המחברים מבקשים להודות לתמיכה מקרן ריוחה סאלוד (Fondos FEDER) ומהשר הספרדי דה סיאנסיה, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). כריסטינה רומרו ארנדה ממומנת על ידי מלגה מה-AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. לגדל C. elegans על צלחות פטרי
<ol><li>הכינו צלחות NGM וזרעו אותן עם E. coli OP50 כמקור המזון (איור 1). לגדל ולתחזק את C. elegans כמתואר17. אחסן צלחות נזרעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.</li>
	<li>התאימו את הצלחות לטמפרטורה הרצויה לפני הוספת התולעים.<ol>
<li>כדי להעביר את התולעים, מוציאים נתח אגר מצלחת ישנה ומניחים אותו על צלחת טרייה.</li>
		<li>לחלופין, תפסו בעלי חיים בודדים עם קוטף תולעים סטרילי (חתיכה בקוטר 1 אינץ' של חוט פלטינה בעל 32 מדים עם קצה שטוח, המותקנת על קצה פיפטה של פסטר) והניחו אותן על הצלחת החדשה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לגדל את התולעים בטמפרטורה הרצויה.<ol>
<li>לגדל תולעי C. elegans בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה הסטנדרטית. עם זאת, כדי לנתח את הפיתוח של מוטנטים רגישים לתרמו, לבצע דגירה לילה, בדרך כלל ב 25 מעלות צלזיוס. התאם את משך והטמפרטורה של דגירה זו לפי הצורך, בהתאם למוטנט הספציפי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכינו את הקלטת המיקרוסקופיה הארבע-ממדית לפני הרכבת העוברים (איור 2)
<ol><li>הגדר את המיקרוסקופ ואת בקרות הטמפרטורה לפני הכנת העובר. C. elegans העוברים מתחלקים מהר מאוד. היו מוכנים להתחיל להקליט מיד לאחר הרכבת העוברים.</li>
	<li>התאם את טמפרטורת ההקלטה ל- 15 ° C, 20 ° C או 25 ° C.<ol>
<li>תעדו באופן שגרתי את העוברים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. תעדו מוטנטים רגישים לתרמו בטמפרטורה המגבילה כדי להראות את הפנוטיפים שלהם. הקלט בקרת WT (אם נעשתה בהכנה אחרת) באותה טמפרטורה כמו המוטנטים. הערה: עוברי WT מתפתחים מהר יותר ב-25 מעלות צלזיוס ואיטיים יותר ב-15 מעלות צלזיוס ללא הבדלים נוספים בשושלת התאים. מקם את המיקרוסקופים בחדר מבוקר טמפרטורה. שליטה נוספת על ידי קירור או חימום המגלשה רצויה מאוד. ניתן להשיג זאת על ידי זרימת מים בטמפרטורה מסוימת באמצעות טבעת מתכת סביב מטרת המיקרוסקופ והעיבוי. המטרה וההכנה נמצאים במגע ישיר דרך שמן הטבילה והעברת הטמפרטורה יעילה. מערכת זו מאפשרת שליטה מדויקת על טמפרטורת הרישום ועל ביצוע שינויי טמפרטורה במהלך התפתחות העובר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את פרמטרי הרשומה בתוכנת המיקרוסקופיה.<ol>
<li>להקלטה סטנדרטית של C. elegans (ללא סריקות פלואורסצנטיות), בחר: z-ערימות של 30 מישורי מוקד, במרחק של 1 מיקרון כל אחת. מרווחים של 30 שניות בין תחילת כל z-stack. 1500 z-stacks (12.5 שעות שיא). הערה: ניתן להשתמש הן בתוכניות בקרה מסחריות והן בקוד פתוח של מיקרוסקופ כדי להגדיר זרימת עבודה זו ללכידת תמונות. עכשיו המיקרוסקופ מוכן להקליט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. להכין ולהרכיב את העוברים
<ol><li>הכינו כרית אגר דקה והומוגנית כצעד ראשון בהשגת תמונה יפה (איור 3).<ol>
<li>מכינים 50 מ"ל של תמיסת אגר של 4.5% במים שעברו דה-יוניזציה. מחממים לרתיחה במיקרוגל ויוצקים 0.5 – 1 מ"ל לתוך צינורות זכוכית 3 מ"ל.</li>
		<li>אטמו בזהירות את הצינורות עם סרט שעווה כדי למנוע ייבוש. צינורות אגר אטומים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד חודשיים.</li>
		<li>על ספסל המעבדה, יש בלוק חום ב 80 °C (80 °F) עם: מבחנה של ג'לי נפט טהור (מומס), עם מברשת צבע עדינה בפנים. מבחנה עם מים מזוקקים המכילים פיפטה של פסטר. הערה: זה מבטיח שכל החומרים הנדרשים יהיו חמים, והאגר לא יתמצק בתהליך הכנת הפד.</li>
		<li>הסירו את סרט השעווה מראש אחד מצינורות האגר, וחממו אותו בזהירות מעל מבער אלכוהול כדי להמיס את האגר. יש לנקוט משנה זהירות, שכן אגר חם שנפלט מצינור הזכוכית עלול לגרום לכוויות.</li>
		<li>לאחר שהאגר נמס, הניחו את הצינור בגוש החום כדי לשמור על האגר בצורה נוזלית.</li>
		<li>לחלופין, מניחים את צינורות האגר לתוך גוש החום 1 שעה לפני הניסוי כדי להמיס אותם מבלי להשתמש במבער. יש להשליך את האגר המומס לאחר יום אחד.</li>
		<li>הניחו שקופית מיקרוסקופ (שקופית A) בין שניים אחרים על פיסת פלסטיק.</li>
		<li>קח שקופית נוספת (שקופית B) והחזק אותה עם האצבעות ביד אחת.</li>
		<li>עם היד השנייה, מניחים טיפה קטנה של אגר מומס במרכז שקופית A באמצעות פיפטת הפסטר החמה.</li>
		<li>לחץ מיד על שקופית B על טיפת האגר כדי ליצור כרית דקה מאוד בין שקופיות A ו- B. שמור את השקופיות האלה דחוקות זו לזו עד שלב 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הר את העוברים.<ol>
<li>אספו 5-10 הרמפרודיטים גרבידיים עם הקוטף והניחו אותם בכוס שען מלאה במים.</li>
		<li>השתמשו באזמל כדי לפתוח את הנמטודות ההרמפרודיט ולחלץ ביצים מוקדמות (1-4 תאים) מהרחם, מתחת לסטריאומיקרוסקופ.</li>
		<li>קח את השקופית משלב 3.1.10 והחליק בעדינות את שקופית B כדי לחשוף את כרית האגר בשקופית A.</li>
		<li>מניחים ביצה מוקדמת במרכז כרית האגר על ידי צנרת עם צינור נימי.</li>
		<li>לחלופין, פיפטו טיפה המכילה סט של עוברים על כרית האגר ולאחר מכן חפשו עוברים בשלב מוקדם. בצע שלב זה תחת הסטריאומיקרוסקופ.</li>
		<li>במידת הצורך, הזיזו את הביצה על ידי הצמדתה עם ריס המודבק לקצה הקיסם.</li>
		<li>יש להסיר עודפי מים עם הפיפטה הנימית. הערה: ניתן להכין פיפטה נימית בקלות על ידי חימום פיפטה של פסטר מעל מבער אלכוהול ומשיכתו משני הקצוות.</li>
		<li>בזהירות לכסות את ההכנה עם כיסוי. כדי להימנע מבועות אוויר, הניחו קצה אחד של הכיסוי על המגלשה והחליקו בעדינות אזמל לאורך הקצה הסמוך כדי לעטוף באיטיות ובאופן אלכסוני את הכיסוי על ההכנה.</li>
		<li>השתמשו בפיפטה כדי למלא 3/4 מהחלל המקיף את כרית האגר במים. השאירו 1/4 מהחלל עם אוויר.</li>
		<li>אטמו את מכסה הכיסוי בג'לי נפט כדי למנוע ייבוש במהלך תקופות הקלטה ארוכות.</li>
		<li>השתמשו במברשת העדינה כדי להרחיב שכבה דקה של ג'לי נפט מומס סביב קצה הכיסוי. הערה: כעת ההכנה מוכנה להקלטה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. התאימו את ה-DIC והתחילו את הקלטת המיקרוסקופיה הארבע-ממדית
<ol><li>הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ. מקד את העובר באמצעות מטרת ההגדלה הנמוכה (פי 5 או 10x).</li>
	<li>שנה ליעד הטבילה פי 100.</li>
	<li>התאם את הרכיבים האופטיים של המיקרוסקופ כדי לקבל תמונת נומרסקי.<ol>
<li>מקד את המעבה.</li>
		<li>לפתוח לחלוטין את הצמצם של המעבה ולסגור את הסרעפת שדה (זה יספק צמצם מספרי גבוה יותר ולכן, רזולוציה גדולה יותר).</li>
		<li>בדקו ששני המקטבים במיקרוסקופ מכוונים לגרום להכחדת האור המרבית.</li>
		<li>סובבו את מנסרת וולאסטון כדי לקבל תמונה תלת-ממדית נחמדה של העובר, מוארת בצד אחד. סובבו את המנסרה לכיוון השני כדי לקבל את האפקט של הארת העובר בצד השני. הערה: ניתן לבצע שלבים אלה על דגימת בדיקה לפני ההקלטה, כך שנדרש רק כוונון עדין בדגימה המנותחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את לכידת התמונה במיקרוסקופ.</li>
</ol>5. נתחו את סרט ה-4D (איור 4).
הערה: לאחר השלמת ההקלטה, השתמש בתוכנת מעקב אחר שושלת תאים כדי לשחזר ולנתח שושלת תאים.
תוכנה למעקב אחר שושלת תאים היא כלי רב עוצמה לביצוע ניתוחים מפורטים של התפתחות עוברית או דינמיקה בתרביות תאים או שברי רקמות. התוכנית מחלצת ומכמתת מספר מערכי נתונים על הדינמיקה התאית של הדגימה הכוללים יצירת שושלת התאים השלמה של כל תא ותא מתועד, כולל חלוקות תאים, אורך מחזור התא, נדידה או אפופטוזיס וכן הקינטיקה שלו. בנוסף, התמיינות תאים יכולה להיות ניקוד על ידי שינויים מורפולוגיים של התא או על ידי ביטוי של סמנים ספציפיים. בעיקרון, מסך התוכנה מציג שני חלונות: בחלון השמאלי, ניתן להפעיל את הסרט הארבע-ממדי קדימה ואחורה או למעלה ולמטה לרמות העליונות או התחתונות, כך שניתן יהיה לעקוב אחר כל תא בזמן ובמרחב לאורך ההקלטה. על האלמנה הימנית נוצרת שושלת התאים. לחיצה על גרעין התא בסרט הארבע-ממדי יוצרת נקודה בחלון השושלת המאחסנת את המידע של שם התא, גורלו וקואורדינטות מרחביות. שושלת התאים של תא מסוים נוצרת על ידי השמעת הסרט הארבע-ממדי קדימה ולחיצה מעת לעת על הגרעין כדי לסמן את המיטוזה של אותו תא ספציפי לאורך זמן. חזרה על תהליך זה עבור כל אחד מהתאים המתועדים יוצרת את שושלת התאים השלמה של העובר או הדגימה. המידע המאוחסן עבור קואורדינטות מרחביות של כל תא משמש מאוחר יותר לשחזור מודלים תלת-ממדיים של עוברים ונתיבי נדידת תאים.
<ol><li>פתח את תוכנת איתור השושלת וצור פרויקט חדש על ידי מעבר לתפריט הסרגל העליון ובחירה: | קבצים פרויקט חדש.</li>
	<li>בחר את תבנית שושלת התאים בהתאם לטמפרטורת ההקלטה: DB08 להקלטה ב- 25 °C, DB10 להקלטה ב- 20 °C ו- DB12 להקלטה ב- 15 °C.</li>
	<li>הגדר את פרמטרי ההקלטה בחלון המתהווה: ספירת סריקות (בדרך כלל 1500), זמן בין סריקות (30 שניות), ספירת רמות (30) ומרחק בין רמות (1 מיקרון).</li>
	<li>בחר את קובץ התמונה ואת העיצוב.<ol>
<li>בחר את ספריית התמונות שבה נשמרו התמונות.</li>
		<li>בחר אם יש לשמור תמונות כתמונות בודדות (תמונה אחת לכל רמה וזמן) או כערימות z מרובות תמונות.</li>
		<li>קבע את שמות הקבצים ואת תבנית התמונה. באופן שגרתי, תמונות בודדות נשמרות תחת השמות הבאים: X0000L00C1 (לסריקה 0, רמה 0, ערוץ 1) X0000L01C1 (לסריקה 0, רמה 1, ערוץ 1) X0000L02C1 (לסריקה 0, רמה 2, ערוץ 1) ... X0001L00C1 (לסריקה 1, רמה 0, ערוץ 1) X0001L01C1 (לסריקה 1, רמה 1, ערוץ 1) ... X0300L04C1 (לסריקה 300, רמה 4, ערוץ 1) ... הערה: שמירת התמונות בתבנית דחוסה חוסכת מקום בדיסק הקשיח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את ערוצי האור: 1 עבור אופטיקת DIC, 2 עבור GFP, 3 עבור RFP וכו '. הוסף את אלה ששימשו בהקלטת 4D. לחץ על "עיבוד ערוצים מופעל" כדי לזהות אותם.</li>
	<li>התחילו להתחקות אחר שושלת התאים של העובר. המסך מכיל כעת שני חלונות עיקריים: חלון הווידאו וחלון שושלת התאים.<ol>
<li>בחלון השושלת, בחר ענף שושלת והשתמש בעכבר כדי ללחוץ על גרעין התא המתאים לתא זה בחלון הווידאו.</li>
		<li>עקוב אחר התא באופן מרחבי ולאורך זמן על-ידי הפעלת סרט 4D קדימה, אחורה או למעלה או למטה ברמה, באמצעות מקשי הסמן.</li>
		<li>לחץ מעת לעת על גרעין התא. זה יוצר נקודה בענף השושלת ורושם את הקואורדינטות המרחביות של התא בשלב זה. כתוצאה מכך, שושלת התאים מתקדמת, ושחזורים תלת-ממדיים של העובר אפשריים.</li>
		<li>סמן מיטוזה על ידי לחיצה על מקש ההחזרה. לאחר מכן בחר אחד מתאי הבת ועקוב אחריו כמו קודם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על התהליך (שלבים 5.6.1 עד 5.6.4) כדי לעקוב אחר שאר התאים העובריים כדי להתחקות אחר שושלת התאים השלמה, או כדי לעקוב אחר תאים ספציפיים בעלי עניין כגון אלה העוברים אפופטוזיס.</li>
	<li>השווה את השושלת המוטנטית עם שושלת התאים הסטריאוטיפית WT C. elegans .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אחד האתגרים הגדולים בביולוגיה המודרנית הוא הבנת ההתפתחות של אורגניזמים רב-תאיים. C. elegans התגלה כאחד המודלים המתאימים ביותר לחקר התיאום העדין בין התפשטות תאים לבין התמיינות תאים בעובר המתפתח. מנקודת מבט אופטית, גופו השקוף וגודלו הקטן הופכים את הנמטודה הזו לדגימה אידיאלית למיקרוסקופ DIC. אורגניזמים אחרים בעלי מאפיינים דומים עברו גם הם ניתוח מיקרוסקופיה 4D 11,12,13,14,15,16.
עבור אותם מחקרים התפתחותיים, השבתת גנים על ידי גנטיקה קדימה או לאחור מספקת רמז למעורבותה באמבריוגנזה. לאחר שהוכח כי גן ממלא תפקיד בהתפתחות, השלב הבא הוא להגדיר את תפקידו המדויק בביסוס תוכנית הגוף הנכונה. חיסון היא הגישה שנבחרה עבור רוב הדגמים. טכניקה זו מבהירה בעיות בהתמיינות תאים או בביטוי של סמנים ספציפיים. עם זאת, מגבלה מרכזית של גישה זו היא שהיא מספקת רק מבט סטטי על הביטוי של סמנים בודדים או יותר בנקודה קבועה בהתפתחות. תצוגה דינמית של סמנים אלה לאורך ההתפתחות יכולה להתקבל רק על ידי צביעת עוברים שונים בנקודות זמן שונות. בנוסף, שחזור שושלת תאים אינו אפשרי בדגימות קבועות כאלה.
מיקרוסקופיה 4D היא גישה משלימה לחקר ההתפתחות העוברית. טכניקה זו חושפת דינמיקת התפתחות ברזולוציה ברמת התא. כל פגם בעובר כגון בעיות בכיוון הציר, נדידת תאים, אפופטוזיס, מפרט גורל התא וכו' יופיע בסרט 4D שניתן לדמיין קדימה ואחורה, לכמת אותו ולהבקיע אותו על ידי החוקר. באמצעות טכניקה זו, כמעט כל תא ותא בעובר ניתן לעקוב עד לרגע שבו העובר מתחיל לנוע. עוברים שעברו מיקרוסקופיה 4D עם אור נראה בלבד ואופטיקה של נומרסקי אינם עוברים פוטו-דמה. סריקות פלואורסצנטיות יכולות גם להיות משולבות בתוך ההקלטה כדי לזהות מתי והיכן מתבטא גן. עוברים הסובלים מפוטודמאמג' משמעותי מזוהים על ידי הארכת מחזור התא שגורמת להקרנת UV חזקה בהשוואה לעובר שושלת WT סטנדרטי. במקרה כזה, ניתן להפחית את הפוטודמאג' על ידי הפחתת עוצמת מנורת ה-UV והגדלת הרגישות למצלמה או זמן החשיפה. מאפיינים מורפולוגיים וסמנים מולקולריים יכולים לעזור להבהיר את ההתפתחות העוברית של כל מוטציה.
הגדרת מערכת מיקרוסקופיה 4D קלה ליישום במעבדה, ולאחר תרגול מסוים, מאפשרת ניתוח ללא תחרות של דינמיקת תאים ומעקב אחר שושלות של תרביות תאים ודגימות שקופות חיות ברמת רזולוציה של כל תא ותא בשדה המיקרוסקופ. מעקב אחר שושלת תאים בתמונות DIC עדיין מעובד ביד. זה גוזל זמן, ולמרות שהתוכנה מזהה שגיאות שושלת כגון ענפי שושלת שונים המסמנים את אותו תא, טעויות אפשריות. בעוד שזיהוי אוטומטי של תאים המסומנים ב-GFP מפותח היטב2, תוכנת מעקב שושלת משלימה המבוססת על תאים לא מסומנים ותמונות של אור נראה עדיין נמצאת בשלב מוקדם ולא ממש שימושית לניתוח עוברים מלא. ללא כל ספק, יישום של מערכות זיהוי תמונה בתחום המיקרוסקופיה של האור הנראה יביא להתקדמות רבה בתחום זה.

מיקרוסקופיה 4D היא מערכת הקלטה רב-פוקלית של קיטועי זמן המאפשרת לחוקרים לרשום ולכמת את הדינמיקה של התאים של דגימה ביולוגית הן מבחינה מרחבית והן לאורך זמן. תרביות תאים, שמרים או רקמות חיות יכולות להיות נתונות לניתוח 4D אך טכניקה זו מתאימה במיוחד לניתוח התפתחות העוברים החיים. הרזולוציה של ניתוח זה מגיעה לרמה של כל תא בודד של העובר. ניתן לזהות כל חלוקת תאים, ולעקוב אחר תנועות התאים לאורך זמן. גורלות התאים נבחנים על פי המיקום והצורה שהתאים רוכשים. השימוש באופטיקה של נומרסקי מגביר את הניגודיות של דגימות שקופות לא מוכתמות באמצעות אלומות אור מקוטבות אורתוגונליות המפריעות למישור המוקד. התמונות המתקבלות נראות תלת מימדיות, מוארות בצד אחד.
שיטות אחרות המבוססות על שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ובבעלי חיים מהונדסים של GFP לזיהוי אוטומטי של גרעינים ויצירת שושלות תאים פותחו 1,2. היתרון של מערכות אלה ברור: התוכנה גוברת במידה רבה על הצורך בסימון ידני של כל גרעין לאורך פרק זמן (אם כי נדרש פיקוח ידני מסוים בשלבים המאוחרים). עם זאת, תהליכים תאיים הכוללים שינויים בצורת התא או בדינמיקה של הממברנה, כגון אלה המתרחשים במהלך התמיינות תאים, נדידה, אפופטוזיס או בליעת גופות, נשארים מוסתרים כרקע שחור בתמונות הגרעינים המסומנים בפלואורסצנט.
לעומת זאת, מיקרוסקופיית נומרסקי 4D (הנקראת גם מיקרוסקופיית DIC, מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית) מראה הן גרעינים והן שינויים בצורת התא המתרחשים במהלך התפתחותם של בעלי חיים מסוג בר או מוטציה. זה מאפשר מעקב אחר שושלות תאים באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים, תוך שימוש רק באור המועבר. אין צורך כללי להשתמש בבעלי חיים מהונדסים אלא כדי להראות דפוסי ביטוי ספציפיים, ובמקרה זה סריקות פלורסנטיות יכולות להיות משולבות. לכן, זו יכולה להיות הגישה האופטימלית עבור מעבדות רבות העובדות על תהליכים תאיים דינמיים כגון embryogenesis או אפופטוזיס שניתן להדגיש תחת מיקרוסקופיית DIC 3,4,5,6,7.
מספר תוכניות גמישות וידידותיות למשתמש זמינות ללכידת תמונות מיקרוסקופיות ולשחזור שושלות תאים, מודלים תלת-ממדיים, נתיבי נדידת תאים וכו 'במדגם המוקלט. בניסוי סטנדרטי, התמונות נרכשות בסדרה של מישורי מוקד, במרחק קבוע, שמספרם תלוי בעובי הדגימה. ניתן לייעל את הרזולוציה הטמפורלית של הניתוח על ידי הגדלת תדירות הסריקה. אין כמעט הגבלה על משך ההקלטה מלבד קיבולת האחסון של המחשב. לדוגמה, עבור ניתוח התפתחות עוברי C. elegans , אנו רוכשים באופן שגרתי תמונות על 30 מישורי מוקד (צעד של מיקרון אחד כל אחד), כל 30 שניות במשך 12 שעות.
מערכות אלה יושמו בניתוח של מספר עוברים של בעלי חיים כגון Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, עוברי נמטודה אחרים12,13, tardigrades14,15 ואפילו עוברי עכברים מוקדמים16. הדרישה היחידה היא שיהיה עובר שקוף המסוגל להתפתח על הכנת המגלשה מתחת למיקרוסקופ.
לסיכום, מיקרוסקופיה 4D מבוססת DIC שימושית במיוחד עבור 1) ניתוח התפתחות עוברית של בעלי חיים קטנים ושקופים: מעקב אחר שושלת תאים, נתיבי נדידת תאים, יצירת מודלים תלת-ממדיים וכו '; 2) הגדרת דפוסי ביטוי גנים; 3) חקר הדינמיקה של תרביות תאים, משמרים ועד תאים אנושיים; 4) ניתוח דינמיקה של רקמות או שברי עוברים; 5) כימות קינטיקה של מוות תאי ובליעת גופות; ו-6) ביצוע ניתוח פילוגנזה השוואתי המבוסס על מאפיינים התפתחותיים עובריים. אם יש עניין באחד מהנושאים הללו (או דומים להם), ניתן להשתמש במיקרוסקופיה 4D.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (N2)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>N2</td>
			<td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>VZ454</td>
			<td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lineage Tracing software</td>
			<td>SIMI</td>
			<td>Simi BioCell</td>
			<td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-R2</td>
			<td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Caenotec</td>
			<td>Time to Live</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel 
			Kleine Dorfstr. 9 38312 B&#246;r&#223;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica DM6000</td>
			<td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

מיקרוסקופיה 4D היא כלי רב ערך לחשיפת תהליך ההתפתחות העוברי בבעלי חיים שונים. במהלך העשורים האחרונים, Caenorhabditis elegans התגלה כאחד המודלים הטובים ביותר לחקר הפיתוח. מנקודת מבט אופטית, גודלו וגופו השקוף הופכים את הנמטודה הזו לדגימה אידיאלית למיקרוסקופיית DIC (ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית או נומרסקי). מאמר זה ממחיש פרוטוקול לגידול נמטודות C. elegans , הכנה והרכבה של העוברים שלהם, ביצוע מיקרוסקופיה 4D ומעקב אחר שושלות תאים. השיטה מבוססת על רישומי קיטועי זמן מולטיפוקליים של תמונות נומרסקי וניתוח עם תוכנה ספציפית. טכניקה זו חושפת דינמיקה התפתחותית עוברית ברמה התאית. כל פגם עוברי במוטנטים, כגון בעיות בכיוון הציר, נדידת תאים, אפופטוזיס או אפיון גורל התא, ניתן לזיהוי ולניקוד יעילים. כמעט כל תא של העובר יכול להיות במעקב עד לרגע שבו העובר מתחיל לנוע. התחקות אחר שושלת התאים השלמה של עובר C. elegans על ידי מיקרוסקופיית DIC 4D היא מייגעת, אך השימוש בתוכנה ספציפית מקל מאוד על משימה זו. בנוסף, טכניקה זו קלה ליישום במעבדה. מיקרוסקופיה 4D היא כלי רב תכליתי ופותחת את האפשרות לבצע ניתוח חסר תקדים של התפתחות עוברית.

כדי לאפיין התפתחות עוברית של מוטציה C. elegans עבור הגן gsr-1, המקודדת את האנזים גלוטתיון רדוקטאז, הנדרש לחידוש גלוטתיון מופחת (GSH) ומעורב בשמירה על הומאוסטזיס של חמצון-חיזור בנמטודה, ביצענו מיקרוסקופיה 4D של מוטציה למחיקה gsr-1 (tm3574) שהיא אובדן של אלל תפקודי הגורמת לפנוטיפ מעצר עוברי מוקדם18. גם נמטודות ה-WT וגם המוטציות המאוזנות של Gsr-1 (tm3574) C. elegans גדלו על צלחות NGM שנזרעו עם E. coli OP50 כמקור המזון17. תולעי gsr-1 (tm3574) גודלו כהטרוזיגוס בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך שני דורות ולאחר מכן תולעים הומוזיגוטיות מופרדות (המסוגלות לגדול עד לבגרות הודות לעומס האימהי) הועברו ל -25 מעלות צלזיוס לדגירה של לילה לפני ניתוח העוברים. לוחות תולעים הודגמו בתוך קופסאות קרטון כדי למנוע עיבוי (איור 1). נמטודות גרבידיות נחתכו כדי לחלץ עוברים צעירים.
כדי להשוות את ההתפתחות העוברית של המוטאנט לעומת ה-WT הסטריאוטיפי בתנאים זהים, הוכנסו עובר WT (כבקרה) ועובר gsr-1 (tm3574) לאותה הכנה זה ליד זה. זרימת עבודה של מיקרוסקופיה 4D הופעלה על מיקרוסקופ זקוף ממונע סטנדרטי המצויד באופטיקה DIC. פרמטרי ההקלטה שנבחרו בתוכנית הבקרה של המיקרוסקופ היו: z-stacks של 30 מישורי מוקד במרחק של מיקרון אחד כל אחד, מרווחים של 30 שניות בין תחילת כל z-stack ו-1500 z-stacks (12.5 שעות של הקלטה). טמפרטורת ההקלטה הותאמה ל-25 מעלות צלזיוס (הן בחדר והן על במת המיקרוסקופ) (איור 2).
לאחר השלמת ההקלטה, קובץ התמונות נפתח, ושושלת התאים שוחזרה באמצעות תוכנת מעקב אחר שושלת על ידי לחיצה על גרעיני תאים המוצגים בחלון הווידאו (איור 4). שושלת התאים העובריים המוטנטית gsr-1 (tm3574) הושוותה לשושלת C. elegans WT המתוארת ברקע. תוצאה מרכזית הייתה זיהוי של עיכוב הדרגתי במחזור התא במהלך ההתפתחות העוברית. כתוצאה מכך, עוברים מוטנטיים נעצרו בשלבי ביניים ואילו עוברי WT התקדמו ולבסוף בקעו כזחלים.
הכנה ותצפית ישירה על עוברים תחת המיקרוסקופ או תצפית חיסונית עם נוגדנים נגד סמנים עובריים מאוחרים יכולה לחשוף את נוכחותם של אחוז גבוה של עוברים צעירים במוטציה בהשוואה ל- WT. ניתן להסיק את מעצר העובר כהסבר הסביר ביותר. עם זאת, הוכחה ישירה וכימות מדויק של עיכוב מחזור התא ניתנים להצגה ולכימות באלגנטיות ובקלות רק באמצעות ניסוי מיקרוסקופיה 4D. ניתן גם לדמיין מאפיינים חשובים אחרים של התפתחות עוברית כגון התמיינות תאים או אפופטוזיס (איור 5) באופן דינמי באמצעות מיקרוסקופיה 4D המציעה ניתוח מפורט של היבטים מרובים של התפתחות בניסוי יחיד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> איור 1: נמטודות C. elegans גדלות בתנאי מעבדה. נמטודות גדלות על צלחות NGM עם זרעי E. coli, מאוחסנות בקופסאות קרטון ומדגרות בטמפרטורה <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">של</a> 15 מעלות צלזיוס, 20 מעלות צלזיוס או 25 מעלות צלזיוס.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> איור 2: צילום מסך של תוכנת הקלטה למיקרוסקופיה 4D. דוגמה לשתי תוכנות שונות לבקרת מיקרוסקופים (A ו-B). תוכניות אלה יוצרות זרימות עבודה כדי לשלוט במיקרוסקופ ובלכידת התמונה במהלך הקלטת מיקרוסקופיה 4D. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> איור 3: תצלומים סדרתיים של הכנת כרית אגר והרכבה של עובר C. elegans . א. צינורות אגר מוכנים. בי-סי. הכנת כרית האגר. ד. החלקה מלאה חלקית במים. ה. איטום המגלשה בג'לי נפט. ו. הכנה סופית. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> איור 4: צילומי מסך טוריים של תוכנת מעקב אחר שושלת תאים. התוכנית מאפשרת שחזור של שושלת התאים העובריים של מוטציה לעיכוב מחזור התא (משמאל) ועובר WT (מימין) C. elegans . A. שלב מוקדם של ההתפתחות. בי-סי. התפתחות שני העוברים מתקדמת עם הזמן. ד. עובר WT מתפתח כראוי ומתחיל התארכות ואילו המוטאנטים נעצרים. בכל המקרים התוכנית מציגה את חלון הווידאו ואת חלון השושלת. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> איור 5: צורת שבירה של עדשים של תאים אפופטוטיים בעובר C. elegans WT. ניתן להעריך את גורל התא, המוגדר על ידי מאפיינים מורפולוגיים, על ידי מיקרוסקופיה 4D. התמונה מראה עובר C. elegans בשלב השעועית. תאים חיים מראים גרעינים בעלי צורה חלקה המוקפים בציטופלסמה גרגירית. לעומת זאת, תאים אפופטוטיים (חצים צהובים) מתעבים ומאמצים צורה דמוית עדשים, מתפרקת. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

4d-microscopy-unraveling-caenorhabditis-elegans-embryonic-development

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.5K Views.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

Video: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...