We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Los métodos descritos aquí presentes los recientes esfuerzos para reconstituir husos mitóticos básicos en gotas de la emulsión de agua-en-aceite. El estudio de conjunto del eje dentro de los límites geométricos ofrece numerosas ventajas. Existen mecanismos importantes de retroalimentación entre los microtúbulos del huso mitótico y las limitaciones geométricas en el que están montados. Los microtúbulos pueden generar fuerzas de empuje cuando crecen en los límites geométricos, que puede resultar en el desplazamiento del huso mitótico. Además, la creciente en una barrera física puede inducir catástrofes microtúbulos. Además, conjunto del eje dentro de una geometría confinada puede conducir a un agotamiento progresivo de los componentes individuales, como la tubulina, que a su vez afecta directamente a la tasa de crecimiento de microtúbulos 36. Estos son todos los factores determinantes esenciales del conjunto del husillo, que se pueden estudiar usando los ensayos descritos aquí. Los ensayos descritos son muy sensibles a differe concentración pequeñaNCES de los componentes de las gotitas. Este es el caso de la tubulina, donde las diferencias de concentración menores pueden resultar en el crecimiento de los microtúbulos demasiado lento o demasiado rápido. En este caso, las tasas de crecimiento de los microtúbulos a menudo pueden todavía ser corregidos mediante el ajuste de la temperatura durante la primera ~ 30 min del experimento. ensamblaje del huso mitótico y la colocación es también muy sensible a las variaciones en la concentración de generadores (cortical) de fuerza. Es probable que esto dependerá de la concentración, pureza y actividad de los componentes purificados y necesita ser valorada cuidadosamente para cada nueva proteína purificada. Además, ciertas soluciones de compromiso tiene que ser realizado en la configuración de imagen, dependiendo de la naturaleza del ensayo. Inicialmente, los altos niveles de dímeros de tubulina fluorescentes solubles hacen que sea difícil de imagen microtúbulos individuales. Como microtúbulos crecen más y tubulina soluble se agota lentamente, la relación señal a ruido se vuelve gradualmente más altas y permite la obtención de imágenes de IndividuAL microtúbulos. En contraste con las configuraciones con sistemas abiertos, el confinamiento geométrico impide el intercambio de moléculas fluorescentes y componentes del sistema eliminador de oxígeno dentro de un depósito a granel, lo que resulta en el blanqueo significativo. Especialmente para el control de ensamblaje del huso y el posicionamiento en el tiempo, se requiere a la imagen con bajas intensidades de luz, incluso en presencia de un sistema eliminador de oxígeno potente. Estos métodos permiten la reconstitución de abajo hacia arriba de las estructuras de huso como simplificados in vitro. Además de los componentes introducidos aquí, muchos otros factores se han descrito para influir en la formación bipolar husillo, el posicionamiento, orientación, configuración, etc. 3. Este sistema se puede ampliar para estudiar los efectos individuales y combinados de generadores de fuerza adicionales. importantes contribuyentes a la formación del huso que actualmente están ausentes de este sistema son los cromosomas mitóticos. cromatina mitótica Se ha demostrado quela formación del huso de particular (1) chromokinesins que puede generar la llamada, (2) la formación de un gradiente de RanGTP por la cromatina determinada RanGEF RCC1 38, (3) cinetocoros que puede interactuar &#39;fuerzas polar de eyección&#39; 3 con (despolimerizar ) microtúbulos 39 y (4) la cromatina en sí, que puede funcionar como un resorte mecánico en el medio microtúbulos opuestas 40. Por último, el sistema descrito actualmente proporciona un control temporal y espacial limitado sobre la actividad y la localización de la fuerza-generadores introducidas. En las células, muchos factores de ensamblaje del huso se localizan en compartimentos específicos o están activos dentro de una ventana de tiempo restringido. Un ejemplo notable es la actividad de la dineína, que está enriquecido específicamente en el lado posterior de la C. elegans de una sola célula de embrión en su fase asimétrica para promover el posicionamiento del cabezal y la división celular. En este sistema, actualmente estamos explorando la posibilidad de imitar tales tactividad utilizando métodos emporal y asimétricas prestadas de las técnicas opto-genéticos. Además, como es el caso de la C. elegans embriones y células con una pared celular rígida, muchas células no se completan en la mitosis. La forma geométrica del confinamiento tendrá un impacto fundamental sobre las fuerzas que actúan sobre el eje 41. Por tanto, será importante para reconstituir conjunto de husillo y posicionamiento en gotas no esféricas, así, potencialmente el uso de sistemas de microfluidos más complejos que permiten que dan forma y el almacenamiento de la emulsión de gotitas de 42,43. Por último, en los tejidos, célula-célula y célula-sustrato de señalización y el apego proporcionan señales externas que se pueden traducir en la orientación del cabezal dirigida, como se observa a menudo en las células epiteliales y las células madre. Todos estos aspectos especializados no han sido tenidas en cuenta en este estudio actual y podría proporcionar los retos del futuro para construir más hacia in vivo -como reconstituciones de assemb huso mitóticoLy y posicionamiento.

Durante la mitosis, los cromosomas del genoma replicado se organizan en el ecuador celular para asegurar la distribución equitativa de las cromátidas hermanas sobre las células hijas recién formadas. posicionamiento y la segregación cromosómica está mediada por su unión a los microtúbulos del huso se originan a partir de dos centrosomas opuestos. Además de garantizar la distribución cromosómica fieles, la orientación del huso mitótico también dicta el plano de división celular 1. Coordinado orientación de la división celular es esencial durante muchas etapas de desarrollo y para la homeostasis del tejido 2. Específicamente, regulado mitótico husillo de posicionamiento puede resultar en la distribución asimétrica de contenidos celulares, o incluso producir células hijas de diferentes tamaños 2. Ensamblaje del huso mitótico y la orientación comienza en la profase y está orquestada por una compleja interacción entre cooperar y antagonizar fuerza generadores 3,4. Las fuerzas generadas consisten en btirar y empujar fuerzas OTH. Estas fuerzas se originan tanto desde los contactos de huso con la corteza celular, así como desde el interior del husillo, y pueden ser generados por la dinámica de microtúbulos, así como por motores moleculares y reticulantes (Figura 1). fuerzas de empuje se pueden generar cuando microtúbulos crecen contra estructuras rígidas tales como la corteza celular. Dependiendo de la fuerza de resistencia total generado dentro del sistema, esto puede resultar en el reposicionamiento del huso mitótico (fuerzas bajas) o desencadenar el pandeo de los microtúbulos o catástrofe (altas fuerzas) 5-8. La cantidad de fuerza que se puede generar empujando depende de la longitud de los microtúbulos, ya que la longitud es un fuerte determinante de microtúbulos pandeo 9. Además, los microtúbulos que se originan de un centrosoma pueden empujar contra el otro centrosoma, un mecanismo que se ha sugerido para impulsar la separación del centrosoma a principios de la profase 3,10. En anunciocondición para empujar las fuerzas generadas por los microtúbulos en crecimiento, los microtúbulos termina en contacto con la corteza celular también puede mediar fuerzas de tracción 11. Estudios de varios laboratorios han demostrado que se requiere la actividad controlada de generadores de fuerza corticales para el posicionamiento asimétrico de husos mitóticos in vivo 1. Esencial para estas fuerzas de tracción es Cortex-localizada dineína citoplasmática (en lo sucesivo, &quot;dineína &#39;), una menos de fin de microtúbulos dirigida proteína motora 8,12,13. Por ejemplo, en la levadura en ciernes, interacciones laterales de dineína cortical con el resultado de celosía de los microtúbulos en los microtúbulos motor dependiente de deslizamiento a lo largo de la corteza 14. Sin embargo, fuerzas de tracción corticales también se pueden generar por la capacidad de dineína para formar accesorios de extremo-a despolimerización de microtúbulos 8. La energía generada por la contracción de los microtúbulos puede dar lugar a fuerzas que son generalmente de un orden de magnitud mayor (~ 50 pN (referencia 15 </sarriba&gt;)) que las fuerzas generadas por proteínas motoras individuales (~ 7-8 pN (ref. 16)). Final en la unión de la dineína cortical a los microtúbulos depolymerizing promueve el posicionamiento del cabezal en la levadura en ciernes 17 y C. elegans 13. Ya sea tanto dependiente del motor, deslizamiento y microtúbulos despolimerización expulsado a las fuerzas de tracción corticales pueden cooperar o se excluyen mutuamente en vivo es desconocida en la actualidad. Además de fuerzas de empuje de los microtúbulos y fuerzas de tracción corticales de dineína mediada por, el posicionamiento centrosoma se controla desde el interior del huso mitótico por numerosas otras proteínas. Kinesin-5 motores, por ejemplo, existen como tetrámeros que pueden cruzar de enlace de microtúbulos antiparalelos interpolares, lo que resulta en la generación de las fuerzas de deslizamiento hacia afuera 18-20. Se requiere que los miembros de la familia de motor kinesin-5 para la separación del centrosoma y montaje de huso bipolar en todos los eucariotas estudiados, con la excepción de C. elegans<html> (revisado en referencia 21). Además, también se conocen difusibles reticulantes de la familia / PRC1 ASE1 para localizar a la superposición de las regiones de los microtúbulos de microtúbulos interpolares in vivo e in vitro 22-27. Las fuerzas generadas por la expansión impulsada por ASE1 de la zona de solapamiento microtúbulos son lo suficientemente grandes para contrarrestar la quinesina-14 fuerzas de deslizamiento mediadas in vitro 28,29. En las células, se requiere ASE1 / PRC1 para la formación estable de la superposición de las regiones de los microtúbulos en el huso midzone 25-27,30, lo que sugiere que las fuerzas generadas por difusibles reticulantes pueden contribuir significativamente a la organización del husillo. Por último, las fuerzas de la cromatina mitótico y cinetocoros influyen ensamblaje del huso mitótico y posicionamiento a través de diversas vías 3. Dado que estos componentes no son parte de los ensayos de reconstitución que se describen aquí, no se discutirán en detalle. jove_content &quot;&gt; Existen diferentes teorías sobre cómo los diferentes componentes moleculares y las fuerzas descritas anteriormente cooperan en conjunto del husillo y el posicionamiento, pero aún están lejos de una comprensión cuantitativa. Además de los experimentos en células vivas, los experimentos in vitro con componentes purificados proporcionan una poderosa ruta para ayudar a alcanzar este objetivo. Aquí presentamos una guía visual para una versión adaptada y extendida de los métodos publicados recientemente (Roth et al. 31), en el que los husillos básicos se reconstituyen en gotitas de emulsión de agua-en-aceite, comenzando con una número mínimo de componentes. Usando técnicas de microfluídica, gotas esféricas se generan con tamaños que son comparables a las células mitóticas. Dentro de estas gotas, centrosomas purificadas y tubulina se pueden combinar con el fin de estudiar la dinámica de aster microtúbulos, generación de fuerzas y aster-aster interacciones. Por introducir corticales (como dineína) e inter-polares (tales como kinesin-5 / ASE1) de fuerza generadores, nosreconstituir estructuras de huso como cada vez más complejos que comienzan a parecerse a la situación in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Preparation of microfluidic chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask (Photomask on film substrate)</td>
			<td>Selba S.A. Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &#60;1-0-0&#62; 10-20 &#937;-cm, 500-550&#956;m, SSP, w/2 flats)</td>
			<td>WRS Materials</td>
			<td>4P0SSP-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater&#160;</td>
			<td>Polos</td>
			<td>SPIN150I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td>
			<td>Lubribond</td>
			<td>9481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona treater</td>
			<td>Electro-technic products</td>
			<td>BD-20ACV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Microfluidic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant (Span80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>M2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>24x60mm, thickness 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>26x76mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>135840/135841/135843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>PMIRB&#160;</td>
			<td>Any inverted brightfield would suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controler</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-FLEX-4C-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubing</td>
			<td>Cluzeau Info. Labo, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td>
			<td>VWR, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Reconstituting spindle formation and positioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-dithioltheitol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (Guanosine-&#39;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#954;-casein (&#954;-casein from bovine serum milk)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>CLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Introducing spindle-assembly factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (Adenosine-&#39;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &#8805; 97% (enzymatic))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Los métodos presentados en las secciones anteriores permiten la reconstitución de las estructuras de huso como con el aumento de la complejidad mediante el confinamiento geométrico de gotitas de la emulsión de agua-en-aceite. Esta sección describe los resultados representativos que muestran cualitativamente la capacidad de estos ensayos. Durante la mitosis, cuando el huso bipolar está montado, las células completan para formar esferas con un diámetro de aproximadamente 15 micras, medido para las células humanas. Esta forma de la célula mitótica característica proporciona un límite geométrico que tanto restringe y dirige tamaño husillo y orientación 35,36. Técnicas de microfluídica, proporcionan un nivel de confinamiento geométrica que se asemeja con precisión la situación observada en las células vivas y por lo tanto permite la reconstrucción de abajo hacia arriba de husos mitóticos in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; ásteres de microtúbulos son por sí mismos ya capaces de comportamientos complejos cuando el crecimiento de los microtúbulos está restringido por los límites geométricos. A medida que crecen los microtúbulos, fuerzas de empuje generadas por la incorporación de nuevos dímeros de tubulina en coche los dos centrosomas a los lados de las gotitas de emulsión opuestas. Al principio, los centrosomas se difunden libremente en el volumen confinado (Figura 4A, panel izquierdo). Después de aproximadamente 20 a 30 min, los primeros microtúbulos se convierten difusión visible y centrosoma se restringe como microtúbulos crecen contra la corteza en todas las direcciones. Ásteres con los microtúbulos de longitud intermedia (aproximadamente el 50% del diámetro de gota) puede (estéricamente) se repelen entre sí, con los microtúbulos que empujan uno contra el otro, los otros centrosomas y la corteza. Esto se traduce en un típico &#39;bipolar&#39; disposición de tipo huso con los dos centrosomas opuestos entre sí (Figura 4a, panel central). Cuando microtúbulos crecen más de ~ 50% de la gotita-diametro, los centrosomas conseguir empujado más a los límites opuestos de la gota, con los microtúbulos crecen a lo largo de la corteza de gotas (Figura 4A, panel derecho). Es importante señalar que las tasas de crecimiento de los microtúbulos en estos ensayos son muy sensibles a la temperatura y la tubulina concentraciones. Por consiguiente, estos parámetros afectarán fuerte en el momento en el que se observa primero la nucleación y cuando se alcanzan posiciones aster de estado estable. En las células, fuerzas de tracción corticales se generan a través de la formación de los accesorios de carga entre los microtúbulos más los fines de dineína y la corteza asociada. En las células animales, esta asociación depende del complejo Gαi / LGN / NuMA, que se dirige a la membrana plasmática a través de miristoilación N-terminal de Gαi 1. En estos ensayos de reconstitución, el requisito del complejo Gαi / LGN / NuMA se omite acoplando directamente dineína a los lípidos biotinilados a través de laformación de complejos de biotina-estreptavidina-biotina. Estos enlaces son relativamente estables (K D ~ 10 -14 M) 37 y forman rápidamente (generalmente dentro de 10 min después de la formación de gotitas de emulsión, antes de la nucleación de los microtúbulos se hace evidente) (Figura 4b). En presencia de dineína cortical, centrosomas típicamente retienen una posición más central, mientras que en ausencia de dineína, centrosomas son empujados a los lados opuestos de la corteza de gotas (Figura 4c). Estamos razón de esto es el resultado de dos efectos, que prevenir y contrarrestar las fuerzas de empuje de los microtúbulos. (1) La dineína promueve directamente catástrofes microtúbulos, restringiendo así la longitud de los microtúbulos y prevenir el pandeo de los microtúbulos excesiva, y (2) fuerzas de tracción corticales conducir a las fuerzas de centrado netas en los ásteres individuales 8, que contrarrestan las fuerzas de repulsión-aster aster. El difusible reticulante ASE1 induce fOrcés que tienden a aumentar la zona de solapamiento de los microtúbulos antiparalelos 29. Consistente con esto, en presencia de ASE1 (y ausencia de dineína) centrosomas se encuentran muy juntos con ASE1 localizar a los microtúbulos incluido interpolares (Figura 4D). Los miembros de la familia kinesin-5 coche la separación del centrosoma, proporcionando fuerzas de empuje desde dentro del husillo (véase la introducción). En presencia de Cut7 (el S. pombe kinesin-5 ortholog), centrosomas son empujados a lados opuestos de las gotitas de la emulsión, incluso en presencia de ASE1 (Figura 4e). Mediante la combinación de generadores corticales e inter-polares de fuerza, el nivel de complejidad puede incrementarse aún más en estos experimentos, llevando eventualmente a una comprensión global del conjunto de huso mitótico bipolar. Una descripción cuantitativa detallada de estos resultados estarán disponibles en el futuro (Roth et al., Manuscrito en preparación). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Además de observar la posición de los centrosomas en momentos fijos en el tiempo, y su comportamiento en relación a las longitudes observadas de los microtúbulos, valiosa información puede obtenerse siguiendo el proceso de posicionamiento sobre hora. Mediante la reducción de los tiempos de exposición y la intensidad de láser, ahora es posible seguir posicionamiento aster a intervalos de 2 min durante al menos 1 h con blanqueo solamente ~ 30%. Esto permite la monitorización de reunión aster y el posicionamiento de los centrosomas se difunden libremente (0 min.) A través centralizado (12 min.) Para áster descentralizados (36 min y aún más) (Figura 5c). Esto facilita el estudio de la conducta, tanto en estado estacionario y la cinética de ensamblaje del huso. Mediante la combinación de gotas con diferentes contenidos en la misma muestra, es, por ejemplo, posible comparar directamente de posicionamiento y montaje del husillo cinética centrosoma en gotitas con y sin generadores de fuerza corticales (Figura 5b). Figura 1: fuerzas que actúan sobre el huso mitótico Varias moléculas de generación de fuerza actúan sobre los microtúbulos del huso mitótico para promover la formación del huso y posicionamiento.. Los microtúbulos que crecen en la corteza de células generan una fuerza de empuje sobre el centrosoma. dineína cortical (púrpura) captura los microtúbulos depolymerizing y genera una fuerza de tracción sobre los centrosomas. Dentro del husillo, Kinesin-5 proteínas motoras / Cut7 proporcionan una fuerza de deslizamiento hacia el exterior sobre los microtúbulos antiparalelos, mientras que agentes de reticulación de la familia PRC1 / ASE1 generan un opuestas hacia afuera fuerza de deslizamiento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Figura 2:. Microfluidos de diseño de chips (A) Diseño de fotomáscara 4 pulgadas que contiene 4 chips de microfluidos. (B) la representación detallada de un solo chip. Fichas contienen un solo canal de salida y tres canales de entrada, seguido de un polvo de filtro. canal de entrada 1 contiene la fase acuosa, el canal 2 del lípido / aceite de fase y el canal 3 puede ser usado para diluir las gotitas formadas con / aceite-fase lipídica adicional. (C) Representación detallada de la unión donde el / la fase de aceite de lípidos (que viene de la parte superior e inferior) se reúne con la fase acuosa (que viene de la izquierda). En el cruce, las gotas se forman y fluyen hacia el canal de salida a la derecha. (D) la representación detallada de un polvo de filtro con 2 micras canales. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Figura 3:. Metodología para la Formación de agua-en-aceite de emulsión de gotas (A) chip microfluídico y el tubo de la microfluídica en un microscopio de campo brillante. Tanto los tubos el agua y de la fase de aceite de lípidos / están conectados a las entradas de chip 1 y 2 respectivamente. (B) Restricción de chip de microfluidos en el que el agua y los lípidos / aceite-fases se encuentran. Al cambiar las presiones, las gotas de tamaño puede ser controlada. (C) Diseño de las células de flujo recubiertas con PDMS. Después de cargar las gotas en la celda de flujo, los extremos abiertos se cierran con valap adicional. (D) Esquema de la formación de gotas. Las gotitas se utilizan para encapsular los centrosomas, tubulina y componentes adicionales requeridos para la formación del huso mitótico. (E) Esquema de la focalización cortical-dineína. Biotina (Bio) dineína está dirigido a los lípidos a través de biotina estreptavidina (GECT). <ahref = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Figura 4:. Los resultados representativos de huso Reconstituciones con complejidad creciente (A) proyecciones de máxima intensidad de gotitas que contienen dos centrosomas que muestran ejemplos de los microtúbulos cortos, intermedios y largos. Centrosomas y los microtúbulos se visualizaron mediante la adición de 10% HiLyte-488 marcado con la tubulina. Barras de escala = 10 m. (B) La localización de GFP-biotina-dineína-TMR en ausencia (-, izquierda) y presencia (+, derecha) de estreptavidina (GECT). Posicionamiento (C) de microtúbulos aster en ausencia (-, izquierda) o presencia (+, derecha) de cortical GFP-biotina-dineína-TMR. (D) aster microtúbulos (panel izquierdo, green) posicionamiento en presencia de ASE1 (panel central, de color rojo). (E) de microtúbulos aster (panel izquierdo, verde) de posicionamiento en presencia de ASE1 y Cut7 (kinesin-5) (panel central, de color rojo). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Figura 5: Imaging Aster de Posicionamiento Dinámico in vitro (A) Diseño de una taza de PDMS que permite obtener imágenes de gotitas de hasta varias horas.. (B) Generación, almacenamiento y obtención de imágenes de gotitas (transmitida) que contiene diferentes contenidos, ilustrados por la ausencia (izquierda) inclusión (derecha) de dextrano fluorescente (Alexa 647). (C) imágenes planas individuales de una 60 minutos de lapso de tiempo (intervalos de 2 min) tomada de una pila Z (2 micras distancias) del anuncioroplet que contiene un solo centrosoma. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K vistas.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Video: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Title Cell Encapsulation by Droplets

Título encapsulación celular a través de gotitas

Investigación

Biología

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

No invasiva En Vivo Pequeños Animales MRI y MRS: Procedimientos básicos Experimental

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

En Vitro Reconstitución de complejos captadores de luz de Plantas y Algas

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.