA. אנו מודים בריאן א קילינגר לקבלת סיוע טכני עם-עמוד multimer.

1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של 4x חיץ מדגם BN-עמוד (200 מ&quot;מ Bis (2-hydroxyethyl) אמינו-טריס (hydroxymethyl) מתאן (BIS-טריס), 200 מ&quot;מ NaCl, 40% w / גליצרול נ, 0.004% Ponceau S, pH 7.2 ). הערה: פתרון מניות זה עשוי להתבצע מראש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 250 μL של חיץ מדגם 4x ב 750 μL DH 2 O המכילים מעכבי פרוטאז קוקטייל מסחרי 1x. וורטקס ומקררים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize 20 מ&quot;ג של רקמת היעד מ&quot;ל 1x 1 קרים כקרח חיץ מדגם BN-עמוד עם 30 משיכות של homogenizer dounce נקי. הערה: לצורך ניסוי הפגנה זו, רקמת היעד היא רקמת מוח עכברוש כולו. לאחר הומוגניזציה, דגימות ניתן לטפל עם כזה חומר ניקוי עדין כמו 2% digitonin כדי solubilize ולהתיר אלקטרופורזה של חלבונים בממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את homogenate אל צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 30 דקות עד גלולת תוכן סלולארי מסיס. Afteצנטריפוגה r, למזוג supernatant לתוך צינור נקי על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד ריכוז חלבון supernatant באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) או assay quantitation חלבון דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם homogenate (ים) מכילים חומר ניקוי, להוסיף כמות 5% Coomassie כחול G-250 בתמיסה מימית מספיק כדי להביא את הפתרון homogenate ל 0.25% Coomassie. </li></ol> 2. BN-עמוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 25 מ&quot;ל 20x ילידי כחול (BN) אלקטרופורזה למלאי (1.0 M Bis-טריס, 1.0 M tricine, pH 6.8) לתוך 475 מ&quot;ל DH 2 O המכיל 0.002% Coomassie כחול לעשות 500 מ&quot;ל של חיץ ריצה 1x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילים חומר ניקוי, במקום לעשות 250 מ&quot;ל של חיץ ריצה 1x המכיל 0.02% Coomassie ועוד 250 מ&quot;ל המכיל אף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ צ&#39;יל (ים) 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה ולהרכיב ג&#39;ל polyacrylamide לשפוך קלטת בהתאם להוראות היצרן. </li><li&gt; יוצק ג&#39;ל polyacrylamide BN (3% בשכבת T ערמה, 6% T שכבת יישוב) על פי מתכון סטנדרטי 7, ולמקם את המסרק היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;לים יש polymerized, יש לשטוף את הקלטת עם DH 2 O ולהרכיב מנגנון אלקטרופורזה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המסרק היטב ולמלא את הבארות עם 1x חיץ ריצת BN-עמוד. הימנע מילוי החדר הפנימי כולו עם חיץ עד דגימות נטענות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילות חומר ניקוי, למלא את הבארות עם המאגר המכיל 0.02% Coomassie כחולים. הערה: בצע שלבים 2.7-2.9 ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טיפים ג&#39;ל טעינה, פיפטה בנפח של homogenate המכיל 20 מיקרוגרם של חלבון לתוך הבארות הרצויות. פיפטה בהיקף שווה ערך של חיץ מדגם BN-עמוד 1x לתוך כל בארות בשימוש. הערה: השתמש ריכוז החלבון נקבע מן assay BCA לחשב נפח מתאים של homogenate להוסיףהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגימות נטענות, למלא את התא הפנימי עם חיץ ריצת BN-עמוד 1x. הקפד הג&#39;ל הוא שקוע לגמרי במאגר. הבא, למלא את החדר החיצוני עם חיץ ריצת 1x לרמה שצוינה על ידי היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילים חומר ניקוי, למלא את התא הפנימי עם חיץ 1x המכיל 0.02% Coomassie כחול, ואת החדר החיצוני עם חיץ ריצה 1x צבע ללא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את האלקטרודות על אספקת החשמל, וכן electrophorese החלבונים הג&#39;ל על 150 V עד הלהקה צבע מתקדמת ~ 2 ס&quot;מ לתוך שכבת לפתרון. עצור לנתק את אספקת החשמל. </li></ol> 3. cross-linking הערה: בצע שלבים 3.1-3.6 ב 4 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את מנגנון אלקטרופורזה, ולהפריד את שמשות הזכוכית של קלטת ג&#39;ל. סר וזורק את שכבת הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך את הג&#39;ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית צבע. לקחתאכפת לעשות חתך זה כמו חלק וישר ככל האפשר, ולאחר מכן למחוק את החתיכה בשימוש של ג&#39;ל. זה ישאיר ~ 2 ס&quot;מ רוחב, רצועה אופקית של ג&#39;ל polyacrylamide, אשר יכיל את כל החלבון במדגם homogenate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך משם שום חלקים בשימוש לאורך הקצוות של רצועת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום רצועת לתוך בופר פוספט 10 מ&quot;ל (PBS) במיכל קטן, ומערבבים בעדינות ידי nutation למשך 30 דקות כדי לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איזון, להשליך ולהחליף את PBS עם 10 אחר מ&quot;ל. פיפטה 500 μL של 25 מ&quot;מ DSP מומס sulfoxide דימתיל לתוך PBS, וממשיכים לערבב כמו לעיל (שלב 3.4) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פתרון DSP. להוסיף 10 מ&quot;ל של 0.375 M טריס (hydroxymethyl) הידרוכלוריד aminomethane (Tris-HCl), pH 8.8, המכיל סולפט dodecyl 2% נתרן (SDS) כדי להרוות את DSP unreacted. המשך nutation עבור 15 דקות. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד רצועת הג&#39;ל מרווה, להכין SDS-PAפתרונות ג&#39;ל GE פי שיטות סטנדרטיות 9. אל תוסיף ריאגנטים פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המרווה, להחזיר את רצועת ג&#39;ל ΒΝ לטמפרטורת חדר, והטיל את הרצועה לתוך קלטת ג&#39;ל חדשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, בזהירות להרים את ג&#39;ל ולמקם אותו לצלחת spacer קלטת ג&#39;ל נקיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט הרצועה כך התחתון של חזית הצבע הוא קרוב ביותר אל גבי קלטת חדשה (כלומר, בצד כי נסע רחוקה במהלך-העמוד BN יש קרוב העליון של הקלטת החדשה; רצועת ג&#39;ל יש התהפכה מ שלה לפני נטייה). ראה איור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הרצועה כך הקצה העליון שלה טמון גם עם שם בקצה העליון של הצלחת לכסות יהיה (כלומר, זה יהיה בראש של ג&#39;ל החדש). ודא מול צבע מקביל הקצוות האופקיים של צלחת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Push צד אחד של הרצועה ניכרה נגד אחד קירות spacer, ומשאיר מקום על tהוא הצד השני של ג&#39;ל יימזג ורמת חלבון או סולם כדי לטעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקצה התחתון של רצועת ג&#39;ל המכיל כל אזורים משוננים או לא אחידים, בזהירות לחתוך אותם. אם הווה, הם יהיו בועות מלכודות במהלך ג&#39;ל לשפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ברצועת ג&#39;ל ממוקמת כראוי, להניח את הצלחת לכסות על צלחת spacer. להפעיל לחץ עדין כדי לדחוף את כל בועות אוויר שנלכדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להרכיב מנגנון מזיגת ג&#39;ל על פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריאגנטים פילמור למאגר ג&#39;ל לפתרון, ושופכים אותו לתוך קלטת ג&#39;ל מוכן, בעזרת פיפטה סרולוגיות. מלא את קלטת ג&#39;ל אל ~ 2 סנטימטרים מתחת לרצועת ג&#39;ל BN-עמוד הניכר, כדי להשאיר מקום לשכבת הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL butanol מעל הג&#39;ל נשפך, ולאפשר 30 דקות עבור פילמור של השכבה לפתרון. יוצקים את butanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריאגנטים פילמור לפתרון ג&#39;ל הערמה. באמצעות serologפיפטה iCal, שופכים את השכבה בערימה כדי למלא את כל החלל הריק שנותר קלטת ג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את קלטת ג&#39;ל כשכבת הערמה היא שפכה כדי שימלא את החלל מתחת לרצועת ג&#39;ל, ובועות אוויר לא לכודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל החיץ לערום ג&#39;ל הממלא את חלל הריק מתחת לרצועת ג&#39;ל, בהדרגה להחזיר את קלטת ג&#39;ל אל בסיס רמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך למלא את החלל הריק ליד רצועת ג&#39;ל נכרת עם חיץ ג&#39;ל הערמה, עד שהוא כמעט גולש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שכבת לערום לפלמר עבור 30 דקות. הערה: הפוך חיץ ריצה 10x SDS-PAGE (250 מ&quot;מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס), 1.9 מ &#39;גליצין, 1% SDS) בעוד ג&#39;ל הוא polymerizing. זה יכול להיות גם מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 מ&quot;ל 10X SDS-PAGE ריצה חיץ המניות לתוך 450 מ&quot;ל DH 2 O לעשות חיץ עובד 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שכבת הערמה יש polymerized, להסיר את קלטת ג&#39;ל מן לשפוךהמנגנון, לשטוף עם DH 2 O, ולהרכיב מנגנון אלקטרופורזה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את החדר הפנימי לגמרי עם חיץ ריצת SDS-PAGE 1x, ולאחר מכן למלא את החדר החיצוני לרמה שצוינה על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענתי את החלל הבא לרצועת ג&#39;ל נכרתה עם סולם משקל מולקולרי או תקן חלבון מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אלקטרודות אספקת החשמל, וכן electrophorese דגימות ב 120 V. כאשר הצבע Coomassie בורח הג&#39;ל, להפסיק ולנתק את אספקת החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הג&#39;ל באמצעות שיטות סטנדרטיות של electroblotting וזיהוי חלבונים על ידי נוגדן מחייב 10. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li><li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry.">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting.">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li><li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis.">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li><li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).</li><li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions.">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li><li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking:+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure.">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate).">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II.">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li></ol>

החוקרים אין לחשוף.

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות עבור כל משימת חי דברים לפועל. מסיבה זו, הם מושא לביקורת ומחקר אינטנסיבי. Multimer-עמוד הוא שיטה חדשנית עבור לכידה, מפריד, וניתוח מגוון רחב של קומפלקסי חלבונים. הוכחנו ישימותה בעבר לומד oligimerization של 11-synuclein α חלבון הקשורים למחלות. עם זאת, היא ניתנת להרחבה ל קומפלקסי חלבונים רבים, כפי שמודגם באיור 2. בהשוואה לשיטות אחרות של לימוד קומפלקסי חלבונים,-עמוד multimer הוא יתרון בגלל הפשטות הקוצרת שלה. שעת ממדגם רקמות כדי להפריד באופן מלא ג&#39;ל SDS הוא כ 8 שעות. מאז הגילוי יכול להיעשות על ידי כתם מערבי טיפוסי, הפרוטוקול יכול להתבצע על lysate רקמות ללא שינוי, עם מגבלות זיהוי נמוכות בהרבה מאלה המשויכים לניסויים נפתחים. בנוסף, רוב labo ביולוגיה מולקולרית מאובזרratories תוכל לבצע את הטכניקה עם השקעה מראש מעט. כפי שנידון מאוחר, רוב האתגר קשור-עמוד multimer מגיע עם פתרון בעיות ואופטימיזציה השיטה עבור כל חלבון מורכב למדו. בעוד-עמוד multimer צריך להיות נגיש את רוב הביולוגים המולקולריים, והצלחתו תלויה מיומנות וניסיון של החוקר. אנושות, חיתוך מחדש הליהוק של רצועת ג&#39;ל BN לתוך ג&#39;ל SDS החדש חייב להיעשות בזהירות. חשוב לכוון את רצועת ג&#39;ל אלקטרופורזה כך גורמת חלבונים להגר לתוך ג&#39;ל SDS להקות במקביל. אם רצועת ג&#39;ל מלוהקת עקומה, להקות החלבון תעבורנה לתוך אחד אחרת נתונים יאבדו. במיוחד עבור קומפלקסים גדולים, מסתובבת רצועת ג&#39;ל לפני שמשליכים אותו לתוך ג&#39;ל SDS-PAGE חשוב דומה. זה נותן מתחמים גדולים, אשר עשויים שלא הגרו מאוד רחוק לתוך הג&#39;ל BN-העמוד, יותר זמן להיות מורמים אל תוך Laye לפתרוןr של ג&#39;ל SDS-PAGE. חשוב לציין, השינויים בגודל חלבון ומאפיינים פיזיים שנגרמו על ידי cross-linking צריך גם לקחת בחשבון בעת ​​ניתוח. לדוגמא, כמה חלבונים בעלי משקל מולקולריים נמוכים, כגון-synuclein α, אינם נשמרים היטב על ממברנות PVDF, אבל oligomers הצולב שלהם הם 12. זה יכול לבלבל ניתוח השוואתי, וחייב להילקח בחשבון. כאשר מפרידים קומפלקס ידי-עמוד multimer בפעם הראשונה, חשוב לאמת את השיטה. אנו מציעים שלוש בדיקות אימות / פתרון בעיות. ראשית, להבטיח כי פפטיד של עניין נודד לתוך הג&#39;ל BN-ידי ביצוע הפרוטוקול-עמוד multimer עד כריתה של רצועת ג&#39;ל, ואז להפסיק, למחוק את הרצועה גבי קרום PVDF, וכן לחקור עבור למקטע של עניין. אם אין אות, המתחם סביר לא נודד לתוך הג&#39;ל BN, ולכן היא צריכה להתבצע נקבובית יותר, או המדגם צריך להיות מותר להעביר הלאה לתוך resolvהשכבה. נוכחות של אות מאשרת כי לפחות יחידת משנה unbound היגרו לתוך הג&#39;ל. בשלב זה, יהיה קשה לאשר את נוכחותו של מכלול מלא. אם ראיות של יחידת משנה מזוהה ברצועת ג&#39;ל BN, לעבור למבחן השני. בצע multimer-PAGE ללא צעד הצלב, ולאחר מכן כתם על קרום PVDF בדיקה של יחידת משנה. יחידת משנה צריך להכחיש בנוכחות SDS ולהעביר בדרך כלל לתוך SDS ג&#39;ל. אם זה לא קורה, יש כנראה בעיה עם הטכניקה של החוקר. רצועת הג&#39;ל של BN עשויה להיות חתוכה בצורה גרועה, משאירה קצת חלבון מאחור, או שהג&#39;ל SDS עשוי להפיל בצורה לא נכונה. לבסוף, לבצע multimer-PAGE עם שלב הצלב מחברים מקשר לשלב, ואז כתם בדיקה, כפי שפורט באיור 1 . זה מאשש צבירה של המתחם נובע תוספת של DSP, ולא תוצאה בלתי צפויה של חלק אחר של פרוטוקול multimer-PAGE. המחשוף צריך לגרום לצמצוםלהקת ד-עוצמת המצרפי ולהקה מונומר למקטע מוגבר בעצמה על הדמיה. אם אין להקה המצרפי ניבטה אלינו multimer-עמוד רגיל, אבל עליות הלהקה מונומר בעצמה כאשר DSP הוא בקע, המתחם הפך אותו צפוי הג&#39;ל SDS, אבל נכשל בהעברה לתוך השכבה לפתרון. במצב הנוכחי,-עמוד multimer ישים קומפלקסי חלבונים רבים, אבל הוא לא פרוטוקול מידה אחת מתאים לכולם. זה סביר צריך להיות שונה עבור כל מורכבות העניין. בעיה נפוצה אחת מודגם באיור 2: מתחמים שנתפסו הם לעתים קרובות כל כך גדולים שהם בקושי להעביר על-עמוד SDS. זה עשוי להיות מנוהל על ידי שינוי הנקבובי של ג&#39;ל SDS או ביצוע אלקטרופורזה לתקופות זמן ארוכים יותר. סיבוך נוסף הוא הנוכחות המזדמנת של יותר משתי להקות על ג&#39;ל. תגובת Incomplete עם המקשר הצולב יכולה לגרום לחלוקת להקות משקל מולקולריות ביניים 13. זה יכול לעשות את זה DIFficult כדי לקבוע אם להקות מרובות מייצגות ביניים oligomeric חשובים מבחינה פיזיולוגית, או פשוט השלכות בלתי צפויות של cross-linking חלקית. עבור חלבונים בממברנה שחייב solubilized לפני הניתוח, חשוב גם לקחת בחשבון את ההשפעה כי הבחירה של חומר ניקוי יש על ההתנהגויות של קומפלקסי חלבונים. חומר הניקוי כדי solubilize חלבונים בממברנה משפיע התצורות שלהם, עמותות עם שותפים מחייבים, ופונקציות 14, 15. בחירת דטרגנט גם משפיעה על היעילות של cross-linking 16. לפיכך, סביר להניח כי תנאי solubilizing האידיאליים ישתנו עם המורכבות נלמדות. Multimer-עמוד נכשל מדי פעם כדי ללכוד קומפלקס, כפי שמוצג על כתם SDHA ב דהידרוגנז איור 2. succinate הוא חלק ממתחם המיטוכונדריה 124 kDa השנייה, שהוא קטן מספיק כי זה צריך לעבור בקלות לתוך הג&#39;ל.זה לא זוהה מציין כי-עמוד multimer לא הצליח ללכוד אותו. מקרים כגון אלה יש הרבה הסברים אפשריים. רוב cross-linking ריאגנטים מכילים שני קצוות תגובתי, המהווים קשרים קוולנטיים עם שרשרות בצד חומצת אמינו. את היעילות שבה קומפלקסי חלבונים לכידים ריאגנטים cross-linking תלויה בנגישות שלהם שאריות תגובתי. במקרה של DSP, cross-linking מושגת על ידי acylation של קבוצות אמינו אליפטיות עיקריות-חשוף ממס משנית, לרוב הקבוצות ε-אמינו ליזין 17. שאריות ליזין נמצאות בדרך כלל על פני החלבון, אבל התפיסה מזדמנת שלהם במרכזי הידרופובי מקטינה את היעילות של cross-linking 13. יחידות המשנה של קומפלקס II קבורות בתוך קרום המיטוכונדריה, ועשויה להישאר נגיש DSP, גם לאחר solubilization עם digitonin 18. גדולים מאוד בצפיפות-אריזת מתחמים, כגון עמילואיד oligomeRS, עלול גם להגביל את הזמינות של שאריות ליזין השטח כדי ריאגנטים cross-linking. כתוצאה מכך, סוגים אלה של מכלולי חלבון עלולים לא להיות תואמים-עמוד multimer. אפשר גם כי Coomassie כחול, אשר נקשר לאזורים הידרופובי ושאריות קטיוני, משתהה לאחר איזון ב PBS וחוסם cross-linking ובמקרים מסוימים 19. זה עשוי להקטין או למנוע גילוי של oligomers מושפע-עמוד multimer. לכן, השיטה אינה assay אוניברסלי עבור המאפיינת את כל האסוציאציות חלבון, ולא צריך להיחשב שבו לכמת ב הרצוי. עם זאת,-עמוד multimer הוא כלי מהיר וזול, יחסית לניתוח מתחמי חלבון, ועשוי להיחשב לצד אמצעים אחרים שהוקמו.

<html> פונקציה סלולרית רגילה תלויה אינטראקציות חלבון-חלבון 1, 2. כתוצאה מכך, מחל אנושיות מסומנות לעתים קרובות על ידי הפרעות באסיפה וההתנהגות של קומפלקסי חלבונים שונים 3. היכולת לאפיין אינטראקציות כזה ולכן הוא קריטי. נוכחי אמצעי לגילוי אינטראקציות אלה דורשים טיהור של חלבונים היעד, לעתים קרובות ואחריו הנפתח של השותפים באינטראקציה שלהם. טיהור קונבנציונלית מושג על ידי צנטריפוגה הפרש, משקעים, ו / או כרומטוגרפיה 4. שיטות אלה הן זמן רב, יש לשנותו לכל חלבון מטרה, ולעתים קרובות לגרום תשואות נמוכות. שיטות לטיהור מודרניות לערב את ההיתוך של תגי פפטיד למקד חלבונים, ואחריו immunoprecipitation או חילוץ על עמודות עמוסות חרוזים מאוגדים מולקולה לכידה 5,&quot;&gt; 6. אמנם זה להרחבה לחלבונים רבים, זה דורש שינוי רצף של היעד, וכתוצאה מכך לגרום מבנים שונים בזיקת השותפים המחייבים הרגיל שלהם. האופי העדין של כמה אינטראקציות חלבון-חלבון אומר ששיטה זו לא יכולה להיות רלוונטית לתרחישים רבים. בנוסף, מבחני הנפתח משמשים למיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא יכולים ללכוד תמונת הסלולר מדויקת, בשל מעלות מוגבלות של חופש ורמות שאינם ילידים של חלבון הפיתיון. באופן אידיאלי, מתחמי החלבון ניתן היה לזהות מדינות האם שלהם, ללא צורך טיהור או הנפתח. ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) פותחה כחלופה פחות-denaturing כדי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ומאפשר הפרדה של כמה חלבונים מתחמי מ דגימות ביולוגיות 7. עם זאת, חלבונים ב-עמוד BN להפריד מבוסס על לארGE מספר משתנים, כולל גודל, מטען, תלת ממדי המבנה, והקשר עם מולקולות אחרות. האינטראקציות של הגורמים הללו לעתים לגרום שיתוף הפרדת חלבונים, היווצרות המצרפי, ורזולוצית להקת חלבון ירודה. דו ממדי ילידים-polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה פותרת חלק, אך לא כולם, של בעיות אלו 8. כדי לעקוף את הסיבוכים הקשורים הפרדה מקומית, חלק מחברים להשתמש ריאגנטים אמינים-reactive cross-linking, כגון dithiobis (propionate succinimidyl) (DSP), כדי ללכוד קומפלקסי חלבוני lysates רקמות 4. lysates מטופלים אלה לאחר מכן ניתן מפוגל מופרד SDS-PAGE, תוך שמירה על הגודל ואיפור יליד מתחמי חלבון. עם זאת, מאז ריאגנטים cross-linking מגיב מבוססים על קרבה של מולקולה אחת לאחרת, וחלבונים ב lysates רקמות יש דרגות חופש רבות ויכולים stochastically אינטראקציה, צלב רקע ספציפי-linking יכול להיות גבוה, במיוחד דגימות מרוכזות. זה יכול להוביל לתוצאות קשות לפרש. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש בשיטה היברידית BN-עמוד / SDS-PAGE, כינה ג&#39;ל אלקטרופורזה multimer-polyacrylamide (multimer-עמוד), להפריד ולהבחין מכלולים החלבון תערובות מורכבות. בתחילה, lysate התא מושעה ב ג&#39;ל polyacrylamide באמצעות BN-עמוד. הג&#39;ל המכילים lysate אז הוא הגיב עם DSP ריאגנט cross-linking. Pseudo-משותק ואינו מופרד מעט על ג&#39;ל, חלבונים הם הרבה פחות סביר להגיב nonspecifically, כלומר תגובתיות רקע צולב מקשר מצטמצמות. לאחר cross-linking, להקות ג&#39;ל הם נכרתו ומופרדים באמצעות SDS-PAGE. הג&#39;ל כתוצאה מכן ניתן לנתח בכל אמצעי הקשורות בדרך כלל ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שיטה זו מאפשרת הפרדה וזיהוי של קומפלקסים חלבונים ילידים lysate רקמות ללא שינוי, ללא צורך טיהור נוסף או למשוך-דאוn.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Chemicals</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">&#949;-Aminocaproic acid</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">164855000</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:336px;">Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0148</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Anti rabbit IgG-HRP from goat</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bicinchoninic acid assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bis-tris</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Butanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Chemiluminescence substrate kit</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Coomassie blue G-250</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Digitonin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D141</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dithiobis(succinimidylpropionate)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dry nonfat milk</td>
			<td style="width:195px;">LabScientific</td>
			<td style="width:119px;">M0841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Glycine</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:195px;">Thermofisher</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144SI-212</td>
			<td>For titration. Caustic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Methanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-4</td>
			<td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Monoclonal anti &#945;-synuclein IgG from rabbit</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-7011-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">N,N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">16479</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">NP40</td>
			<td style="width:195px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Polysorbate 20 (tween-20)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">SDS solution (10% w/v)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L37771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tricine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris base</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Name</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">GE Imagequant LAS 4000</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9558-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:195px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Synergy H1 microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Gel Former + Stand</td>
			<td style="width:195px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">2 mL dounce homogenizer</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ultrasonic tissue homogenizer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB120220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

ישנן שיטות רבות מפותחות לטיהור ולומד חלבונים ופפטידים יחידים. עם זאת, רוב הפונקציות הסלולר מבוצעות על ידי רשתות של קומפלקסי חלבוני אינטראקציה, אשר לעתים קשה לחקור, כי הכבילה אינה ניתן קוולנטיים ומודאג בקלות על ידי טכניקות טיהור. עבודה זו מתארת ​​שיטה של ​​ייצוב ומפריד קומפלקסים חלבונים ילידי מרקמות ללא שינוי באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו מימדי. lysate רקמות נטען על ג&#39;ל polyacrylamide כחול שאינם ילידי-denaturing, אז זרם חשמלי מוחל עד חלבון נודד מרחק קצר לתוך הג&#39;ל. רצועת ג&#39;ל המכיל חלבון שמועבר הוא נכרת אז וטופחו עם אמין-reactive-הצלב המקשר dithiobis ריאגנט (propionate succinimidyl), אשר קוולנטית מייצב קומפלקסים חלבונים. רצועת ג&#39;ל המכיל מתחמי צולבים אז הוא יצוק לתוך ג&#39;ל polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן, ו tהוא מורכב הם מופרדים לחלוטין. השיטה נשענת על טכניקות וחומרים המוכרים לרוב הביולוגים המולקולריים, כלומר היא זולה וקלה ללמוד. אמנם היא מוגבלת ביכולת שלה להפריד בין מכלולים גדולים מאוד, ולא הצליחה באופן אוניברסלי, אבל השיטה היתה מסוגלת ללכוד מגוון רחב של קומפלקסים שנלמדו היטב, וישימה ככל הנראה למערכות רבות של עניין.

בניסוי זה הפגנה, multimer-PAGE בוצע על lysate מוח שלם חולדה. החלבונים שהופרדו כתוצאה מכך היו מסוממים על ממברנות polyvinylidene diflouride (PVDF), ולאחר מכן לחקור עם נוגדנים נגד חלבונים הידועים כדי ליצור קומפלקסים. איור 1 מציג אימות של הפרוטוקול בשני אמצעים. ראשית, אנו מדגימים כי חלבונים צולבים הם מחוספס על ידי תוספת של סוכן הפחתת, כלומר גבוה יותר משקל המולקולרי משקל מיוצרים נוצרות על ידי מגיב חוצה מקשר, ולא בשל כל רכיב אחר של הפרוטוקול ( איור 1 א ) . שנית, אנו מראים כי הצלב המקשר הוא רגיש לתוספת של חומרי ניקוי ( איור 1 ב ), כלומר הצלב לחצות הוא ספציפי חלבונים מורכבים וכי תגובתיות אקראית בשל קרבה על הג&#39;ל ממוזער. איור 2 מראה כי השיטה נכשלת ללכוד respיש תחולה רחבה iratory מורכב השנייה, אבל חוץ מזה ללכידת שני מתחמי מסיסי קרום נכנס. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig1.jpg" /> איור 1: אימות של שיטת multimer-עמוד. (א) Capture של קומפלקסי חלבונים על ידי ג&#39;ל cross-linking עם DSP רגיש מחשוף ידי dithiothretol (DTT). Multimer-עמוד בוצע על lysate שלם חולדה המוח בלי (A1) או עם (A2) 5 מ&quot;מ dithiothretol נכלל הפתרון מרווה טריס / SDS. הג&#39;ל היה electroblotted על ממברנות PVDF, ולאחר מכן נחקר עבור שרשרת kinesin כבד. להקת משקל מולקולרית גבוהה הוא ציין משני ממברנות, מתאימה סביר לכל או חלק מקומפלקס חלבון מנוע kinesin. ישנה להקה נוספת המתרחשת 126 kDa על כתם DTT שטופלו, המסה המולקולרית של הפפטיד שרשרת כבדה kinesin. Dithiothreitol הוא סוכן צמצום, והוא מסוגל להפוך CROSS-linking ידי ביקוע בהווה אג&quot;ח דיסולפיד ב DSP. מצרף kinesin ולכן רגיש מחשוף ידי DTT. (ב) חלבון ללכוד מורכבת רגישה תוספת של denaturing דטרגנטים. Multimer-עמוד בוצע על lysate המוח עכברוש כולו כמתואר בטקסט, למעט כמויות גדלות והולכות (0 עד 2%) של SDS (משמאל) או טריטון X-100 (מימין) נוספו דגימות lysate, ולאחר מכן וטופחו על הקרח עבור 30 דקות לפני טעינת ג&#39;ל הראשון. הג&#39;לים הסופי היו מחק על ממברנות PVDF, ומישש עבור-synuclein α. לפחות שלוש להקות של משקל מולקולרי הגדלת נצפות, המתאים אלפא-synuclein מונומר, tetramer, ו octamer, בהתאמה. עוצמות האות של להקות oligomeric להקטין עם ריכוז חומר ניקוי הגדלה, המציין כי cross-linking יעילות תלוי של קונפורמציה בחלבון ילידים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי VI</a>EW גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig2.jpg" /> איור 2: הפגנה של לכידתו של קומפלקסים חלבונים באמצעות-עמוד multimer. (א) מסיסים ומכלולי חלבון קרום נכנס נתפסו מ- (A) lysate שלם חולדת המוח או (ב) lysate וטופח עם 2% digitonin עבור 1 ש &#39;ב 4 ° C, על ידי ביצוע-עמוד multimer כמתואר בטקסט. הג&#39;לים אז היו מחקו ואת ממברנות PVDF תרו אחרות מרכיבי מתחמים שונים. מיני משקל מולקולריים גבוהים הם נצפו על קרום תרה אחר טובולין acetylated, אשר ידוע לייצב microtubules. Dynein ו kinesin הם קומפלקסי חלבוני מנוע רב למקטע עם משקולות מולקולריות של 1.5 מד&quot;א 380 kDa, בהתאמה. ממברנות תמחינה עבור רכיבים של מתחמים אלה מראים גבוהים מולקולרי משקל מינים. בנוסף, multimer-עמוד בהצלחה ג<html> aptured דימר Hsp90. אלפא-Synuclein טפסי tetramers ו octamers, כמו גם oligomers משקל גבוה מולקולרי הנוירו. Octamer ו פס של מינים-משקל גבוה נתפסים על הקרום המוספג. dimerization VDAC הוא ציין גם. מיני משקל מולקולריים גבוהים מזוהים על ממברנות תמחינה עבור רכיבים של מתחמי המיטוכונדריה I ו- IV. עם זאת, את הממברנה תמחה על SDHA, חבר המורכבים השני, אבל זה לא מוכיחה שום להקת משקל גבוהה מולקולרית מתאימה. AcetTUB: acetylated טובולין α; βTUB: β טובולין; Dynein: שרשרת כבדה dynein; Hsp90: חלבון הלם חום 90; Kinesin: kinesin שרשרת כבדה; NDUFS3: מרכז גופרית-ברזל 3 של קומפלקס המיטוכונדריה לי; VDAC: Porin; SDHA: דהידרוגנז succinate של קומפלקס המיטוכונדריה השנייה; COXIV: מונואמין C ציטוכרום של IV מורכב המיטוכונדריה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> s = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig3.jpg" /> איור 3: תרשים זרימה multimer-עמוד הכללי. (א) הכן lysate רקמות בשיטות הלא denaturing, כגון שמאחד במאגר מדגם BN-עמוד. (ב) lysate פיפטה לתוך הג&#39;ל BN-עמוד, ולאחר מכן לבצע אלקטרופורזה (150 וולט) במאגר ריצה BN-עמוד. אפשר מדגם להעביר עד לחזית צבע העביר ~ 2 ס&quot;מ לתוך הג&#39;ל לפתרון. (ג) הסר את שכבת גדישה חלק יחסי של השכבה לפתרון. (ד) לצלול ברצועת ג&#39;ל ב- PBS, לאזן עם רעד במשך 30 דקות. (E) הסר את PBS, ו מחדש להטביע את רצועת ג&#39;ל PBS המכיל 2.5 מ&quot;מ DSP. Shake עבור 30 דקות. (F) הסר פתרון DSP, ואז שוב להטביע את רצועת ג&#39;ל 375 מ&quot;מ טריס המכיל 2% SDS, ולנער עבור 30 דקות. מתחמים נוכחיים ברצועת ג&#39;ל מיוצבים עכשיו על ידי קורהים-linking. (G) סובב את ג&#39;ל להתפשט 180 ° ומטילים לתוך ג&#39;ל SDS-PAGE החדש. כלול גם ערמה ופתרון שכבות. (H) לפתור מדגם ידי אלקטרופורזה (120 וולט). (I) סר רצועה ג&#39;ל ושכבת ערמה, ולאחר מכן לנתח לפתרון שכבה לפי צורך. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55341/55341fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Views.  Michigan State University.  שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת. 

Video: Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of redox-regulated signaling in biological settings. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is the only direct method to assess free radicals unambiguously. Its advantage is that it detects physiologic levels of specific species with a high specificity, but it does require specialized technology, careful sample preparation, and appropriate controls to ensure accurate interpretation of the data. Cyclic hydroxylamine spin probes react selectively with superoxide or other radicals to generate a nitroxide signal that can be quantified by EPR spectroscopy. Cell-permeable spin probes and spin probes designed to accumulate rapidly in the mitochondria allow for the determination of superoxide concentration in different cellular compartments.
In cultured cells, the use of cell permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) along with and without cell-impermeable superoxide dismutase (SOD) pretreatment, or use of cell-permeable PEG-SOD,&#160;allows for the differentiation of extracellular from cytosolic superoxide. The mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) allows for measurement of mitochondrial ROS (predominantly superoxide).
Spin probes and EPR spectroscopy can also be applied to in vivo models. Superoxide can be detected in extracellular fluids such as blood and alveolar fluid, as well as tissues such as lung tissue. Several methods are presented to process and store tissue for EPR measurements and deliver intravenous 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin probe in vivo. While measurements can be performed at room temperature, samples obtained from in vitro and in vivo models can also be stored at -80 &#176;C and analyzed by EPR at 77 K. The samples can be stored in specialized tubing stable at -80 &#176;C and run at 77 K to enable a practical, efficient, and reproducible method that facilitates storing and transferring samples.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is an unambiguous method to measure free radicals. The use of selective spin probes allows for detection of free radicals in different cellular compartments. We present a practical, efficient method to collect biological samples that facilitate treating, storing, and transferring samples for EPR measurements.

השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...