We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

<ol>
	<li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+spindle+positioning:+cortical+force+generators+in+the+limelight.">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li><li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+divisions,+fate+decisions.">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li><li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly.">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li><li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation.">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li><li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers:+the+role+of+catastrophes.">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li><li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force.">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li><li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles.">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li><li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters.">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li><li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules.">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li><li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos.">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li><li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos.">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li><li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex.">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li><li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans.">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li><li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+mitosis+with+cell+polarity:+Molecular+motors+at+the+cell+cortex.">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li><li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+production+by+disassembling+microtubules.">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li><li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein.">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li><li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae.">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks.">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li><li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations.">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+of+kinesin-5.">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li><li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+function+of+Ase1p:+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins.">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li><li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast.">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules.">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li><li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast.">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone.">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li><li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart.">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li><li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks.">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li><li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division,+meiotic+nuclear+oscillation,+and+cytokinesis+checkpoint+signaling.">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li><li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cortical+Dynein+function.">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li><li>Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+centrosome+isolation+from+cultured+animal+cells.">Method of centrosome isolation from cultured animal cells.</a> Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation.">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells.">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments.">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li><li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis.">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning.">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li><li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast.">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li><li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device.">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

השיטות שתוארו כאן מאמצים אחרונים נוכחיים כדי לשקם צירי mitotic בסיסיים בטיפות אמולסיה מים ב-שמן. לימוד ציר הרכבה בגבולות גיאומטריים מספק יתרונות רבים. מנגנוני משוב חשובים קיימים בין microtubules של ציר mitotic והאילוצים הגיאומטריים שבו הם התאספו. Microtubules יכול ליצור דחף כוחות כאשר הם גדלים לתוך גבולות גיאומטריים, אשר עלול לגרום תזוזת ציר mitotic. בנוסף, גדל לתוך מכשול פיזי יכול לגרום אסונות microtubule. כמו כן, הרכבת ציר בתוך גיאומטריה מוקפת יכולה להוביל דלדול הדרגתי של רכיבים בודדים, כגון טובולין, אשר בתורו משפיע ישירות על צמיחת microtubule שיעור 36. כל אלה הם הגורמים החיוניים של הרכבת ציר, אשר ניתן ללמוד באמצעות המבחנים המתוארים כאן. מבחני המתוארים רגישים מאוד differe ריכוז קטןnces של רכיבי רביב. זהו המקרה עבור טובולין, שבו הבדלי ריכוז קטין יכולים לגרום גם איטית מדי או מהירה מדי צמיחת microtubule. במקרה זה, שיעורי צמיחת microtubule לעתים קרובות יכולים עדיין להיות מתוקנים על ידי התאמת הטמפרטורה במהלך הדקות הראשונות ~ 30 של הניסוי. הרכבה ציר mitotic ומיצוב הוא גם מאוד רגיש לשינויים בריכוז (קליפת המוח) גנרטורים כוח. זה עשוי להיות תלוי ריכוז, טוהר פעילות הרכיבים המטוהרים צריך להיות טיטרציה בזהירות לכל חלבון מטוהרים חדש. בנוסף, פשרות מסוימות צריכות להיעשות במסגרות הדמיה, בהתאם לאופי של assay. בתחילה, רמות גבוהות של הדימרים טובולין פלורסנט מסיסים להקשות microtubules פרט תמונה. כפי microtubules מתארך טובולין מסיס ייגמר לאט, יחס אות לרעש הופך בהדרגה גבוהה ומאפשר ההדמיה של individumicrotubules al. בניגוד setups עם מערכות פתוחות, כליאת הגיאומטריות מונעת חליפין של מולקולות ניאון ורכיבי מערכת נבלות חמצן בתוך מאגר בתפזורת, וכתוצאה מכך ההלבנה משמעותית. במיוחד לניטור ציר הרכבה ומיצוב לאורך זמן, היא נדרשת תמונה עם לעוצמות אור נמוכות, אפילו בנוכחות של מערכת נבלות חמצן חזקה. שיטות אלה מאפשרות הכינון מחדש מלמטה למעלה מבני ציר דמויים פשוטים במבחנה. בנוסף למרכיבים הציגו כאן, גורמים רבים אחרים תוארו להשפיע היווצרות ציר דו קוטבית, מיצוב, נטייה, עיצוב, וכו &#39;3. מערכת זו ניתן להרחיב עוד יותר כדי לחקור את השפעות הפרט בשילוב של גנרטורים כוח נוספים. תורמים חשובים היווצרות ציר שנעדרים כיום ממערכת זו הם הכרומוזומים mitotic. הכרומטין mitotic הוכחהיווצרות ציר ישיר על ידי (1) chromokinesins כי ניתן להפיק מה שמכונה &#39;כוחות-פליטה קוטב&#39; 3, (2) היווצרות של שיפוע RanGTP ידי RCC1 RanGEF הנכנס הכרומטין 38, (3) קינטוכור כי יכול לקיים אינטראקציה עם (depolymerizing microtubules) 39 ו (4) הכרומטין עצמו, שיכול לתפקד כמו קפיץ מכני-בין microtubules מנוגדים 40. לבסוף, המערכת המתוארת כיום מספקת שליטה של ​​זמן ומרחב מוגבלת על הפעילות ולוקליזציה של כוח-גנרטורים הציג. בתאים, גורמי הרכבת ציר רבים למקם את התאים ספציפיים או פעילים תוך זמן-חלון מוגבל. דוגמה בולטת היא הפעילות של dynein, אשר מועשר במיוחד בצד האחורי של ג elegans העובר בשלב אחד התא לקדם מיצוב ציר אסימטרי חלוקת התא. במערכת זו, אנו בוחנים בימים אלה אפשרות מחקה t כזהבאמצעות שיטות של פעילות emporal אסימטרי שהושאל טכניקות אופטו-גנטית. בנוסף, כפי שקורה עבור ג elegans לעובר ותאים עם דופן תא נוקשה, תאים רבים אינם לעגל כלפי מעלה ב מיטוזה. צורת הכליאה הגיאומטרית תהיה השפעה מהותית על הכוחות הפועלים על הציר 41. לכן יהיה חשוב כדי לשקם ציר הרכבה ומיצוב טיפות הלא כדורית כמו גם, באופן פוטנציאלי באמצעות מערכות microfluidic מורכבים יותר, המאפשרים בעיצוב ואחסון של אמולסיה טיפות 42,43. לבסוף, ברקמות, תאים תאים ותא-המצע איתות מצורף לספק רמזים חיצוניים כי ניתן לתרגם אוריינטציה ציר מכוונת, כפי שנצפה לעתים קרובות בתאי אפיתל ותאי גזע. כל היבטים מצומצמים אלה לא נלקחו בחשבון במחקר הנוכחי זה עשוי לספק האתגרים בעתיד לבנות כלפי יותר in vivo-כמו reconstitutions של שנאספו בנוסף ציר mitoticly ומיצוב.

במהלך מיטוזה, הכרומוזומים של הגנום משוכפל מאורגנים בקו המשווה התא כדי להבטיח חלוקה שווה של כרומטידה אחות מעל לתאי הבת שהוקמה זה עתה. מיצוב ובידול כרומוזום מתווכים על ידי זיקתם microtubules ציר שמקורם שני centrosomes המנוגד. בנוסף להבטיח הפצת כרומוזום נאמנת, את הכיוון של ציר mitotic מכתיב גם את חלוקת תא המטוס 1. אורינטציה מתואמת של חלוקת תא חיונית בשלבים רבים של פיתוח עבור הומאוסטזיס רקמות 2. באופן ספציפי, מיקום ציר mitotic מוסדר יכול לגרום החלוקה הסימטרית של תוכן סלולארי או אפילו לייצר תאי בת בגדלים שונים 2. הרכבת וכיוון ציר mitotic מתחילים ב prophase והוא בניצוחו גומלין מורכב בין פעולה וקוממו כוח-גנרטורים 3,4. הכוחות שנוצרו מורכבים בכוחות משיכה ודחיפה oth. כוחות אלה נובעים הם מאנשי קשר ציר עם קליפת התא, כמו גם מתוך הכישור, והוא יכול להיוצר על ידי דינמיקת microtubule כמו גם על ידי מנועים מולקולריים-linkers צלב (איור 1). כוחות דוחפים יכול להיווצר כאשר microtubules לגדול נגד מבנים קשיחים כגון קליפת התא. בהתאם הכח להתנגד הכולל שנוצר במערכת, זה יכול לגרום מחדש של ציר mitotic (כוחות נמוכים) או לעורר קריסת microtubule או אסון (כוחות גבוהים) 5-8. כמות הכח שניתן שנוצרה על ידי דחיפה תלויה באורך microtubule, כיוון שאורך הוא הקובע חזק של microtubule-קריסת 9. בנוסף, microtubules שמקורן centrosome אחד יכול לדחוף כנגד centrosome אחרים, מנגנון אשר הוצע לנהוג הפרדה centrosome ב 3,10 prophase מוקדם. במודעהdition לדחיקת הכוחות שנוצרו על ידי microtubules גדל, microtubule מסתיים פנייה קליפת התא יכול גם לתווך משיכת כוחות 11. מחקרי ממעבדות מרובות הראו כי הפעילות המבוקרת של גנרטורים כוח קליפת מוח נדרשה עבור המיצוב הסימטרי של צירי mitotic in vivo 1. Essential לכוחות המשייכים אלה הוא dynein ציטופלסמית-מקומי הקורטקס (להלן המכונה &quot;dynein &#39;), חלבון מנוע microtubule מינוס סוף מכוון 8,12,13. לדוגמא, ב ניצני שמרים, אינטראקציות לרוחב של dynein קליפת המוח עם תוצאת סריג microtubule ב microtubule מנוע תלוי הזזה לאורך הקורטקס 14. עם זאת, כוחות משיכה קליפת המוח יכול להיווצר גם על ידי היכולת של dynein ליצור התקשרויות-על קץ depolymerizing microtubules 8. האנרגיה שנוצרה על ידי התכווצות microtubule עלולה להוביל כוחות כי הם בדרך כלל בסדר גודל גבוה (~ 50 PN (אסמכתא 15 </sעד&gt;)) מ הכוחות שנוצרו על ידי חלבוני מנוע יחידים (~ 7-8 pN (נ&quot;צ. 16)). מצורף-על סוף dynein קליפת המוח כדי microtubules depolymerizing מקדמת מיצוב ציר בשמרים ניצני 17 ו- C. elegans 13. בין אם הן כוחות משיכה קליפת המוח מונע depolymerization הזזה microtubule תלויי המנוע יכול לשתף פעולה או שייכות לקבוצה אחת בלבד in vivo הוא ידוע כיום. בנוסף לכוחות דוחפים microtubule וכוחות משייכים קליפת מוח בתיווך dynein, מיצוב centrosome נשלט מתוך ציר mitotic ידי חלבונים רבים אחרים. מנועי Kinesin-5, למשל, קיימים כפי tetramers שיכול קשר צולב microtubules interpolar antiparallel, וכתוצאה מכך ההדורה של כוחות זזים כלפי חוץ 18-20. בני משפחת מנוע kinesin-5 נדרשים להפרדת centrosome והרכבה ציר דו קוטבית בכל אאוקריוטים למד, למעט ג elegans<html> (הנסקרת תוך התייחסות 21). יתר על כן,-linkers צלב diffusible משפחת Ase1 / PRC1 ידועים גם למקם חופפים אזורים microtubule של microtubules interpolar in vivo ו במבחנה 22-27. הכוחות שנוצרו על ידי הרחבת מונחת Ase1 של האזור-microtubule החופף הם גדולים מספיק כדי לאזן kinesin-14 כוחות הזזה בתיווך במבחנה 28,29. בתאים, Ase1 / PRC1 נדרש ליצירת יציבה של חופפים אזורים microtubule ב ציר midzone 25-27,30, דבר המצביע על כך הכוחות שנוצרו על ידי-linkers צלב diffusible יכול לתרום באופן משמעותי לארגון כישור. לבסוף, כוחות מן הכרומטין קינטוכור mitotic להשפיע הרכבת ציר mitotic ומיצוב דרך מסלולים שונים 3. מאז רכיבים אלה אינם חלקים מבחני הכינון מחדש המתואר כאן, הם לא יידונו בפירוט. jove_content &quot;&gt; תאוריות שונות קיימים על איך הרכיבים והכוחות המולקולריים השונים המתוארים לעיל פעולת הרכבה ומיצוב ציר, אבל אנחנו עדיין רחוקים מהבנה כמותית. בנוסף ניסויים בתאים חיים, בניסויים במבחנה עם רכיבים מטוהרים לספק עצמה מסלול כדי לעזור להשיג מטרה זו. כאן אנו מציגים מדריך ויזואלי גרסה מותאמת המורחבת של השיטות שפורסמו לאחרונה (Roth et al. 31), שבו צירים בסיסיים מחדש בטיפות אמולסיה מים ב-שמן, מתחיל עם מספר מינימאלי של רכיבים. שימוש בטכניקות microfluidic, טיפות כדור נוצרים עם גדלים כי הם דומים לתאי mitotic. בתוך טיפות אלה, centrosomes ו טובולין מטוהרים ניתן לשלב כדי ללמוד דינמיקת אסטר microtubule, לכפות דור ואינטראקציות-אסטר Aster. By החדרת קליפת המוח (כגון dynein) והבין-קוטבית (כגון kinesin-5 / Ase1) כוח-גנרטורים, אנחנולשקם מבני ציר דמוי ויותר מורכבים שמתחילים להידמות מצב vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Preparation of microfluidic chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask (Photomask on film substrate)</td>
			<td>Selba S.A. Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &#60;1-0-0&#62; 10-20 &#937;-cm, 500-550&#956;m, SSP, w/2 flats)</td>
			<td>WRS Materials</td>
			<td>4P0SSP-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater&#160;</td>
			<td>Polos</td>
			<td>SPIN150I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td>
			<td>Lubribond</td>
			<td>9481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona treater</td>
			<td>Electro-technic products</td>
			<td>BD-20ACV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Microfluidic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant (Span80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>M2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>24x60mm, thickness 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>26x76mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>135840/135841/135843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>PMIRB&#160;</td>
			<td>Any inverted brightfield would suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controler</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-FLEX-4C-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubing</td>
			<td>Cluzeau Info. Labo, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td>
			<td>VWR, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Reconstituting spindle formation and positioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-dithioltheitol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (Guanosine-&#39;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#954;-casein (&#954;-casein from bovine serum milk)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>CLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Introducing spindle-assembly factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (Adenosine-&#39;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &#8805; 97% (enzymatic))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

<html> השיטות שהוצגו בסעיפים הקודמים לאפשר הכינון מחדש של מבנים דמויי כישור עם מורכבות גוברות באמצעות הכליאה הגיאומטרית של טיפות אמולסיה מים ב-שמן. סעיף זה מתאר תוצאות נציגים כי איכותי להדגים את היכולת של מבחנים אלה. במהלך מיטוזה, כאשר הציר דו הקוטבי מורכב, תאים לעגל כלפי מעלה כדי ליצור כדורים בקוטר של כ -15 מיקרומטר, כפי שהיא נמדדת על תאים אנושיים. צורת התא mitotic מאפיין זה מספק גבול גיאומטריות ששני מגביל ומפנה גודל ציר והכיוון 35,36. טכניקות microfluidic, לספק רמה של כליאה גיאומטרית מדויקים דומות המצב נצפה בתאים חיים ולכן מאפשר שחזור מלמטה למעלה צירי mitotic במבחנה. page = &quot;1&quot;&gt; אסתרים microtubule הם בעצמם כבר מסוגלים התנהגות מורכבת כאשר צמיחת microtubule מוגבלת על ידי גבולות גיאומטריים. כפי microtubules לגדול, כוחות דוחפים שנוצר על ידי שילוב של הדימרים טובולין החדש להסיע את שני centrosomes להתנגדות צידי טיפות האמולסיה. בהתחלה, centrosomes לפזר בחופשיות בתוך הנפח המוגבל (איור 4 א, ​​פנל שמאלי). לאחר כ 20-30 דקות, microtubules הראשון להפוך דיפוזיה גלוי centrosome הופך מוגבל כמו microtubules לגדול נגד הקליפה לכל הכיוונים. אסתרים עם microtubules באורך ביניים (בערך 50% מקוטר האגל) יכולים (sterically) דוחים זה את זה אחר, עם microtubules דוחף אחד נגד שני, את centrosomes האחר ואת קליפת המוח. התוצאה היא סדר &#39;דו קוטבי&#39; ציר דמוי טיפוסי עם שני centrosomes מנוגדים אחד (איור 4 א, ​​פנל באמצע) אחרים. כאשר microtubules לגדול יותר מ ~ 50% של רביב-diaמטר, centrosomes לקבל דחף נוסף גבולות מנוגדים של רביב, עם microtubules גדל לאורך הקורטקס האגל (איור 4 א, ​​פנל מימין). חשוב לציין כי שיעורי צמיחת microtubule מבחנים אלה רגישים מאוד הוא טמפרטורה-ריכוזי טובולין. פרמטרים אלו ולכן ישפיעו על הזמן מאוד כאשר התגרענות היא נצפתה לראשונה וכאשר עמדות אסטר יציבות הם הגיעו. בתאים, כוחות משיכת קליפת מוח נוצרים דרך ההיווצרות של קבצים מצורפים נושאת עומס בין microtubule פלוס קצות dynein קשור הקורטקס. בתאים חיים, קשר זה תלוי מורכב Gαi / LGN / נומה, שהוא ממוקד קרום הפלזמה באמצעות N-terminal myristoylation של Gαi 1. מבחני כינון מחדש אלה, הדרישה של מתחם Gαi / LGN / נומה נעקפה על ידי צימוד ישיר dynein שומני biotinylated דרךהיווצרות של מתחמים ביוטין-streptavidin ביוטין. אג&quot;ח אלה הם יציבים יחסית (K D ~ 10 -14 M) 37 ויוצרים במהירות (בדרך כלל בתוך 10 דקות לאחר היווצרות טיפת תחליב, לפני התגרענות microtubule מתברר) (איור 4 ב). בנוכחות dynein קליפת המוח, centrosomes בדרך כלל לשמור על מקום מרכזי יותר, ואילו בהעדר dynein, centrosomes נדחפים לצדדים מנוגדים של קליפת אגל (איור 4C). אנו מסיבה זו היא תוצאה של שתי השפעות, המונעות ולבלום כוחות דוחפים microtubule. (1) dynein ישירות מקדמת אסונות microtubule, ובכך מגבילים אורך microtubule ומניעת קריסה microtubule מופרז, ו- (2) כוחות משיכה קליפת המוח להוביל כוחות המרכוז נטו על אסתרים הפרט 8, אשר מצמצמים את כוחות דחייה אסטר-אסטר. The-מקשר צלב diffusible Ase1 גורם f<html> orces שנוטה להגדיל באזור החופף של microtubules אנטי-מקביל 29. בקנה אחד עם זו, בנוכחות Ase1 (והיעדר dynein) centrosomes נמצאים קרובים זה לזה עם Ase1 ללוקליזציה כדי ארוזות microtubules interpolar (איור 4D). בני משפחת kinesin-5 לנהוג הפרדה centrosome ידי מתן כוחות דוחפים מתוך כישור (ראה מבוא). בנוכחות Cut7 (להלן ortholog kinesin-5 pombe ס), centrosomes נדחפים לצדדים מנוגדים של טיפות האמולסיה, אפילו בנוכחות של Ase1 (איור 4E). על ידי שילוב של גנרטורים כוח קליפת מוח ובין-קוטביים, רמת מורכבות ניתן להגדיל עוד יותר בניסויים אלה, המוביל בסופו של דבר הבנה מקיפה של הרכבת ציר mitotic דו קוטבית. תיאור כמותי מפורט של תוצאות אלה יהיו זמינים בעתיד (Roth et al., כתב היד בהכנה). <html> p-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; בנוסף התבוננות עמדת centrosomes ברגעים קבועים בזמן, והתייחסות התנהגותם אורכי הנצפה של microtubules, ניתן לקבל מידע רב ערך על ידי ביצוע תהליך המיצוב מעל זְמַן. על ידי הפחתת פעמי חשיפה בעוצמות ליזר, ניתן כיום לבצע מיצוב אסטר ב 2 מרווחי דקות לפחות 1 שעה עם רק ~ 30% לבנים. זה מאפשר ניטור של הרכבה אסטר ומיצוב מ centrosomes לשדר באופן חופשי (0 דקות.) באמצעות מרכזי (12 דק &#39;.) כדי אסתרים מבוזרת (36 דקות נוספות) (5 ג איור). זה מקל על המחקר של שתי התנהגות היציבה קינטיקה הרכבת ציר. על ידי שילוב של טיפות עם תוכן שונה באותה המדגם, שזה לא יהיה, למשל, ניתן להשוות ישירות קינטיקה מיצוב ציר הרכבת centrosome בטיפות עם ובלי גנרטורים כוח קליפת מוח (איור 5 ב &#39;). : לשמור-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig1.jpg" /> איור 1: הכוחות הפועלים על ציר mitotic מולקולות מספר מניבות כוח לפעול על microtubules של ציר mitotic לקדם היווצרות ציר ומיצוב.. Microtubules הגדלים לתוך קליפת התא לייצר כוח דוחף את centrosome. dynein קורטיקלי (סגול) לוכדת microtubules depolymerizing ומייצר כוח משיכה על centrosomes. בתוך ציר, Kinesin-5 / Cut7 חלבונים מנוע לספק כוח הזזה כלפי חוץ על microtubules אנטי במקביל, בעוד צולבות linkers משפחת PRC1 / Ase1 ליצור מנוגדים הזזה כוח כלפי חוץ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> איור 2:. Microfluidic שבב עיצוב (א) תכנון photomask 4 אינץ המכיל 4 שבבי microfluidic. (ב) ייצוג מפורט של שבב בודד. צ&#39;יפס מכיל ערוץ לשקע אחד ושלושה ערוצי כניסה ואחריו מסנן אבק. מפרצון ערוץ 1 מכיל את פאזיים מים, ערוץ 2 שומנים / שמן פאזיים והערוץ 3 יכול לשמש כדי לדלל את הטיפין נוצרו עם פאזיים שמן שומנים / נוספים. (ג) ייצוג מפורט של צומת שבו השומנים / שמן פאזיים (מאגף העליון והתחתון) נפגש עם שלב-מים (מאגף שמאל). בצומת, טיפות יהוו וזרימה לכיוון ערוץ לשקע בצד ימין. (ד) ייצוג מפורט של א-מסנן אבק עם 2 מיקרומטר ערוצים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> איור 3:. מתודולוגיה מים ב-שמן אמולסיה אגל גיבוש (א) שבב Microfluidic צינורות מיקרופלואידיקה על מיקרוסקופ שדה בהיר. הם מים וצינורות פאזיים שמן שומנים / מחוברי צריכת האוויר של שבב 1 ו -2 בהתאמה. (ב) סייג שבב מיקרופלואידיקה שבו המים ולפגוש שומנים / שמן-שלבים. על ידי שינוי לחצים, גודל הטיפות יכול להיות נשלט. (ג) תכנון זרימת תאי PDMS מצופה. לאחר טעינת הטיפין לתוך תאי הזרימה, הקצוות הפתוחים סגורים עם Valap נוסף. (ד) סכמטי של היווצרות טיפה. טיפות משמשות כדי לתמצת centrosomes, טובולין ומרכיבים נוספים הנדרשים ליצירת ציר mitotic. (E) סכמטי של מיקוד קליפת המוח-dynein. Biotinylated (ביו) dynein מיועד שומנים biotinylated באמצעות streptavidin (Strp). <aיעד href = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> איור 4:. נציג תוצאות של ציר-Reconstitutions עם המורכבות הגוברת (א) תחזיות בעוצמה מקסימלית של טיפות המכילות שני centrosomes הצגת דוגמאות של קצר, בינוני, ארוך microtubules. Centrosomes ו microtubules הם דמיינו על ידי תוספת של 10% HiLyte-488 שכותרתו טובולין. ברי סולם = 10 מיקרומטר. (ב) לוקליזציה של ה- GFP-ביוטין-dynein-TMR בהעדר (-, שמאל) ונוכחות (+, מימין) של streptavidin (Strp). (C) microtubule מיצוב אסטר בהעדר (-, משמאל) או נוכחות (+, מימין) של ביוטין-dynein-TMR GFP קליפת המוח. (ד) microtubule אסטר (פאנל משמאל, גרeen) מיצוב בנוכחות Ase1 (פאנל באמצע, אדום). (E) אסטר microtubule (פאנל משמאל, ירוק) מיצוב בנוכחות Ase1 ו Cut7 (kinesin-5) (פאנל באמצע, אדום). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> איור 5: Dynamics מיצוב הדמיה אסטר במבחנה (א) תכנון כוס PDMS המאפשר הדמיה אגל של עד מספר שעות.. (ב) דור, אחסון והדמיה של טיפות (משודר) המכיל תכנים שונים, מאוירים על ידי היעדרות (שמאל) הכללה (מימין) של dextran ניאון (Alexa 647). (ג) תמונות מטוס יחידות של זמן לשגות 60 דק &#39;(2 מרווחי דקות) שנלקח Z- מחסנית (2 מיקרומטר מרחקים) של מודעהroplet המכיל centrosome יחיד. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets at JoVE.com

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Video: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Title Cell Encapsulation by Droplets

תא כותרת Encapsulation על ידי טיפות

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

פולשנית In vivo קטנים בעלי חיים MRI ו MRS: הפרוצדורות בסיסי

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.