We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

<ol>
	<li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+spindle+positioning:+cortical+force+generators+in+the+limelight.">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li><li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+divisions,+fate+decisions.">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li><li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly.">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li><li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation.">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li><li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers:+the+role+of+catastrophes.">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li><li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force.">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li><li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles.">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li><li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters.">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li><li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules.">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li><li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos.">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li><li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos.">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li><li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex.">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li><li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans.">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li><li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+mitosis+with+cell+polarity:+Molecular+motors+at+the+cell+cortex.">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li><li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+production+by+disassembling+microtubules.">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li><li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein.">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li><li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae.">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks.">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li><li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations.">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+of+kinesin-5.">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li><li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+function+of+Ase1p:+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins.">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li><li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast.">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules.">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li><li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast.">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone.">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li><li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart.">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li><li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks.">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li><li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division,+meiotic+nuclear+oscillation,+and+cytokinesis+checkpoint+signaling.">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li><li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cortical+Dynein+function.">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li><li>Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+centrosome+isolation+from+cultured+animal+cells.">Method of centrosome isolation from cultured animal cells.</a> Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation.">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells.">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments.">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li><li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis.">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning.">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li><li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast.">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li><li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device.">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Methoden, die hier vorliegenden jüngsten Bemühungen beschriebenen Grund Mitosespindeln in Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen zu rekonstituieren. Studieren Spindelanordnung innerhalb geometrischen Grenzen bietet zahlreiche Vorteile. Wichtige Feedback-Mechanismen existieren zwischen Mikrotubuli der mitotischen Spindel und die geometrischen Zwänge, in denen sie zusammengesetzt sind. Mikrotubuli erzeugen können Kräfte drängen, wenn sie in geometrische Grenzen wachsen, die in mitotischen Spindel Verschiebung zur Folge haben kann. Darüber hinaus kann in eine physikalische Barriere wachsenden Mikrotubuli Katastrophen induzieren. Auch Spindelanordnung innerhalb eines begrenzten Geometrie kann zu einer allmählichen Erschöpfung der einzelnen Komponenten führen, wie Tubulin, die wiederum direkt die Rate Mikrotubuli Wachstum beeinflußt 36. Dies sind alles wesentliche Determinanten der Spindelanordnung, die untersucht werden können unter Verwendung der Assays hier beschrieben. Die beschriebenen Assays sind sehr empfindlich gegenüber kleinen Konzentration differences der Tröpfchen Komponenten. Dies ist der Fall für Tubulin, wo kleinere Konzentrationsunterschiede in entweder zu langsam oder zu schnelle Mikrotubuli Wachstum führen kann. In diesem Fall kann die Mikrotubuli Wachstumsraten oft noch durch Einstellen der Temperatur während der ~ 30 min des Versuchs zuerst korrigiert werden. Mitotischen Spindelanordnung und Positionierung ist auch sehr empfindlich gegenüber Variationen in der Konzentration von (cortical) Kraftgeneratoren. Dies ist wahrscheinlich auf die Konzentration, Reinheit und Aktivität der gereinigten Komponenten abhängt und für jede neu gereinigte Protein sorgfältig titriert werden muss. Darüber hinaus haben bestimmte Kompromisse in Abbildungseinstellungen vorgenommen werden, abhängig von der Natur des Assays. Zu Beginn ein hohes Maß an löslichen fluoreszierenden Tubulindimeren machen es schwierig, zu Bild einzelnen Mikrotubuli. Wie Mikrotubuli länger werden und lösliche Tubulin wird langsam aufgebraucht, wird das Signal-zu-Rausch-Verhältnis allmählich höher und erlaubt die Abbildung von individual Mikrotubuli. Im Gegensatz zu den Setups mit offenen Systemen verhindert die geometrische Confinement den Austausch von fluoreszierenden Molekülen und Sauerstofffänger Systemkomponenten innerhalb eines Bulk-Reservoir, in signifikanten Bleichen führt. Insbesondere zur Überwachung Spindelanordnung und Positionierung im Laufe der Zeit ist es dem Bild erforderlich mit niedriger Lichtintensitäten, selbst in Gegenwart eines starken Sauerstoff-Scavenger-System. Diese Verfahren ermöglichen die Bottom-up - Rekonstitution von vereinfachten spindelartigen Strukturen in vitro. Zusätzlich zu den Komponenten hier eingeführt sind viele andere Faktoren beschrieben worden bipolar Spindelbildung zu beeinflussen, Positionierung, Ausrichtung, Formen etc. 3. Dieses System kann weiter die einzelnen und kombinierten Effekte von zusätzlichen Kraftgeneratoren zu studieren erweitert werden. Wichtige Beiträge zur Spindelbildung, die derzeit von diesem System nicht vorhanden sind, sind die mitotischen Chromosomen. Mitotische Chromatin hat sich gezeigt,direkte Spindelbildung durch (1) chromokinesins , die so genannte 3 &#39;polar-Ausstoßkräfte erzeugen kann, (2) die Bildung eines RanGTP Gradienten durch die Chromatin-gebundenen RanGEF RCC1 38, (3) Kinetochore , die mit interagieren können (Depolymerisation Mikrotubuli) 39 und (4) das Chromatin selbst, die als eine mechanische Feder in-zwischen gegenüberliegenden Mikrotubuli 40 funktionieren kann. Schließlich bietet das beschriebene System noch begrenzte zeitliche und räumliche Kontrolle der Aktivität und Lokalisierung von eingeführten Kraftgeneratoren. In Zellen lokalisieren viele Spindelanordnung Faktoren an bestimmte Kompartimente oder aktiv sind innerhalb eines begrenzten Zeitfensters. Ein eindrucksvolles Beispiel ist die Aktivität von Dynein, die speziell an der hinteren Seite des C angereichert ist elegans ein Zellstadium Embryo asymmetrische Spindelpositionierung und die Zellteilung zu fördern. In diesem System untersuchen wir derzeit die Möglichkeit einer solchen nachahmt temporal und asymmetrische Aktivität unter Verwendung von Methoden aus der optogenetischen Techniken entlehnt. Darüber hinaus, wie es der Fall für die C. elegans Embryo und Zellen mit einer starren Zellwand, viele Zellen abrunden nicht in der Mitose. Die Form der geometrischen Haft wird einen grundlegenden Einfluss auf die Kräfte haben auf die Spindel wirkende 41. Es ist daher wichtig, Spindelanordnung und die Positionierung in nicht-kugelförmige Tröpfchen als auch zur Rekonstitution, potenziell komplexer mikrofluidischer Systeme , die ermöglichen die Gestaltung und Speicherung von Emulsionströpfchen 42,43. Schließlich in Geweben, Zell-Zell- und Zell-Substrat-Signalisierungs- und Befestigungs externe Signale liefern, die in gerichtete Spindelorientierung übersetzt werden kann, wie es oft in Epithelzellen und Stammzellen beobachtet wird. Alle diese speziellen Aspekte haben in dieser aktuellen Studie berücksichtigt und könnten die Herausforderungen der Zukunft bieten zu bauen in Richtung mehr in vivo -ähnlichen Rekonstitutionen der mitotischen Spindel assemb nichtly und Positionierung.

Während der Mitose werden die Chromosomen des Genoms replizierten an der Zell Äquators organisiert gleichmäßige Verteilung der Schwesterchromatiden über den neu gebildeten Tochterzellen gewährleisten. Chromosome Positionierung und Segregation wird vermittelt durch ihre Bindung an Mikrotubuli Spindel aus zwei gegenüberliegenden Zentrosomen stammen. Neben treuen Chromosomenverteilung zu gewährleisten, bestimmt die Orientierung der mitotischen Spindel auch die Zellteilungsebene 1. Koordinierte Ausrichtung der Zellteilung ist während vieler Stadien der Entwicklung und für Gewebshomöostase 2 wesentlich. Insbesondere kann geregelt mitotischen Spindelpositionierung in der asymmetrischen Verteilung von zellulären Inhalte führen oder sogar Tochterzellen unterschiedlicher Größe 2 produzieren. Mitotischen Spindelanordnung und Orientierung beginnt in Prophase und wird durch ein komplexes Zusammenspiel orchestriert zwischen kooperierenden und Antagonisierung Kraftgeneratoren 3,4. Die erzeugten Kräfte bestehen aus both Zug- und Druckkräfte. Diese Kräfte entstehen sowohl aus Spindel Kontakte mit der Zelle Kortex sowie aus der Spindel, und kann durch die Dynamik der Mikrotubuli sowie von molekularen Motoren und Vernetzern (Figur 1) erzeugt werden. Schubkräfte erzeugt werden, wenn die Mikrotubuli wachsen gegen starre Strukturen wie die Zelle cortex. In Abhängigkeit von der Gesamtwiderstandskraft innerhalb des Systems erzeugt wird , kann dies zur Folge haben in Neupositionierung der mitotischen Spindel (geringe Kräfte) oder Mikrotubuli Knicken oder Katastrophe (hohe Kräfte) 5-8 auszulösen. Die Menge an Kraft , die durch Druck hängt von Mikrotubuli Länge erzeugt werden kann, da Länge eine starke Determinante von 9 Mikrotubuli-Knicken. Darüber hinaus kann die Mikrotubuli , die von einem Zentrosomen stammen schieben gegen den anderen Zentrosomen, einen Mechanismus, der Prophase in frühen Zentrosomen Separation zum Antrieb 3,10 wurde vorgeschlagen. In der Werbungdition Kräften , die durch wachsende Mikrotubuli Mikrotubuli - Enden in Kontakt der Zelle Kortex schieben vermitteln kann auch Kräfte 11 ziehen. Untersuchungen von mehreren Laboratorien haben gezeigt , daß die gesteuerte Aktivität von kortikalen Kraftgeneratoren für die asymmetrische Positionierung der mitotischen Spindeln in vivo 1 erforderlich ist. Wesentlich für diese Zugkräfte ist Cortex-lokalisierte zytoplasmatischen Dynein (im Folgenden als &quot;Dynein&quot; genannt), ein Minus-Ende gerichtet Mikrotubuli Motorprotein 8,12,13. Zum Beispiel, Hefe, lateralen Wechselwirkungen der kortikalen dynein mit dem Mikrotubuli - Gitter Ergebnis in motorabhängigen Mikrotubuli entlang der Hirnrinde gleitenden 14 in Knospung. Jedoch kann kortikalen Zugkräfte auch durch die Fähigkeit der Dynein erzeugt werden 8 end-on Anlagen Depolymerisation von Mikrotubuli zu bilden. Die Energie , die von Mikrotubuli Schrumpfung erzeugt wird, kann zu Kräften führen, die im Allgemeinen eine Größenordnung höher (~ 50 pN sind (Referenz 15 </sup&gt;)) als die Kräfte , die von einzelnen Motorproteine ​​(~ 7-8 pN (ref erzeugt. 16)). End-on Befestigung der kortikalen dynein zu Depolymerisation von Mikrotubuli fördert Spindelpositionierung in Bäckerhefe 17 und C. elegans 13. Ob beide motorabhängigen Schiebe- und Mikrotubuli Depolymerisation angetrieben kortikalen Zugkräften zusammenarbeiten können oder sich gegenseitig aus in vivo ist derzeit nicht bekannt. Zusätzlich zu Mikrotubuli Schubkräfte und Dynein-vermittelte kortikalen Zugkräften wird Zentrosom Positionierung innerhalb der mitotischen Spindel durch zahlreiche andere Proteine ​​gesteuert. Kinesin-5 - Motoren, beispielsweise existieren , wie Tetramere , die antiparallele Mikrotubuli interpolaren vernetzen kann, was in der Erzeugung von nach außen gleitenden Kräfte 18-20. Mitglieder der Kinesin-Motor 5 - Familie sind für Zentrosomen Separation und bipolar Spindelanordnung in allen Eukaryonten erforderlichen sucht, mit der Ausnahme von C. elegans<html> (Übersicht in Bezug 21). Darüber hinaus diffusionsfähige Vernetzer der ASE1 / PRC1 Familie werden auch überlappende Mikrotubuli Regionen von interpolaren Mikrotubuli in vivo zu lokalisieren bekannt und in - vitro - 22-27. Die Kräfte , die durch ASE1 getriebene Expansion des überlappenden Mikrotubuli-Region sind groß genug , Kinesin-14 vermittelte Schiebekräfte in vitro 28,29 entgegenzuwirken. In den Zellen wird ASE1 / PRC1 für stabile Bildung erforderlich Mikrotubuli Regionen in der Spindel Mittelbereich überlappender 25-27,30, was darauf hindeutet , dass die durch diffusionsfähige Vernetzer erzeugten Kräfte wesentlich zur Spindel Organisation beitragen können. Schließlich Kräfte aus der mitotischen Chromatin und Kinetochore beeinflussen mitotischen Spindelanordnung und Positionierung durch verschiedene Wege 3. Da diese Komponenten hier nicht Teil der Rekonstitution Assays beschrieben sind, werden sie nicht im Detail diskutiert werden. jove_content &quot;&gt; Verschiedene Theorien existieren, wie die verschiedenen molekularen Komponenten und Kräfte über kooperieren in Spindelanordnung und Positionierung beschrieben, aber wir sind noch weit von einem quantitativen Verständnis. Neben Experimente in lebenden Zellen, in vitro - Experimenten mit gereinigten Komponenten bieten eine leistungsfähige Route zu helfen , dieses Ziel zu erreichen. Hier haben wir eine visuelle Anleitung zu einer angepassten und erweiterten Version der kürzlich veröffentlichten Methoden (Roth et al. 31) präsentiert, in denen Grund Spindeln in Wasser-in-Öl - Emulsionströpfchen wiederhergestellt werden, beginnend mit einem minimale Anzahl von Komponenten. Verwendung von Mikrofluidik-Techniken werden kugelförmige Tröpfchen mit einer Größe erzeugt, die zu mitotischen Zellen vergleichbar sind. Innerhalb dieser Tröpfchen kann gereinigte Zentrosomen und Tubulin, um Wechselwirkungen zu studieren aster Dynamik der Mikrotubuli kombiniert werden, Krafterzeugung und aster-aster. Durch Einführung von kortikalen (wie dynein) und interpolaren (wie Kinesin-5 / ASE1) Kraft-Generatoren, wirrekonstituieren immer komplexer spindelartige Strukturen, die die in vivo Situation ähnlich starten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Preparation of microfluidic chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask (Photomask on film substrate)</td>
			<td>Selba S.A. Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &#60;1-0-0&#62; 10-20 &#937;-cm, 500-550&#956;m, SSP, w/2 flats)</td>
			<td>WRS Materials</td>
			<td>4P0SSP-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater&#160;</td>
			<td>Polos</td>
			<td>SPIN150I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td>
			<td>Lubribond</td>
			<td>9481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona treater</td>
			<td>Electro-technic products</td>
			<td>BD-20ACV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Microfluidic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant (Span80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>M2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>24x60mm, thickness 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>26x76mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>135840/135841/135843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>PMIRB&#160;</td>
			<td>Any inverted brightfield would suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controler</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-FLEX-4C-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubing</td>
			<td>Cluzeau Info. Labo, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td>
			<td>VWR, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Reconstituting spindle formation and positioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-dithioltheitol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (Guanosine-&#39;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#954;-casein (&#954;-casein from bovine serum milk)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>CLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Introducing spindle-assembly factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (Adenosine-&#39;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &#8805; 97% (enzymatic))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Die Verfahren, dargestellt in den vorhergehenden Abschnitten ermöglichen die Wiederherstellung der spindelartige Strukturen mit zunehmender Komplexität der geometrischen Einschluss von Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen verwendet wird. Dieser Abschnitt beschreibt repräsentative Ergebnisse, die qualitativ die Fähigkeit dieser Assays demonstrieren. Während der Mitose, wenn die bipolare Spindel montiert ist, Rundzellen up Kugeln zu bilden mit einem Durchmesser von etwa 15 um, wie für menschliche Zellen gemessen. Diese Eigenschaft mitotischen Zellform stellt eine geometrische Grenze , die beide einengt und Spindel Größe und Ausrichtung 35,36 lenkt. Mikrofluidik - Techniken bieten ein Maß an geometrische Begrenzung, die die Situation in lebenden Zellen beobachtet genau gleicht und daher erlaubt die Bottom-up - Rekonstruktion von Mitosespindeln in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Microtubule Astern sind für sich bereits in der Lage komplexe Verhalten, wenn Mikrotubuli Wachstum von geometrischen Grenzen eingeschränkt ist. Als Mikrotubuli wachsen, drängen durch den Einbau von neuen Tubulindimeren erzeugten Kräfte treiben die beiden Zentrosomen zu den Seiten der Emulsionströpfchen entgegenwirkt. Zunächst diffundieren Zentrosomen frei innerhalb des begrenzten Volumens (4a, linke Tafel). Nach ca. 20-30 Minuten werden die ersten Mikrotubuli sichtbar und Zentrosom Diffusion eingeschränkt wird als Mikrotubuli gegen die Rinde in alle Richtungen wachsen. Astern mit Mikrotubuli von mittlerer Länge (etwa 50% des Tropfendurchmesser) kann (sterisch) abstoßen anderen, mit Mikrotubuli gegeneinander schieben, die anderen Zentrosomen und die Rinde. Dies führt zu einem typischen &quot;bipolar&quot; spindelartige Anordnung mit den beiden Zentrosomen einander (4a, Mitte) entgegenwirkt . Wenn Mikrotubuli wachsen mehr als ~ 50% des tröpfchen diaMeter, erhalten die Zentrosomen geschoben weiter an gegenüberliegenden Grenzen des Tropfens, mit Mikrotubuli entlang der Tröpfchen Cortex (4a, rechts) wächst. Es ist wichtig, sowohl zu beachten, dass in diesen Tests Mikrotubuli Wachstumsraten sind sehr empfindlich auf Temperatur und Tubulin-Konzentrationen. Diese Parameter werden daher dringend die Zeit beeinflussen, wenn die Keimbildung wird zunächst beobachtet und wenn stationären Zustand aster Positionen erreicht werden. In Zellen, kortikalen Zugkräfte durch die Bildung von tragenden Befestigungen zwischen Mikrotubuli Plus-Enden und Cortex-assoziiertes dynein erzeugt. In tierischen Zellen, hängt diese Assoziation auf der Gai / LGN / NuMA - Komplex, der an die Plasmamembran über N-terminale Myristoylierung von G☐i - 1 ausgerichtet ist. In diesen Rekonstitution Assays wird die Anforderung des Gai / LGN / NuMA-Komplex durch direkte Kopplung Dynein an biotinylierte Lipide umgangen durch dieBildung von Biotin-Streptavidin-Biotin-Komplexe. Diese Anleihen sind relativ stabil (K D ~ 10 -14 M) 37 und bilden schnell ( in der Regel innerhalb von 10 Minuten nach der Emulsionstropfenbildung, vor Mikrotubuli Nukleation wird deutlich) (Abbildung 4b). In Gegenwart von kortikalen dynein behalten Zentrosomen typischerweise eine zentralere Position, wohingegen in der Abwesenheit von Dynein, Zentrosomen zu gegenüberliegenden Seiten des Tröpfchens cortex (Abbildung 4c) gedrückt werden. Wir folgern dies das Ergebnis von zwei Effekten ist, die verhindern und Mikrotubuli Schubkräfte entgegenzuwirken. (1) Dynein fördert direkt Mikrotubuli Katastrophen, wodurch Mikrotubuli Länge zu beschränken und übermäßige Mikrotubuli Knicken zu verhindern, und (2) kortikalen Zugkräfte führen zu Netto-Zentrieren Kräfte auf die einzelnen Astern 8, der die aster-aster Abstoßungskräfte entgegenzuwirken. Das diffusionsfähige Vernetzer ASE1 f induziertorces, die die überlappenden Bereich von anti-parallel Mikrotubuli 29 tendenziell zunehmen. In Übereinstimmung damit, in Gegenwart von ASE1 (und in Abwesenheit von Dynein) Zentrosomen nahe beieinander gefunden mit ASE1 lokalisierende interpolaren Mikrotubuli (4d) zu gebündelt. Die Mitglieder des Kinesin-5-Familie fahren Zentrosom Trennung durch Kräfte aus der Spindel (siehe Einleitung) Bereitstellung schieben. In Gegenwart von Cut7 (der S. pombe Kinesin-5 Ortholog), Zentrosomen sind an gegenüberliegenden Seiten der Emulsionströpfchen geschoben, auch in Gegenwart von ASE1 (Figur 4e). Durch die Kombination von kortikalen und interpolare Kraftgeneratoren kann der Grad der Komplexität weiter erhöht werden, in diesen Experimenten, was schließlich zu einem umfassenden Verständnis der bipolaren mitotischen Spindelanordnung führt. Eine detaillierte quantitative Beschreibung dieser Ergebnisse werden in der Zukunft (Roth et al., Manuskript in Vorbereitung) zur Verfügung stehen. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Neben der Position der Zentrosomen zu festen Zeitpunkten zu beobachten und ihr Verhalten in Bezug auf die beobachteten Längen der Mikrotubuli, wertvolle Informationen können im Anschluss an die Positionierung über erhalten werden Zeit. Durch die Reduzierung Belichtungszeiten und Laserintensitäten, ist es nun möglich aster Positionierung in 2 min Intervallen für mindestens 1 Stunde mit nur ~ 30% Bleichen folgen. Dies ermöglicht die Überwachung von aster Montage und Positionierung von frei diffundierenden Zentrosomen (0 min.) Über die zentrale (12 min.) Zu dezentralen Astern (36 min und weiter) (Abbildung 5c). Dies erleichtert die Studie sowohl stationäre Verhalten und Spindelanordnung Kinetik. Durch Tröpfchen mit verschiedenen Inhalten in der gleichen Probe kombiniert, ist es zum Beispiel möglich , Zentrosomen Positionierung und Spindelanordnung kinetics in Tröpfchen direkt mit und ohne kortikalen Krafterzeuger (Abbildung 5b) vergleichen. Abbildung 1: Kräfte , die auf die mitotische Spindel Mehrere krafterzeugenden Moleküle wirken auf die Mikrotubuli der mitotischen Spindel Spindelbildung und Positionierung zu fördern.. Mikrotubuli, die in die Zelle Rinde wachsen, um eine Schubkraft auf dem Zentrosom erzeugen. Cortical dynein (lila) fängt Mikrotubuli und erzeugt eine Zugkraft auf den Zentrosomen Depolymerisation. Innerhalb der Spindel, Kinesin-5 / Cut7 Motorproteine ​​liefern eine nach außen gerichtete Schiebekraft auf antiparallele Mikrotubuli, während Vernetzer der PRC1 / ASE1 Familie eine nach außen erzeugen entgegengesetzte Kraft schieben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Mikrofluidik - Chip - Design (A) Entwurf von 4 - Zoll - Fotomaske 4 Mikrofluidik - Chips enthält. (B) Detaillierte Darstellung eines einzelnen Chips. Chips enthalten einen Ausgangskanal und drei Einlass durch einen Staubfilter gefolgt Kanäle. Einlasskanal 1 enthält die Wasserphase, Kanal 2 der Lipid / Öl-Phase und Kanal 3 können die gebildeten Tröpfchen mit zusätzlichen Lipid / Öl-Phase zu verdünnen, verwendet werden. (C) Detaillierte Darstellung der Kreuzung , wo die Lipid / Öl-Phase (kommt von oben und unten) mit der Wasserphase trifft (von links kommend). An der Kreuzung wird Tröpfchen bilden und dem Austrittskanal auf der rechten Seite in Richtung fließen. (D) Detaillierte Darstellung eines Staubfilter mit 2 &amp; mgr; m - Kanälen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Methodik für Wasser-in-Öl - Emulsion Tröpfchenbildung (A) Mikrofluidik - Chip und der Mikrofluidik Schlauch auf einem Hellfeld - Mikroskop. Sowohl die Wasser- und Lipid / Öl-Phasen-Röhren sind mit den Chip Einlässe 1 bzw. 2. (B) Einschränkung auf Mikrofluidik - Chip , wo die Wasser- und Lipid / Öl-Phasen erfüllen. Durch Ändern der Drücke können Tröpfchen Größe gesteuert werden. (C) Entwurf von PDMS beschichteten Flusszellen. Nach dem Laden der Tröpfchen in der Strömungszelle werden die offenen Enden mit zusätzlichen Valap geschlossen. (D) Schematische Darstellung der Tröpfchenbildung. Tröpfchen werden verwendet Zentrosomen zu verkapseln, Tubulin und zusätzliche Komponenten für mitotischen Spindelbildung erforderlich. (E) Schematische Darstellung der kortikalen-dynein Targeting. Biotinylated (Bio) dynein wird an biotinylierte Lipide durch Streptavidin (Strp) ausgerichtet. <ahref = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Repräsentative Ergebnisse spindel Rekonstitutionen mit zunehmender Komplexität (A) Maximale Intensität Projektionen von Tröpfchen , die zwei Zentrosomen Beispiele von kurzen, mittleren und langen Mikrotubuli zeigt. Zentrosomen und Mikrotubuli werden durch die Zugabe von 10% HiLyte-488 markiertes Tubulin visualisiert. Maßstabsbalken = 10 um. (B) Lokalisierung von GFP-Biotin-Dynein-TMR in Abwesenheit (-, links) und Anwesenheit (+, rechts) von Streptavidin (Strp). (C) Microtubule aster Positionierung in Abwesenheit (-, links) oder Gegenwart (+, rechts) der kortikalen GFP-Biotin-Dynein-TMR. (D) Mikrotubulus aster (linkes Bild, green) Positionierung in Gegenwart von ASE1 (Mitteltafel, rot). (E) Mikrotubulus aster (links, grün) Positionierung in Gegenwart von ASE1 und Cut7 (Kinesin-5) (mittleres Feld, rot). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Abbildung 5: Imaging Aster Positionierdynamik in vitro (A) Entwurf eines PDMS Tasse , die bis zu mehreren Stunden Tröpfchen Bildgebung ermöglicht.. (B) Erzeugung, Speicherung und Darstellung von Tröpfchen (übertragen) mit unterschiedlichen Inhalten, veranschaulicht durch Abwesenheit (links) die Aufnahme (rechts) von fluoreszierendem Dextran (Alexa 647). (C) Einzelebene Bilder einer 60 min Zeitraffer (2 - Minuten - Intervallen) von einem z-Stapel entnommen (2 &amp; mgr; m Abstände) von adroplet eine einzige Zentrosom enthält. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Aufrufe.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Serie: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

Forschung

Biologie

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

Nichtinvasive In Vivo Small Animal MRI und MRS: Basic Experimentelle Verfahren

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Biochemische Rekonstitution der Steroid-Rezeptor • Hsp90-Protein-Komplexen und Reaktivierung der Ligandenbindung

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryonen

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.