We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

<ol>
	<li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+spindle+positioning:+cortical+force+generators+in+the+limelight.">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li><li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+divisions,+fate+decisions.">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li><li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly.">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li><li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation.">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li><li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers:+the+role+of+catastrophes.">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li><li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force.">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li><li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles.">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li><li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters.">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li><li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules.">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li><li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos.">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li><li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos.">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li><li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex.">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li><li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans.">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li><li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+mitosis+with+cell+polarity:+Molecular+motors+at+the+cell+cortex.">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li><li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+production+by+disassembling+microtubules.">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li><li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein.">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li><li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae.">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks.">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li><li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations.">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+of+kinesin-5.">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li><li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+function+of+Ase1p:+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins.">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li><li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast.">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules.">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li><li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast.">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone.">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li><li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart.">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li><li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks.">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li><li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division,+meiotic+nuclear+oscillation,+and+cytokinesis+checkpoint+signaling.">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li><li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cortical+Dynein+function.">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li><li>Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+centrosome+isolation+from+cultured+animal+cells.">Method of centrosome isolation from cultured animal cells.</a> Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation.">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells.">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments.">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li><li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis.">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning.">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li><li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast.">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li><li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device.">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

yöntemleri su içinde yağ emülsiyonu damlacıkları temel mitotik iğ sulandırmak için burada mevcut son çabaları anlattı. geometrik sınırları içinde mili takımını okuyan birçok avantaj sağlamaktadır. Önemli geribildirim mekanizmaları mitotik iğin mikrotübüllerin ve monte edildiği geometrik kısıtlamaları arasında var. Mikrotübülüsler onlar mitotik iğ yerinden neden olabilir geometrik sınırları içine büyüyünce kuvvetleri itme üretebilir. Buna ek olarak, fiziksel bir engel büyüyen mikrotübül felaketler neden olabilir. Ayrıca, dar bir geometriye olan aks takımı da doğrudan mikrotübül büyüme oranı 36 etki gibi tübülin müstakil bileşenler, kademeli bir tükenmesine neden olabilir. Bunlar burada tarif edilen deneyler kullanılarak ele alınabilir mili montaj tüm temel belirleyicileri vardır. tarif edilen deneyler, küçük bir konsantrasyon differe çok duyarlıdırDamlacık bileşenleri nces. Bu küçük konsantrasyon farklılıkları ya da çok yavaş ya da çok hızlı bir mikrotübül büyümesiyle sonuçlanır tubulin, için de geçerlidir. Bu durumda, mikrotübül büyüme oranları genellikle de Deneyin birinci ~ 30 dakika boyunca sıcaklığı ayarlanarak düzeltilebilir. Mitotik iğ takımı ve yerleştirilmesi de (kortikal) kuvveti jeneratör konsantrasyonundaki değişikliklere çok hassastır. Bu temizlenmiş bileşenlerin konsantrasyonu, saflık ve aktivitesine bağlıdır olasıdır ve her yeni saflaştırılmış protein için dikkatle takip edilmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, belirli bir dengeler tahlilin doğasına bağlı olarak, görüntüleme ayarlarında yapılmalıdır. Başlangıçta, çözünür floresan tübülin dimerleri yüksek seviyede görüntü bireysel mikrotübüllere güçleştirmektedir. mikrotübüller uzun büyümek ve çözünür tübülin yavaş yavaş tükenmiş gibi, sinyal-gürültü oranı giderek yüksek olur ve individu görüntülenmesine olanak tanımaktadıral mikrotübülüsler. Açık sistemlerde kurulumları aksine, geometrik sınırlandırıcı önemli bir ağartma sonuçlanan bir kütle rezervuar içinde floresan moleküller ve oksijen temizleme sistemi bileşenlerinin alışverişini önler. Özellikle, zaman içinde mili montaj ve yerleştirme kontrolü için, bu da güçlü bir oksijen tutucu sisteminin varlığında, düşük ışık yoğunlukları ile görüntü için gereklidir. Bu yöntemler in vitro basitleştirilmiş aks-benzeri yapıların aşağıdan yukarı sulandırma sağlar. Burada tanıtılan bileşenlere ek olarak, diğer birçok faktöre vb 3 çift kutuplu spiralin teşekkülünün, konumlandırma, yönlendirme, şekillendirme, etkilemek için tarif edilmiştir. Bu sistem ayrıca ilave kuvvet jeneratörler bireysel ve kombine etkilerini incelemek için genişletilebilir. Bu sistem şu anda bulunmadığına iğ oluşumuna önemli katkıda mitotik kromozom vardır. Mitotik kromatin gösterilmiştir&#39;polar-çıkarma kuvvetleri&#39; 3, (2) kromatin bağlı RanGEF RCC1 38 tarafından RanGTP degrade oluşumu, (3) kinetokorlar (depolimerizasyon ile etkileşimde bulunabilirsiniz sözde meydana getirebilirler (1) chromokinesins doğrudan mili oluşumu ) mikrotübüller 39 ve (4) karşıt mikrotübüllerin 40 arasında-mekanik bir yay gibi işlev görebilir kromatin kendisi. Son olarak, açıklanan sistem şu anda sınırlı zamansal ve mekansal aktivite üzerinde kontrol ve tanıtılan kuvvet jeneratörlerin lokalizasyonu sağlar. hücrelerinde, bir çok mil takımı faktörler, belirli bölümlerinde lokalize veya sınırlı bir zaman aralığı içinde etkilidir. Çarpıcı bir örnek özellikle C arka tarafında zenginleştirilmiş dinein aktivitesi olduğunu elegans tek hücreli aşamada embriyo asimetrik iğ konumlandırma ve hücre bölünmesini teşvik etmek. Bu sistemde, şu anda böyle bir t taklit olasılığını araştırıyoropto genetik tekniklerle ödünç emporal ve asimetrik aktivite kullanarak yöntemleri. Buna ek olarak, aynı C için geçerlidir elegans embriyo ve sert hücre duvarı ile hücreler, birçok hücre mitoz kadar yuvarlak değil. Geometrik hapsi şekli miline 41 üzerinde etkili kuvvetlerin üzerinde temel bir etkiye sahip olacaktır. Nedenle potansiyel olarak şekillendirme ve emülsiyon depolanması 42,43 damlacıkları izin daha karmaşık mikroakışkan sistemleri kullanarak, hem de küresel olmayan damlacıkları mili montaj ve konumlandırma sulandırmak için önemli olacaktır. Son olarak, doku, hücre-hücre ve hücre-alt-tabaka sinyal ve bağlantı genellikle epitel hücrelerinde olduğu gibi, yönlendirilmiş mili yönünde çevrilebilir dış işaretlere sağlar ve kök hücreleri. Bu özel tüm yönleriyle bu çalışmada dikkate alınmamıştır ve mitotik iğ assemb in vivo benzeri daha reconstitutions doğru inşa etmek için gelecek zorlukları sağlayabilirly ve konumlandırma.

mitoz sırasında, çoğaltılan genom kromozomları yeni kurulan kızı hücreleri üzerinde kardeş kromozomlardalerde eşit dağılımını sağlamak için hücre ekvatorda düzenlenmektedir. Kromozom konumlandırma ve segregasyon iki karşıt sentrozom kaynaklanan mili mikrotübül onların eki aracılık eder. Sadık kromozom dağılımı sağlamanın yanı sıra, mitotik iğ yönü de hücre bölünmesi uçağı 1 belirler. Hücre bölünmesinin koordine yönlendirme gelişimi birçok aşamaları sırasında ve doku homeostazında 2 için gereklidir. Özellikle, düzenlenen mitotik iğ konumlandırma hücresel içeriği asimetrik dağılımı neden olabilir, hatta farklı boyutlarda 2 kızı hücrelerini üretirler. Mitotik iğ montaj ve oryantasyon profaz başlar ve işbirliği ve kuvvet-jeneratörler 3,4 karşısına arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra edildiği. kuvvetlerin b oluşuroth çekme ve itme kuvvetleri. Bu kuvvetler, hücre korteks ile iş mili kontaklar olarak silindirin içinde hem de üretildiği ve mikrotübül dinamiklerine göre yanı sıra moleküler motorlar ve çapraz bağlayıcıların (Şekil 1) tarafından oluşturulmuş olabilir. mikrotübülüsler hücre korteks gibi sert yapılara karşı büyüyünce Pushing kuvvetleri oluşturulabilir. Sistem içinde üretilen toplam direnç kuvveti bağlı olarak, bu mitotik iğ (düşük güçler) yeniden konumlandırılması ile sonuçlanabilir veya mikrotübül burkulma veya felaket (yüksek kuvvetler) 5-8 tetikleyebilir. Uzunluğu 9 mikrotübül burkulma güçlü bir belirleyici olduğu iterek oluşturulabilir kuvvetin miktarı, mikrotübül uzunluğuna bağlıdır. Buna ek olarak, tek bir sentrozom kaynaklanan mikrotübüller diğer sentrozom karşı erken profaz 3,10 içinde sentrozom ayırmanın gerçekleştirilmesi için öne sürülmüştür bir mekanizma itebilir. Reklamdabüyüyen mikrotübül tarafından oluşturulan kuvvetleri itme, mikrotübül temas biter hücre korteksine koşul da güçleri 11 çekerek arabuluculuk yapabilirsiniz. Birden laboratuvarların Çalışmalar kortikal kuvvet jeneratör kontrollü aktivite vivo 1 mitotik iğ asimetrik konumlandırma için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu çekme kuvveti için gerekli (bundan böyle &#39;dinein &quot;olarak adlandırılır) korteks lokalize sitoplazmik dinein, eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motor proteinlerinden 8,12,13 olup. Örneğin, maya, korteks 14 boyunca kayar motora bağlı mikrotübül mikrotübül kafes sonucu kortikal dinein yanal etkileşimleri tomurcuklanmasına. Ancak, kortikal çekme kuvvetleri de Mikrotübülleri 8 depolimerizasyon için son ekleri oluşturmak için dinein yeteneği ile oluşturulabilir. Mikrotübül büzülme tarafından üretilen enerji genellikle daha yüksek büyüklükte bir sipariş kuvvetler yol açabilir (~ 50 pN (15 referans </syukarı&gt;)) bireysel motorlu proteinler tarafından oluşturulan kuvvetler daha (~ 7-8 pN (ref. 16)). Depolimerizasyon mikrotübül kortikal dinein sonu-on eki tomurcuklanan maya 17 ve C mili konumlandırma teşvik elegans 13. Motor bağımlı kayma ve mikrotübül depolimerizasyon tahrik hem kortikal çekme kuvvetleri işbirliği ya da in vivo birbirini dışlayan olup olmadığını mevcut bilinmeyen yer almaktadır. mikrotübül itme kuvvetleri ve dinein aracılı kortikal çekme kuvveti ek olarak, sentrozom konumlandırma çok sayıda başka proteinlerle mitotik iğ içinden kontrol edilir. Kinesin-5 motorlar, örneğin, dışarı doğru kayar kuvvetleri 18-20 üretimi ile sonuçlanan, antiparalel interpolar mikrotübülleri bağlantı çapraz tetramerler olarak mevcuttur. Kinesin-5 Motor ailesinin üyeleri C haricinde, incelenen tüm ökaryotlarda sentrozom ayırma ve çift kutuplu spiralin montaj için gerekli olan elegans<html> (referans 21 gözden). Ayrıca, ASE1 / PRC1 ailesinin yayılabilir çapraz bağlayıcılar de in vivo ve in vitro 22-27 interpolar mikrotübül mikrotübül bölgelerinin üst üste lokalize edilmesi için bilinmektedir. Örtüşen mikrotübül bölgenin ASE1 odaklı genleşme kuvvetlerin vitro 28,29 bölgesindeki kinesin-14 aracılı sürme kuvvetleri dengelemek için yeterince büyüktür. Hücrelerde, ASE1 / PRC1, mil orta sonda 25-27,30 mikrotübül bölgeleri üst üste yayılabilir çapraz bağlayıcılar tarafından oluşturulan kuvvetleri önemli derecede mili düzenlenmesine katkıda düşündüren kararlı oluşumu için gereklidir. Son olarak, mitoz kromatin gelen kuvvetler ve kinetokorlar çeşitli yollar 3 ile mitotik iğ montaj ve konumlandırma etkilemektedir. Bu bileşenler Burada tarif edilen sulandırma deneyleri parçası olmadığından, bunlar ayrıntılı olarak ele alınmayacaktır. jove_content &quot;&gt; Farklı teoriler yukarıda açıklanan farklı moleküler bileşenleri ve kuvvetler iğ montaj ve konumlandırma işbirliği nasıl var, ancak biz niceliksel bir anlayış hala uzağız. Buna ek olarak deneylere canlı hücrelerde, saflaştırılmış bileşenler ile in vitro deneyler güçlü sağlamak rota Bu hedefe ulaşmak için. Burada, temel iğ su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıkları içinde yeniden edildiği en son yayınlanan yöntemlerin adapte edilmiş ve genişletilmiş versiyonu (Roth et al. 31), bir görsel bir kılavuz mevcut bulunduklarında, bir ile başlayan mikroakışkan teknikler kullanılarak bileşenleri minimum sayısıdır., küresel damlacıklar mitotik hücre karşılaştırılabilir boyutlarda oluşturulacak. bu damlacıklar içinde, saflaştırılmış sentrozom ve tübülin, mikrotübül aster dinamikleri üzerinde çalışmak üretimi ve aster-aster etkileşimleri zorlamak için birleştirilebilir. tarafından kortikal (örneğin dinein gibi) ve inter-polar (örneğin kinesin-5 / ASE1) kuvvet jeneratörler tanıtan, bizin vivo durumu benzemeye başlar giderek karmaşık mili benzeri yapılar sulandırmak.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Preparation of microfluidic chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask (Photomask on film substrate)</td>
			<td>Selba S.A. Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &#60;1-0-0&#62; 10-20 &#937;-cm, 500-550&#956;m, SSP, w/2 flats)</td>
			<td>WRS Materials</td>
			<td>4P0SSP-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater&#160;</td>
			<td>Polos</td>
			<td>SPIN150I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td>
			<td>Lubribond</td>
			<td>9481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona treater</td>
			<td>Electro-technic products</td>
			<td>BD-20ACV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Microfluidic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant (Span80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>M2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>24x60mm, thickness 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>26x76mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>135840/135841/135843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>PMIRB&#160;</td>
			<td>Any inverted brightfield would suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controler</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-FLEX-4C-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubing</td>
			<td>Cluzeau Info. Labo, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td>
			<td>VWR, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Reconstituting spindle formation and positioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-dithioltheitol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (Guanosine-&#39;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#954;-casein (&#954;-casein from bovine serum milk)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>CLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Introducing spindle-assembly factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (Adenosine-&#39;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &#8805; 97% (enzymatic))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Önceki bölümlerde sunulan yöntemler su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıklarının geometrik tutulmasını kullanılarak karmaşıklığı arttıkça aks-benzeri yapıların tekrar oluşturulmasını sağlar. Bu bölümde niteliksel bu tahlillerin yeteneği gösteren temsili sonuçlarını açıklar. Bir çift kutuplu spiralin monte edildiğinde, mitoz sırasında, hücreler insan hücreleri için ölçülen yaklaşık 15 um bir çapı olan küreler oluşturmak için yuvarlak. Bu özellik mitotik hücre şekil kısıtlar hem iğ boyutunu ve yönlendirmesini 35,36 yönlendiren bir geometrik sınır sağlar. Mikroakışkan teknikleri, doğru canlı hücrelerde gözlenen durumun benzer ve bu nedenle in vitro mitotik iğ aşağıdan yukarıya yeniden izin geometrik hapsi düzeyi sağlamak. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-mikrotübül büyümesi geometrik sınırlarla kısıtlı olduğunda sayfa = &quot;1&quot;&gt; Mikrotubul asters zaten kendileri tarafından karmaşık davranış yeteneğine sahiptirler. mikrotübül büyüdükçe, yeni, tubulin dimerlerinden eklenmesi ile oluşturulan itme kuvvetleri emülsiyon damlacıklarının yanları iki sentrozom sürücü. İlk başta, sentrozomlar serbestçe sınırlı hacim (Şekil 4a, sol panel) içinde yaygın. yaklaşık 20-30 dakika sonra, ilk mikrotübül mikrotübül her yöne korteks karşı büyüdükçe görünür ve sentrozom difüzyon sınırlı olur olur. ara madde uzunlukta (damlacık çapının yaklaşık% 50) mikrotubul Asters (sterik) ve diğer sentrozom korteks birbirlerine karşı itme mikrotübüller ile birlikte, her biri başka bir dağılmasına neden olabilir. Bu birbirine (Şekil 4a, orta panel) karşıt iki sentrozom tipik bir &#39;bipolar&#39; iğ gibi düzenleme ile sonuçlanır. mikrotübül damlacık-dia ~% 50 daha uzun büyüyüncemetre, sentrozomlar damlacık korteks (Şekil 4a, sağ panel) boyunca büyüyen mikrotübül ile damlacık karşıt sınırları daha da itti olsun. Deneylerde mikrotübül büyüme oranları, sıcaklık ve tübülin konsantrasyonlarında hem çok hassas olduğunu not etmek önemlidir. çekirdeklenme ilk gözlendiğinde ve kararlı durum aster pozisyonları ulaşıldığında Bu parametreler, bu nedenle güçlü süresini etkiler. hücrelerde, kortikal çekme kuvvetleri mikrotübül artı sonları ve korteks ile ilişkili dinein arasındaki yük taşıyan ekleri oluşumu yoluyla oluşturulur. Hayvan hücrelerinde, bu ilişki Gαi 1 N-terminal miristoilasyon ile plazma membranına hedeflenen Gαi / LGN / numa kompleksi bağlıdır. Bu yeniden yapılanma tahlillerde, Gαi / LGN / numa kompleksinin gereksinimi doğrudan aracılığıyla biyotinile lipidler için dynein birleştirilmesi suretiyle atlanırbiyotin-streptavidin-biyotin kompleksleri oluşumu. Bu bağlar nispeten sabit (Kd ~ 10 -14 M) 37 ve hızla meydana (genellikle mikrotübül çekirdeklenme belirgin hale gelmeden önce, bir emülsiyon damlacık oluşumundan sonra, 10 dakika içinde) (Şekil 4b). Dinein yokluğunda, sentrozom damlacık korteks (Şekil 4c) karşıt kenarlarına itilir ise kortikal dinein mevcudiyetinde, sentrozom tipik haliyle, daha merkezi olarak korurlar. Biz Bunu önlemek ve mikrotübül iterek kuvvetleri karşı iki etkinin sonucudur muhakeme. (1) Dinein doğrudan mikrotübül felaketleri, böylece mikrotübül uzunluğu kısıtlayan ve aşırı mikrotübül burkulma önlenmesi ve (2) kortikal çekme kuvvetleri aster-aster itme kuvvetleri karşı bireysel asters 8, net merkezleme kuvvetlerine yol teşvik etmektedir. ASE1 f indükleyen yayılabilir çapraz bağlayıcıeğilimi orces anti-paralel mikrotübüllerin 29 örtüşen bölgeyi artırmak için. Bununla uyumlu olarak, (dinein ve yokluğu) ASE1 varlığında sentrozomlar ASE1 interpolar Mikrotübülleri (Şekil 4d) birlikte için lokalize ile birbirine yakın bulunmuştur. kinesin-5 aile fertleri (giriş bölümüne bakınız) mili içinden iterek güçleri sağlayarak sentrozom ayrımı sürücü. Cut7 (S. pombe kinesin-5 ortolog) varlığında, sentrozom da ASE1 (Şekil 4e) varlığında, emülsiyon damlacıklarının karşıt taraflarında itilir. kortikal ve inter-polar kuvvet jeneratörleri birleştirerek, karmaşıklık düzeyi daha nihayetinde bipolar mitotik iğ düzeneğinin kapsamlı bir anlayış neden bu deneylerde artırılabilir. Bu sonuçların detaylı niceliksel açıklamalar, gelecekte var olacak (Roth ve ark., Lığa). <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; zaman içinde sabit anlarda sentrozom konumuna dikkat ve mikrotübül gözlenen uzunlukları davranışlarını ilgili ek olarak, değerli bilgiler üzerinden konumlandırma işlemi uygulayarak elde edilebilir zaman. etki süreleri ve lazer yoğunlukları azaltarak, sadece ~% 30 ağartılması ile en az 1 saat boyunca 2 dakikalık aralıklarla aster konumlandırma takip etmek mümkündür. Bu merkezi aracılığıyla serbestçe difüzyon sentrozom gelen aster montaj ve konumlandırma izleme (0 dak.) Izin verir (12 dk.) Ademi asters (36 dk ve daha fazla) (Şekil 5c) için. Bu kararlı hal davranışı ve mili montaj kinetik hem de çalışma kolaylaştırır. Aynı numunedeki farklı içeriklerle damlacıkların birleştirerek, örneğin, mümkün olan doğrudan (Şekil 5B) ve kortikal güç jeneratörleri olmayan damlacıklar halinde sentrozom konumlandırma ve mil düzeneği kinetiğinin karşılaştırılması vardır. Şekil 1: Kuvvetler Mitotik Mil üzerinde hareket Çeşitli kuvvet üreten moleküller iğ oluşumunu ve konumlandırma teşvik etmek için mitotik milin mikrotübüller hareket.. Hücre korteks içine büyümeye mikrotübül sentrozom bir itme kuvveti oluşturur. (Mor) Kortikal dinein depolimerizasyon mikrotübülleri yakalar ve sentrozom üzerine bir çekme kuvveti oluşturur. PRC1 / ASE1 ailesinin çapraz bağlayıcılar bir kuvvet sürgülü dışa karşı oluşturmak ise mili içinde, kinesin-5 / Cut7 motor proteinler, anti-paralel mikrotübüller üzerinde dışa doğru kayar kuvveti sağlamak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Şekil 2:. 4 mikroakışkan çipleri içeren 4 inçlik photomask mikroakışkan Chip Tasarım (A) tasarımı. (B) tek bir yonga detaylı gösterimidir. Fişleri bir çıkış kanalı ve bir toz filtresi ve ardından üç giriş kanalı ihtiva eder. Giriş kanalı 1 su fazı içeren, lipit / Yağ fazında ve kanal 3 2 kanallı ilave lipit / yağ-fazı ile oluşturulan damlalar seyreltilmesi için de kullanılabilir. (C) (üstten ve alttan gelen) lipit / yağ fazı (soldan geliyor) su fazı ile bir araya geldi kavşak detaylı gösterimi. Kavşakta, damlacıklar oluşturacak ve sağdaki çıkış kanalına doğru akar. (D) 2 mikron kanallı bir toz filtresi detaylı gösterimi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Şekil 3:. Su içinde yağ emülsiyonu damla oluşumu için Yöntem (A) parlak alan mikroskop mikroakışkan çipi ve Mikroakiskan boru. Hem su ve lipid / yağ fazı tüpler, sırasıyla çip girişler 1 ve 2&#39;ye bağlıdır. Su ve lipid / yağ safhaları karşılayan Mikroakiskan yonga üzerinde (B) Kısıtlama. basınçları değiştirerek, damlacıklar büyüklüğü kontrol edilebilir. PDMS kaplı akış hücrelerinin (C) tasarımı. akış hücre içine damlacıklar yükledikten sonra, açık uçları ek valap ile kapatılır. (D) damla oluşumunun şematik. Damlacıklar sentrozom, tubulin ve mitotik iğ formasyonu için gerekli olan ek bileşenler kapsüllenmesi için kullanılmaktadır. Kortikal-dynein hedefleme (E) şematik. Biyotinile (Bio) dynein streptavidin (STRP) aracılığıyla biyotinile lipidler hedeflenmektedir. <a= &quot;Https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot; href&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Şekil 4:. Karmaşıklığı artırılması ile Mili-Reconstitutions Temsilcisi Sonuçlar (A), kısa, orta ve uzun mikrotübül örneklerini gösteren iki sentrozom içeren damlacıkların maksimum yoğunluğu projeksiyonları. Sentrozom ve mikrotübüller,% 10 HiLyte-488 tubulin etiketli ilave tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubukları 10 mikron =. (- Sol) ve streptavidin (STRP) varlığı (+, sağ) yokluğunda GFP biyotin-dinein-TMR (B) lokalizasyonu. Kortikal GFP-biotin-dynein-TMR (sağ +) - (sol) veya varlığı (C) Mikrotubul aster yokluğunda konumlandırma. (D) Mikrotubul aster (sol panel, green ASE1 varlığında) yerleştirme (orta panel, kırmızı). ASE1 ve Cut7 (kinesin-5) (orta panel, kırmızı) varlığında (E) Mikrotubul aster (sol panel, yeşil) konumlandırma. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Şekil 5: in vitro Görüntüleme Aster Konumlandırma Dinamikleri (A) birçok saat kadar için damlacık görüntüleme sağlayan bir PDMS fincan tasarımı.. (B) Üretimi, depolama ve damlacıkların görüntüleme floresan dekstran yokluğunda (solda) içerme (sağ) (Alexa 647) ile izah farklı içerikleri içeren (iletilen). (C) 60 dk time-lapse Tek düzlemi görüntüleri (2 dk aralıklarla) reklamın z-yığının (2 mikron mesafeler) alınanTek bir centrosome içeren roplet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets at JoVE.com

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Görüntüleme.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Video: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Title Cell Encapsulation by Droplets

Droplets tarafından Başlığı Hücre Kapsülleme

Biyoloji

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

Noninvaziv In Vivo Küçük Hayvan MRG ve MRS: Temel Deneysel Prosedürler

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.