אנו מודים לורי לי לקריאה ביקורתית של כתב היד. TWC נתמך על ידי predoctoral מלגת איגוד לב אמריקאי (12PRE6590007). MRB נתמך על ידי מענק לאומי לסרטן מכון אימון (CA119925 T32). SSH נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01DK078640). EL נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM081635 וR01GM103926).

<ol>
	<li>Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+is+degraded+by+the+ubiquitin+pathway.">Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway.</a> Nature. 349, 132-138 (1991).</li><li>Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+beta-catenin+stability:+reconstitution+of+the+cytoplasmic+steps+of+the+wnt+pathway+in+Xenopus+egg+extracts.">Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Dabauvalle, M. C., Scheer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+nuclear+pore+complexes+in+Xenopus+egg+extract.">Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract.</a> Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+profilin+in+the+actin-based+motility+of+L.+monocytogenes+in+cells+and+in+cell-free+extracts.">Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts.</a> Cell. 76, 505-517 (1994).</li><li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts.">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li><li>Shennan, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+egg+extracts:+a+model+system+to+study+proprotein+convertases.">Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases.</a> Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).</li><li>Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cell+cycle+using+Xenopus+egg+extracts.">Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts.</a> Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).</li><li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts.">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li><li>Masui, Y., Markert, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+control+of+nuclear+behavior+during+meiotic+maturation+of+frog+oocytes.">Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes.</a> The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).</li><li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs.">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li><li>Newport, J. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+cell+cycle+during+early+Xenopus+development.">Regulation of the cell cycle during early Xenopus development.</a> Cell. 37, 731-742 (1984).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs.">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47, 577-587 (1986).</li><li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubistatins+inhibit+proteasome-dependent+degradation+by+binding+the+ubiquitin+chain.">Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain.</a> Science. 306, 117-120 (2004).</li><li>Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+ubiquitin-conjugating+enzyme+involved+in+mitotic+cyclin+degradation.">Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation.</a> Curr Biol. 6, 455-466 (1996).</li><li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibition+of+Wnt+signaling+through+activation+of+casein+kinase+1alpha.">Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha.</a> Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).</li><li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts.">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li><li>Hinkson, I. V., Elias, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+state+of+protein+turnover:+It's+about+time.">The dynamic state of protein turnover: It's about time.</a> Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).</li><li>Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+Hereditary+Colorectal+Cancer.">Lessons from Hereditary Colorectal Cancer.</a> Cell. 87, 159-170 (1996).</li><li>Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+regulation+of+[beta]-catenin+stability+by+Tcf3+and+CK1epsilon.">Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon.</a> J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).</li><li>Lee, E., Salic, A., Kr&#252;ger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway.">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li><li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A.">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li><li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning.">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li><li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3's+phosphorylation+of+&#946;-catenin.">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of &#946;-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li><li>Jernigan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gbetagamma+activates+GSK3+to+promote+LRP6-mediated+beta-catenin+transcriptional+activity.">Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity.</a> Science Signaling. 3, (2010).</li><li>Major, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wilms+tumor+suppressor+WTX+negatively+regulates+WNT/beta-catenin+signaling.">Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling.</a> Science. 316, 1043-1046 (2007).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Rubinfeld, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+GSK3&#946;+to+the+APC-&#946;-Catenin+Complex+and+Regulation+of+Complex+Assembly.">Binding of GSK3&#946; to the APC-&#946;-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly.</a> Science. 272, 1023-1026 (1996).</li><li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts.">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells.">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תמצית ביצי Xenopus היא מערכת ביוכימית חזקה לחקירת מחזור β-catenin. הריכוז של β-catenin בתמצית ביצי Xenopus הוא ~ 25 ננומטר 2. בתנאים אופטימליים, תמצית הביצה היא מסוגלת משפיל β-catenin בשיעור של 50-100 ננומטר / שעה וחצי מקסימאלי ב200 ננומטר 24. ישנם מספר צעדים קריטיים לכינון מחדש מוצלח של השפלה β-catenin באמצעות תמצית ביצי Xenopus. אלה כוללים 1) יצירת תמצית איכות גבוהה Xenopus ביצה ואת האופן בו תמצית ביצה מוכנה, 2) שהניבו radiolabeled β-catenin איכות וחלבון β-catenin-לוציפראז, 3) אופטימיזציה של תנאי תגובה לתמיכה בשפלת β-catenin, ו4 ) עיבוד נכון של נקודות זמן תגובה. הכנה באיכות גבוהה של תמצית ביצי Xenopus בי β-catenin נפגעת וחסונה תלויה הן באיכות של הביצים ודואר איך ביצי מטופלות לפני שלב הריסוק, כמו גם אופן שבו התמצית היא centrifuged לאחר מכן כדי להשיג את התמצית הסופית. כפי שהוזכר בפרוטוקול, חשוב כדי להבטיח שביצים רק באיכות גבוהה (שמעידות ניגוד חריף בין האונה הכהה בעלי החיים וצמחיים חצי כדור אור) נמצאות בשימוש, כי ביצים באיכות ירודה (פחזניות סיבי, מנומר, או לבן) יוסרו לאורך התהליך, שביצים נשמרות בטמפרטורה קרירה (16 מעלות צלזיוס) לאורך כל ההליך, וכי ההליך מתבצע במהירות אפשרית. חשוב שלא להקריב את האיכות לכמות של תמצית. בנוסף, כפי שהוזכר קודם לכן, ביצים מצפרדע שמטילה ביצים באיכות ירודה (&gt; 10%) צריכה להיות מושלכות לגמרי. התמצית שתוארה לעיל היא שינוי של מיוזה II-נעצר תמצית CSF 11. ההכנה של תמצית ביצי Xenopus לשפלת β-catenin הבדל (תמצית מהירות ביניים)ERS מתמציות קלאסיות מוכנות ללימוד תא מחזור 30-32, שהם במהירות נמוכה או במהירות גבוהה תמציות 35. התאמת תמצית ביצי Xenopus לפירוק אופטימלי של חלבונים אחרים עשויה לדרוש לשנות את מהירות צנטריפוגה ומספר הספינים. תמצית במהירות נמוכה מכילה אברונים שלמים ורכיבים סלולריים גדולים אחרים. לפיכך, ספינים מהירות גבוהים יותר יהיו לשנות את ההרכב של התמצית ואפשרות להסיר רכיבים מעכבים ו / או חיוניים שישפיעו על פירוקו של החלבון של עניין. הכנת תמצית מהירות ביניים המתוארת כאן היא מותאמת לפירוק של β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt. ספינינג לחלץ יותר מ 4X יכול להקטין באופן משמעותי את היכולת של התמצית להשפיל β-catenin (אם כי יש לו השפעה מינימאלית על השפלה של עוד מרכיב Wnt, &#39;תה שואל). β-catenin הוא רגיש proteolysis תיווך caspase בתמצית ספין במהירות נמוכה ולא noticeably בזות בתמצית ספין במהירות גבוהה. לפיכך, סביר להניח כי תמציות מהירות שונות תהיה אופטימליות לפירוק של מרכיבים של מסלולי איתות אחרים. הדור של 35 S-β-catenin וβ-catenin-לוציפראז יכול להתבצע באמצעות מספר ערכות זמינות מסחרי. הפקת חלבון באמצעות מערכות בשילוב תמלול בתרגום תלויה מאוד באיכות של פלסמיד: פוליפוני-הכנות טהורות ביותר של פלסמידים לעבוד טוב יותר ואמינות יותר בהשוואה ל-DNA מיני הכנות. לradiolabeling β-catenin, טרי הושג מתיונין [35 S] או Translabel (מתיונין [35 S] בתוספת ציסטאין [35 S]) הוא מועדפת. שים לב שמתיונין וציסטאין לשניהם יש נטייה להתחמצן באחסון ממושך ובכך להקטין שילובם בβ-catenin בתגובה במבחנה בשילוב תמלול בתרגום. מכיוון שאחסון ממושך ולהקפיא הפשרה חוזרת ונשניתמחזורים יכולים לעכב השפלה, כמויות קטנות של β-catenin radiolabeled מוכנים בזמן ושימוש קצר לאחר מכן. כמות החלבון המתורגם ומספר methionines בחלבון לקבוע את עוצמת אות רדיואקטיבי. עבור β-catenin, לא צריכה להיות שום בעיות בהשגת אותות רדיואקטיביים חזקים למבחני השפלה. לחלבונים עם כמה methionines ו / או ש, מתיונין לא לתרגם גם [35 S] ו [35 S] תמהיל ציסטאין יכול לשמש במקום מתיונין [35 S] ו / או להוסיף תג epitope (Myc) המכיל מספר רב של methionines. למרות שניתן להשיג הצלחה עם פלסמידים ביטוי שונים המכילים מקדמי הפאג המתאימים (T7, T3, וSP6) במבחנת תגובות תמלול בתרגום, המבוסס על פלסמיד pCS2 בדרך כלל נותן את התוצאות הטובות ביותר. בנוסף, האות של החלבון המתורגם לפעמים יכולה להיות מוגברת באופן דרמטי על ידי מחיקת אנדוגני 5&#39;UTR. לבסוף, לניסויים בקנה מידה גדולה (לדוגמא, תפוקה גבוהה הקרנה), ייתכן שתהיה צורך בכמות גדולה של β-catenin-לוציפראז רקומביננטי. β-catenin-לוציפראז ממערכת Sf9 / baculovirus מדרדרת עם קינטיקה דומה כמו β-catenin wild-type בתמצית Xenopus ועוברים 2. לחלופין, תשואה גבוהה במערכת ביטוי חוץ גופית (למשל מבוסס נבט חיטה) שמשה בהצלחה להקרנת תפוקה גבוהה 19, 20. על מנת למדוד את ההשפלה של β-catenin במערכת לחלץ באופן מהימן, חשוב שהאות הראשונה משני β-catenin radiolabeled או היתוך β-catenin לוציפראז היא מספיק חזקה. לפיכך, מידה מסוימת של אופטימיזציה על ידי הנסיין בגודל של assay השפלה, את מספר נקודות זמן הנדרש, ואת היעילות של wi תגובת התרגום חוץ גופיתתהיה צורך. כשהרכבת תגובת השפלה, ישנם מספר צעדים שניתן לנקוט כדי לשפר את הסיכוי להשגת השפלה חזקה. ראשית, צריכים להיות מופשרים כל ריאגנטים במהירות והניחו על קרח לפני ההפשרה המלאה שלהם. משום השפלה של β-catenin היא מאוד תלויה אנרגיה, חשוב שחדר המיון הוא יחסית טרי. שנית, תמצית ביצי Xenopus היא צמיגה, וזה קריטי, כי התגובה היא מעורבת באופן יסודי לאחר תוספת של היתוך β-catenin/β-catenin-luciferase radiolabeled, ER, חלבון, מאפנני מולקולה קטנים, וכו &#39;שלישית, מראש דוגרים התגובה לערבב במשך 20-30 דקות על קרח נותן תוצאות לשחזור יותר כאשר בודקים השפעות של מאפנני מולקולה קטנים. היכולת לרוקן את החלבונים מתמצית ביצי Xenopus מייצגת כלי רב עוצמה כדי להעריך את תפקוד חלבון והאפקטים תלוי הריכוז שלהם. כדוגמא, אנו מראים כי מדלדלים GSK3 מXeלוקי nopus תמצית ביצת השפלה של β-catenin, המעידים על התפקיד החשוב של GSK3 במחזור β-catenin. תנאי דלדול שונים יצטרכו להיקבע באופן אמפירי לחלבונים שונים. כך, למשל, חלבונים בשפע ידרשו גידול בסך של חרוזים יגנד נוגדן או זיקה בשימוש כדי להשיג דלדול מלא. נקודת התחלה טובה היא להשתמש בחרוזים ארוזים ב1/10 הנפח של התמצית על מנת למזער את דילול תמצית. בנוסף לכוחו של מחייב של ליגנד נוגדן / זיקה לחלבון המטרה, הסוג של חרוזים (למשל, sepharose, agarose, או מגנטי) המשמש עשויים להשפיע על היעילות של דלדול חלבון מתמצית ביצי Xenopus 36. לבסוף, זה יהיה אידיאלי כדי לנתח את המידה של דלדול (בדרך כלל על ידי immunoblotting). ברגע שתגובת β-catenin הושלמה, את האופן שבו הדגימות מעובדות יכול מאוד להשפיע על תוצאות הניסוי. הריכוז שלpreps תמצית ביצי Xenopus שהוכן באופן מתואר הוא 52.41 מ&quot;ג / מיליליטר ± 5.40 מ&quot;ג / מיליליטר, וזה חשוב לא להעמיס על הקיבולת של ג&#39;ל SDS-PAGE; זה לא בעיה עם assay לוציפראז-β-catenin. לכן, עבור כל נקודת זמן, יש לטעון לא יותר מ 1 מיליליטר של תמצית מקביל לנתיב אחד של ג&#39;ל SDS-PAGE. כדי לשפר את איכות התוצאות נוספת, צעד ג&#39;ל הקיבעון (האופציונלי) יקטן רדיואקטיביות רקע ולהגדיל את יחס אות לרעש. עבור assay לוציפראז, ירידה מהאות ראשונה של 100,000 RLU בתמצית ביצי Xenopus בנאמנות משקפת את השינוי ברמות החלבון של חלבון היתוך β-catenin-לוציפראז. מערכת תמצית ביצי Xenopus מייצגת מערכת אטרקטיבית ללמוד הרגולציה של השפלה β-catenin. מערכת התמצית מאפשרת שליטה המדויקת של הריכוז של חלבונים בודדים באמצעות דלדול וreconstitu<html> tion. היכולת לפקח על ההשפעות שלהם על קינטיקה של מחזור β-catenin לאורך הזמן מאפשרת הבנה טובה יותר של המנגנון ביוכימי של שלב מכריע זה בהעברת אותות Wnt. מניפולציות כאלה סיפקו תובנה עמוקה האינטראקציות מולקולריות מורכבות בין הרכיבים של מסלול Wnt והיו קריטיים להתפתחות של המודל המתמטי הראשון של מסלול Wnt 24. אזהרה אחת היא שהריכוזים של מרכיבים שונים של מסלול Wnt בתמצית ביצי Xenopus וlysates תא היונקים נמצאו שונים, שכנראה משקפים את ההבדלים באופן שבו מסלול Wnt מוסדר בעובר לעומת מצב המבוגרים 37. היכולת לבצע מבחני הן רדיואקטיבי והאנזימטית, מבוסס לוציפראז באמצעות תמצית ביצי Xenopus מספקת הוסיפה כלים איכותניים וכמותיים משלימים רבי עוצמה ללימוד הרגולציה ביוכימיים של השפלה β-catenin. t &quot;&gt; בנוסף למעקב אחר מחזור של β-catenin, השפלה של הרגולטור השלילי Wnt, &#39;התה שואל, יכולה להיות במעקב בתמצית ביצי Xenopus או כחלבון או היתוך radiolabeled ללוציפראז. שימוש בגרסה של לוציפראז, Renilla, התמזגו &#39;תה שואל, הותאם בעבר עבור assay השפלה לוציפראז לפורמט תפוקה גבוהה מסך בו זמנית למאפננים של שני חלבוני Wnt מסלול, β-catenin ו19&#39; תה שואל, 20. מסך ביוכימיים זה זיהה את ה-FDA בסמים, pyrvinium שגדל ו ירידה בקצב הפירוק של β-catenin ו&#39;תה שואל, בהתאמה, בתמצית ביצי Xenopus 19. Pyrvinium קבל תוקף בתאים אנושיים בתרבית ובאורגניזמים מודל שונים (למשל, Xenopus וסי אלגנס) לאחר מכן כמעכב מולקולה קטן של Wnt הקנונית מסלול. לסיכום, מערכת תמצית ביצי Xenopus הוא tha מערכת ביוכימית תכליתילא ניתן לנצל במגוון רחב של דרכים כדי ללמוד את מנגנון האיתות של Wnt, כמו גם לזיהוי מאפנני מולקולה הקטנים של מסלול Wnt. שיטת יוכימיים המתוארות כאן יכולה להיות מיושמת על מסלולי איתות אחרים שבה פירוק חלבונים עשוי לשחק תפקיד קריטי.

A correction was made to <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

תמצית ביצת laevis Xenopus כבר נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד תהליכים בתא ביולוגיים רבים כולל דינמיקת cytoskeletal, הרכבה ויבוא גרעיניים, אפופטוזיס, חילוף חומרים של היוביקוויטין, התקדמות מחזור התא, העברת אותות, ומחזור חלבון 1-17. מערכת תמצית ביצי Xenopus ניתן לניתוח ביוכימי של לגיון של תהליכים תאיים, כי תמצית ביצה מייצגת בעצם ציטופלסמה חי המכילה את כל המרכיבים החיוניים cytoplasmic דרוש לביצוע תהליכים אלו ולאפשר חקירה. ניתן להכין כמויות גדולות של תמצית ביצים בפעם אחת למניפולציות ביוכימיות הדורשות כמויות גדולות של חומר (למשל, טיהור חלבון או הקרנת תפוקה גבוהה) 18-20. יתרון נוסף הוא שהריכוז של חלבונים ספציפיים בתמצית ביצי Xenopus יכול להיות מותאם בדיוק על ידי תוספת של חלבון ו / או immunodepletion של endog רקומביננטיחלבונים בוגדניים בניגוד לtransfection של DNA פלסמיד שבו ביטוי של החלבון של עניין הוא קשה לשליטה. בנוסף, המחסור בחלבונים רקומביננטיים זמינים ניתן להתגבר על ידי התוספת של תמלילים המקודדים את החלבון של עניין, תוך ניצול של הקיבולת הגבוהה של תמצית ביצי Xenopus מוכנה הטרי לתרגם mRNA הוסיף אקסוגני. הרגולציה של פירוק חלבונים היא קריטית לשליטה רבים מסלולי הסלולר ומעבדת 21. תמצית ביצי Xenopus כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד פירוק חלבונים, שכן המערכת מאפשרת מספר דרכים לעקוב אחר מחזור חלבון ללא השפעות מבלבלות של שעתוק ותרגום. מסלול איתות Wnt הוא מסלול איתות שמור ביותר שמשחק תפקידים קריטיים בהתפתחות ומחלה. מחזור של β-catenin, מפעיל העיקרי של מסלול Wnt, מוסדר מאוד, ואני במצב יציב מוגבראיבל של β-catenin הוא קריטי להפעלה של גנים מטרת Wnt. החשיבות של השפלה β-catenin מודגשת על ידי העובדה שמוטציות במסלול Wnt המעכבות השפלה β-catenin מצאו ב~ 90% מכל מקרים ספורדיים של סרטן מעי גס 22. השפלה β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt יכולה להיות סכמה בנאמנות בתמצית ביצי Xenopus ללמוד את המנגנון של המחזור שלה, כמו גם לזהות מאפנני מולקולה קטנים רומן של השפלה שלה 2, 19, 20, 23-29. שיטות להכנה של תמצית ביצי Xenopus לחקר מחזור התא תוארו בפרסומי יופיטר הקודמים 30-32. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינוי של שיטות אלה, והוא מותאם לשפלה של [35 S]-radiolabeled β-catenin ומתויג לוציפראז β-catenin בתמצית ביצי Xenopus. Assay השפלה radiolabeled מאפשר הדמיה ישירה של רמות חלבון באמצעות autoradiography. מתיונין [35 S] הוא שולב החלבון של עניין באמצעות תגובה בתרגום חוץ גופית שלאחר מכן ניתן להוסיף ישירות לתגובת השפלה. בנוסף, assay מחזור חלבון radiolabeled אינו דורש נוגדן נגד החלבון של עניין או תג אפיטופ, שיכול להשפיע על יציבות חלבון. כי אפילו שינויים קטנים ברמות חלבון, כפי שבאו לידי ביטוי בשינויים בעוצמתה של להקת חלבון רדיואקטיבי, הם דמיינו בקלות על ידי autoradiography, [S 35]-radiolabeled assay השפלה מייצג שיטה שימושית מאוד להדמיה של חלבון מחזור 2. שילוב של β-catenin לגחלילית בלוציפראז (להלן בפשטות &quot;לוציפראז&quot;) מאפשר למדידות כמותיות מדויקות וקלילות של רמות חלבון, כדיכדי לקבוע את מאפייני הקינטית של מחזור β-catenin 19, 20. יתרון עיקרי של assay בלוציפראז הוא שהיא מספקת מערכת כמותיים חזקה הלשנותם בקלות. הפרוטוקול הבא מספק שיטות פשוטות למנסה לאמוד השפלה β-catenin ושיטה חזקה, יעילה ואפקטיבית להקרנת תפוקה גבוהה של מאפנני β-catenin רומן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="710">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Material</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:243px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td style="width:132px;">ProSpec</td>
			<td style="width:119px;">hor-272-A</td>
			<td>Reconstituted with distilled water before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">S23020-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC42352-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC17360-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1153-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4265-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C8273-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe: Luer Lock tip</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">27G1 needle</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Steady-Glo Luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2520</td>
			<td>Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L3260</td>
			<td>Generally higher yield than reticulocyte lysate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]</td>
			<td style="width:132px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG772007MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">27920-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphokinase</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3755-35KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual-Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2920</td>
			<td>Same storage conditions as Steady-Glo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0556214D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall SS-34 fixed angle rotor</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">115 V 50/60 Hz Minicentrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-090-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine Sp6 kit</td>
			<td style="width:132px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Firefly Luciferase antibody</td>
			<td style="width:132px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab16466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-GSK3 antibody</td>
			<td style="width:132px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FLUOStar Optima</td>
			<td style="width:132px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall RC-6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16&#176;C Incubator</td>
			<td style="width:132px;">Percival Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of &#946;-catenin degradation in xenopus egg extract

תמצית ביצת laevis Xenopus היא מערכת מאופיינת היטב, חזקה ללימוד הביוכימיה של תהליכים תאיים שונים. תמצית ביצי Xenopus נעשתה שימוש כדי ללמוד מחזור חלבון בהקשרים רבים תאיים, כולל את מחזור התא ומסלולים הולכים אותות 1-3. בזאת, שיטה מתוארת לבידוד תמצית ביצי Xenopus שעבר אופטימיזציה כדי לקדם את ההשפלה של המרכיב הקריטי Wnt המסלול, β-catenin. שתי שיטות שונות מתוארות להעריך פירוק חלבוני β-catenin בתמצית ביצי Xenopus. שיטה אחת היא מבחינה ויזואלית אינפורמטיבי ([S 35]-radiolabeled חלבונים), ואילו השני הוא לשנותם בקלות רבה יותר למבחני תפוקה גבוהה (גחלילית חלבוני היתוך מתויג לוציפראז). הטכניקות המתוארות יכולות לשמש, אך אינם מוגבלות, להערכת מחזור חלבון β-catenin ולזהות רכיבים מולקולריים תרמו למחזור שלה. בנוסף, ability לטהר כמויות גדולות של תמצית ביצים הומוגנית Xenopus בשילוב עם קריאת הנתונים הכמותיים וקלילות של חלבונים מתויגים לוציפראז מאפשר מערכת זו כדי להתאים בקלות להקרנת תפוקה גבוהה למאפננים של השפלה β-catenin.

סכמטי של השפלה β-catenin בתמצית ביצי Xenopus מוצג באיור 2 א. 35 β-catenin כותרת-S הודגר בתמצית ביצי Xenopus, aliquots (1 מיליליטר לחלץ שווה ערך) הוסרו במועדים המתאימים, ודגימות היו נתונים SDS-PAGE ואחרי autoradiography. השפלה β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt מתווכת על ידי מערכת היוביקוויטין-proteasome 2, והשפלה של β-catenin [35 S]-radiolabeled בתמצית Xenopus הוא מעוכבת על ידי תוספת של המעכב הפרוטאזום MG132 איור 2. השפלה של β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt היא תלויה בזירחון שלה על ידי GSK3 34. השפלה GSK3 תלויה ניתן להדגים בקלות במספר הדרכים באמצעות תמצית ביצי Xenopus: 1) β-catenin (המוטציה SA) (אתרי זירחון GSK3 מוטציה לalanines) הוא התייצב בקסנוביצת מוגלה תמצית ביחס ל2B איור חלבון β-catenin wild-type. 2) מעכבי מולקולה קטנים של GSK3 (LiCl) דומים לעכב פירוק של β-catenin (איור 2 ג). 3) לבסוף, דלדול של GSK3 מתמצית ביצי Xenopus מעכב פירוק של β-catenin; השפלה יכולה להינצל על ידי תוספת של GSK3 אקסוגניים איורים 2D-E. Assay השפלה β-catenin radiolabeled מספק הערכה חזותית אינפורמטיבי במיוחד של מצבו של השפלה (השפלה בתיווך היוביקוויטין כלומר לעומת מחשוף אפופטוטיים). Autoradiography, לעומת זאת, הוא עבודה אינטנסיבית, ו, על פי רוב, מוגבל לניתוח תפוקה גבוהה של המסלול (למשל, מיון למאפנני מולקולה קטנים של מסלול Wnt). Assay השפלה β-catenin-לוציפראז הוא יותר בקלות ובמהירות לכימות כסכום של הארה הנפלטת עומדים ביחס ישר לבוקרount חלבון β-catenin-לוציפראז של. תכונה זו הופכת את assay לוציפראז פשוט וישימה בקלות למבחני תפוקה גבוהה. זה חשוב כדי לקבוע כי יש היתוך לוציפראז נכסים דומים לזה של חלבון nonfusion. זה יכול להיקבע באופן אמפירי על ידי פיוזינג חלבון לוציפראז לN-הסופית, C-סופית, או באופן פנימי. היתוך של בלוציפראז לN-או C-הסופית של β-catenin אינו משפיע על יכולתה להפעיל את גנים מטרת Wnt incultured תאי יונקים או התחלופה שלה בתמצית Xenopus ביצת 2, 19, 20. Assay השפלה β-catenin-לוציפראז נציג בתמצית ביצי Xenopus מוצג באיור 3 א שבשפלה של β-catenin-לוציפראז הוערכה על ידי SDS-PAGE/autoradiography של פעילות החלבון ולוציפראז radiolabeled של ההיתוך. שיעור degradation של β-catenin-לוציפראז דומה לחלבון β-catenin לא מתויג. הרגולציה של השפלה להיתוך β-catenin-לוציפראז היא למעשה זהה לחלבון nonfusion כתוספת של LiCl או דלדול של GSK3 הביאו לעיכוב של β-catenin-לוציפראז מחזור. כפי שניתן לראות באיורים 3 ב-C, שינויים באות רדיואקטיבית של חלבון β-catenin-לוציפראז מקבילים לשינויים בפעילות האנזימטית בלוציפראז לאורך זמן. בעיה שנובעת משימוש בβ-catenin-לוציפראז (בעיקר חלבון היתוך שנוצר ממערכת תמלול בתרגום חוץ גופית) היא אות לוציפראז רקע שנגרמה על ידי שימוש באתרים פנימיים translational התחלה או סיום translational המוקדם איור 3D. בעיה זו לעתים ניתן להתגבר על ידי אופטימיזציה של ריכוז ה-DNA משמש בתגובת IVT. לא, עם זאת, להבחין ירידה בפעילות לוציפראז רקע כאשר אנחנו מגווניםריכוז ה-DNA פלסמיד למבנה β-catenin-לוציפראז המסוים שלנו. סביר להניח כי אנו צריכים לשנות את דרך מימוש חלבון ההיתוך באמצעות mutagenesis על מנת למזער עוד יותר אתרים פנימיים translational התחלה ו / או סיום של תרגום המוקדם של חלבון היתוך β-catenin-לוציפראז. בגלל חלבון לוציפראז הוא יציב למדי במהלך תגובת השפלה באיור 3 א תמצית ביצי Xenopus הזמן, עם זאת, אות רקע זה יכול להיות פשוט נגרעה אם היחס של חלבון לוציפראז הקטום להיתוך β-catenin באורך המלא הוא ידוע . כוח של assay בלוציפראז הוא היכולת לשנות את קנה מידה לפורמט רב היטב, המאפשר לביצוע הקרנת תפוקה גבוהה למאפננים של השפלה β-catenin. באיור 4, ניתוח שחמט נציג מוצג באמצעות מעכב של השפלה β-catenin, MG132, אשר מעכב את<html> הפרוטאזום. התוצאה של ניסוי השחמט מציינת כי assay הוא אחיד ושחזור בפורמט 96 היטב ומדגים את התאמתה להקרנת תפוקה גבוהה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51425/51425fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51425/51425fig1.jpg" /> איור 1. ייצוג סכמטי של ההכנה של תמצית ביצי Xenopus מרוכזת. ביצים נאספות מXenopus הזריק HCG laevis נקבות, נדחסו עם ספין במהירות נמוכה (400 XG), ומרוסקות ומופרדות עם מדיום במהירות (XG 15,000 ספין). תשמור על עצמך להזריק מתחת לעור לתוך שק הלימפה הגבי, להסיר את הביצים הרעות בזהירות, ולהפריד בזהירות את תמצית cytoplasmic באיכות גבוהה מהתמצית כהה יותר באיכות נמוכה יותר כפי שצוין בטקסט. igure 2 &quot;עבור: תוכן width =&quot; 5in &quot;עבור: src =&quot; &quot;/&gt; /&quot; = src &quot;/ files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg β-catenin כותרת איור 2. β-catenin מדרדרת חסונה כאשר הודגרו בXenopus לחלץ ביצה.) סכמטי של assay השפלה. ב &#39;) [S 35] הוכן על ידי תגובת IVT מדרדרת חסונה כאשר הודגרו בתמצית ביצי Xenopus. תוספת של MG132 (200 מיקרומטר) כדי לחלץ ביצת Xenopus מעכבת השפלה β-catenin. מוטציה לalanines של phosphosites GSK3 בתוך β-catenin (β-catenin SA) או תוספת של LiCl C (25 מ&quot;מ)) מעכבת השפלה β-catenin. ד &#39;) אתר GSK3 המחייב של&#39; תה שואל (חומצות אמינו 506-560) מכלה את יעילות GSK3 מתמצית ביצי Xenopus. ה) תמצית ביצים מדולדלת GSK3 Xenopus מעכבת השפלה β-catenin ויכולה להינצל על ידי בנוסף oו GSK3 רקומביננטי (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר). תוספת של LiCl לוקים (25 מ&quot;מ) הקיבולת של GSK3 רקומביננטי להציל השפלה β-catenin בתמצית מדולדלת GSK3. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51425/51425fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51425/51425fig3.jpg" /> איור 3. Β-catenin-מתויג בלוציפראז מדרדרת כאשר הודגרו בתמצית ביצי Xenopus.) Radiolabeled β-catenin-לוציפראז מדרדרת בקצב דומה לזה שחלבון β-catenin לא מתויג של. כמו עם חלבון wild-type, תוספת של LiCl (25 מ&quot;מ) מעכבת β-catenin-לוציפראז השפלה. לוציפראז לבדו אינו ניכר להתהפך בתמצית ביצי Xenopus. שינויים בפעילות בלוציפראז של β-catenin-וציפרתוספת היתוך ASE מקביל לשינויים ברמות החלבון שלה. ב) LiCl (25 מ&quot;מ) או דלדול של GSK3 C) מעכבת β-catenin-לוציפראז מחזור כפי שהוערך על ידי מדידת פעילות לוציפראז. ד) immunoblotting במבחנה תורגם β-catenin- לוציפראז (באמצעות נוגדן אנטי לוציפראז) גילה כמויות משמעותיות של חלבון בלוציפראז ללא בpreps מסוים שסביר להניח שתורם לרקע גבוה יותר בהשוואה לassay השפלה radiolabeled. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51425/51425fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51425/51425fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51425/51425fig4.jpg" /> השפלה איור 4. מוסדר של β-catenin-לוציפראז בתמצית Xenopus ניתן להתאיםפורמט תפוקה גבוהה. ניתוח שחמט נציג לβ-catenin-לוציפראז באמצעות MG132 (450 מיקרומטר) כמעכב של השפלה β-catenin. עמודות מוצלות מצביעות על בארות שטופלו ב-MG132, ועמודות קלות לייצג רכב בארות שטופלו (DMSO). כימות ותוצאת חישוב Z-פקטור בציון של 0.3 המציין assay מקובל לשימוש פוטנציאלי בהקרנת תפוקה גבוהה.

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution Of ÃŽÂ²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract at JoVE.com

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

שיטה מתוארת לניתוח פירוק חלבונים באמצעות רדיואקטיבי וחלבונים לוציפראז-Fusion בתמצית ביצי Xenopus והתאמת להקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה קטנים של פירוק חלבונים.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

reconstitution-of-catenin-degradation-in-xenopus-egg-extract

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.0K Views.  Vanderbilt University Medical Center.  שיטה מתוארת לניתוח פירוק חלבונים באמצעות רדיואקטיבי וחלבונים לוציפראז-Fusion בתמצית ביצי Xenopus והתאמת להקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה קטנים של פירוק חלבונים. 

Video: Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.