המחברים מבקשים להודות גידו ורהובן ולודו Deboel, לובן, שהיו מאוד מועילים בהקמת הבידוד של תאי Sertoli העיקרי במעבדת מיינהרדט בגיסן. מוניקה Fijak, גיסן, הוא הודה על עזרתה עם דמות 1A וייעוץ. מחקרים נתמכו דויטשה Forschungsgemeinschaft דרך מענק BH 93 / 1-1 (SB) ומימון של גיסן JLU מכללת בוגר המחקר הבינלאומי (גרמניה) / אוניברסיטת מונש (מלבורן, אוסטרליה) GRK 1871 (SB). תמיכה הושג גם ממענק של מדינת הסן בתוכנית &quot;לנדס-התקפי zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) בשם &quot;Männliche Infertilität bei Infektion &amp; Entzündung&quot; (MIBIE).

<ol>
	<li>Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. , (2010).</li><li>Esaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+Kulturen+des+Hodengewebes+der+S&#228;ugetiere+und+&#252;ber+die+Natur+des+interstitiellen+Hodengewebes+und+der+Zwischenzellen.">&#220;ber Kulturen des Hodengewebes der S&#228;ugetiere und &#252;ber die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen.</a> Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).</li><li>Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+cholesterol+to+androgens+by+rat+testes:+comparison+of+interstitial+cells+and+seminiferous+tubules.">Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules.</a> Endocrinology. 84, 488-496 (1969).</li><li>Welsh, M. J., Wiebe, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+sertoli+cells:+a+rapid+method+for+obtaining+viable+cells.">Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells.</a> Endocrinology. 96, 618-624 (1975).</li><li>Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+development+of+the+blood-testis+barrier+and+the+effects+of+clomiphene+and+estrogen+treatment.">The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment.</a> Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).</li><li>Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+follicle-stimulating+hormone+on+cultures+of+Sertoli+cell+preparations.">Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).</li><li>Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+synthesis+is+a+marker+for+peritubular+cell+contaminants+in+Sertoli+cell-enriched+cultures.">Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures.</a> Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).</li><li>Verhoeven, G., Cailleau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+peritubular+cells+secrete+a+protein+under+androgen+control+that+inhibits+induction+of+aromatase+activity+in+Sertoli+cells.">Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells.</a> Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).</li><li>Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+induced+by+follicle-stimulating+hormone+or+dibutyryl+cyclic+AMP+on+presumptive+Sertoli+cells+in+culture.">Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+Sertoli+cells+and+their+effects+on+the+function+of+co-cultured+allogeneic+islets+in+vitro.">Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro.</a> Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).</li><li>Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Sertoli+cells:+major+histocompatibility+antigens+and+glycoconjugates.">Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates.</a> J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).</li><li>Dufour, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+line+lacks+the+immunoprotective+properties+associated+with+primary+Sertoli+cells.">Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells.</a> Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).</li><li>Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+Sertoli+cells+from+the+testes+of+adult+Siberian+hamsters:+analysis+of+proteins+synthesized+and+secreted+by+Sertoli+cells+cultured+from+hamsters+raised+in+a+long+or+a+short+photoperiod.">Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod.</a> Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).</li><li>Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+cultures+and+characterization+of+yak+Sertoli+cells.">Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells.</a> Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).</li><li>Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+interaction+in+vitro+between+Sertoli+cells+and+germ+cells+at+different+stages+of+spermatogenesis.">Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis.</a> Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).</li><li>Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Sertoli+cells+from+adult+rat+testes:+an+approach+to+ex+vivo+studies+of+Sertoli+cell+function.">Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function.</a> Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).</li><li>Scarpino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+Sertoli+cell+isolation+by+DSA+lectin,+allowing+mitotic+analyses.">A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).</li><li>Mather, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+two+distinct+mouse+testicular+epithelial+cell+lines.">Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines.</a> Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).</li><li>Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotransplantation+of+allogeneic+islets+with+allogeneic+testicular+cell+aggregates+allows+long-term+graft+survival+without+systemic+immunosuppression.">Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression.</a> Diabetes. 46, 317-322 (1997).</li><li>Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell-germ+cell+relationships+in+mammalian+testes+during+development+and+spermatogenesis.">Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis.</a> Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).</li><li>Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+response+elements+of+the+c-fos+promoter+and+involvement+of+intermediate+transcription+factor(s)+in+the+induction+of+Sertoli+cell+differentiation+(transferrin+promoter+activation)+by+the+testicular+paracrine+factor+PModS.">Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS.</a> Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).</li><li>Bhushan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uropathogenic+Escherichia+coli+block+MyD88-dependent+and+activate+MyD88-independent+signaling+pathways+in+rat+testicular+cells.">Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells.</a> J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).</li><li>Meinhardt, A., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+paracrine+and+endocrine+aspects+of+testicular+immune+privilege.">Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).</li><li>Fijak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Testosterone+on+Inflammatory+Response+in+Testicular+Cells+and+Expression+of+Transcription+Factor+Foxp3+in+T+Cells.">Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells.</a> Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).</li><li>Mamidi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+passing+mesenchymal+stem+cells+through+smaller+bore+size+needles+for+subsequent+use+in+patients+for+clinical+or+cosmetic+indications.">Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications.</a> J. Transl. Med. 10, 229 (2012).</li><li>Ito, S., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-glutaraldehyde+fixatives+containing+trinitro+compounds.">Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds.</a> J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).</li><li>Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+Sertoli+cell+cultures:+a+new+model+for+the+study+of+somatic-germ+cell+interactions.">Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions.</a> J. Androl. 5, 249-254 (1981).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).</li><li>Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sertoli+cell+in+vivo+and+in+vitro.">The Sertoli cell in vivo and in vitro.</a> Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).</li><li>Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+in+vitro+the+phagocytic+function+of+Sertoli+cells+in+the+rat.">Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat.</a> Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).</li><li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+the+importance+of+being+eaten.">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).</li><li>Ducray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+mouse+Sertoli+cell+line+producing+rat+androgen-binding+protein+(ABP).">Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP).</a> Steroids. 63, 285-287 (1998).</li><li>Konrad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Sertoli+cells+express+epithelial+but+also+mesenchymal+genes+after+immortalization+with+SV40.">Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, when Sertoli cells are isolated using the procedure described here they get deprived of their intimate contacts to neighboring PTCs and spermatogenic cells. Nevertheless they appear to retain many properties that are characteristic for them in vivo like hormone responsiveness and expression of marker genes although in a time-dependent manner and on a lower level. 
Primary Sertoli cells develop large neutral lipid droplets after six days of culture. One of the vital functions of Sertoli cells is phagocytosis of degenerating and apoptotic germ cells and of germ cell material like the so called residual bodies29. It is known that residual bodies and cytoplasts from elongated spermatids adhere to isolated Sertoli cells and get phagocytosed30. As it is impossible to remove all germ cells during the isolation procedure we therefore hypothesize that contaminating germ cells can also adhere to Sertoli cells after plating and get phagocytosed. Since residual bodies contain small lipid droplets it is easily conceivable that Sertoli cells acquire large lipid droplets after extensive phagocytosis of adhering and damaged germ cells. There is also evidence that phagocytotic clearance of apoptic cells actively downregulates inflammatory and immune responses31 which could be important for establishing and maintaining the testis as an immune priviliged organ.
When isolated Sertoli cells are plated on top of a layer of primary peritubular cells both cell types survive longer and do form a basal lamina between them. Morphologically they are able to form structures reminiscent of seminiferous tubules indicating that both cell types have retained their capacity to properly interact7. Like freshly isolated primary Sertoli cells the frequently used mouse Sertoli cell line TM4 does respond to FSH with increased production of cAMP18, but contrary to primary cells it is not able to produce androgen binding protein32. Moreover it has been shown that the mouse Sertoli cell line 1 lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells12. 
Similarly the rat Sertoli cell line SCIT-C8 expresses the epithelial markers transferrin, clusterin and stem cell factor but has lost androgen receptor expression and androgen responsiveness whereas it has aquired expression of some mesenchymal markers like fibronectin and entactin-133. Therefore, primary Sertoli cells, although expensive and tedious to isolate, appear to retain significantly more qualitative in vivo properties during cell culture than cell lines do. 
Future applications of primary Sertoli cells will focus on immuno-protection of co-cultured or co-transplanted cells, on experiments studying cell-cell interactions, and on investigating the immune privilege of testis.

האשכים לייצר גמטות הורמונים זכריים מינית, כלומר, אנדרוגנים. האורגן מורכב משני תאים. בתא ביניים, המייצג כ 10-12% של נפח האשכים הכולל 1, steroidogenesis מתרחש בתוך התאים ליידיג. תא צינורי מייצג כ 60-80% מנפח האשכים 1 ומכיל בתאי הנבט שני סוגים של תאים סומטיים - תאים פריטובולרית והפרשה תאי Sertoli. לאשכים מחולקים septa רקמת חיבור לתוך 250-300 אוניות, שכל אחת מהן מכיל 1-3 מאוד ראשוני באבוביות מפותל. Tubules אלה מוקפים על ידי קרום בסיס, גיליון קולגן, ושכבה היקפי של תאי peritubular (איור 1 א). אפיתל הנבטי ממוקם בצד luminal של קרום הבסיס. תאי Sertoli הם תאים מאורכים גדולים כי ההיקף האפיתל נבטי כולו מן הקרום הבסיסי אל לומן. הם מאוד attכאב קרום הבסיס ויוצר גיליון הסלולר מתמשך דרך צומת הדוקים basolateral מאורגנות חוסם האפיתל הנבטי מן interstitium ומייצג את מחסום הדם-האשך. יש תאים Sertoli תחזיות ציטופלסמית בולטות והשלכות המאפשרות להם להגיע במגע מורפולוגית ופונקציונלי הדוקים עם מספר מינים ספציפיים אך קבוע של תאים ניבטו. תאי גזע נבטי דיפלואידי להתרבות להתמיין spermatogonia. במהלך המיוזה שאני קצר מועד spermatocytes tetraploid נוצרות המתפתחים נוספים לארבעה spermatids הפלואידים במהלך המיוזה השנייה. כל תאי נבט הם מחוברים על ידי גשרים ציטופלסמית כך שהם יוצרים רשת הסלולר. האירוע העיקרי בתקופת הבשלה של spermatids הוא שהחול של חלקים גדולים של הציטופלסמה, ויצר גופים שיורית, בתהליך הנקרא spermiogenesis. גופי שייר נבחנים phagocytosed ידי תאי Sertoli. spermatids מאוחר ואז משתחררת לתוךלומן הצינור והובל אל יותרת האשך עבור התבגרות נוספת. תאי Sertoli ו בתאי הנבט להופיע לתאם spermatogenesis הדדית טופוגרפית והן מבחינה תפקודית. הכנת סוגי תאי אשכים בודדים נכתבה לפני כמעט מאה שנה כאשר חתיכות אשכים קטנות עובדו סוגי תאים המזוהים על ידי מיקרוסקופ 2. על ידי דיסקציה זהירה של tubules לאחר פתיחת Tunica albuginea באמצעות מלקחיים קנס שקצהו אפשר היה מאוחר להפריד צינורי ותאים ביניים 3. בשנת 1975 וולשית ו וויב הציגה טיפול collagenase כדי לשחרר את tubules מ דבקות רקמת ביניים טיפול pancreatin להסרת שכבת התאים peritubular החיצוני 4. משחר נעוריה חולדות צעירים לא מפותחות (סביב 20 ימים) נוצלו שבה תא Sertoli מהווה חלק הגדול של אוכלוסיית צינורי התא כי spermatogenesis טרם החל. בשעה זו Sert עכברוש גילoli התאים מפסיקים להתחלק, צמתים הדוקים בין תאים שכנים ליצור כך את מחסום הדם-testis מוקמת 5. המבקר של וולשית ו וויב Dorrington et al. הציג שילוב של טריפסין deoxyribonuclease ואחריו מעכב soybeen טריפסין וטיפול collagenase שפורסם באותה שנה 6. שתי הקבוצות גם השתמשו בכוח מכני (ציור שברי צינורי מתעכל שוב ושוב באמצעות מחט מזרק או פיפטה פסטר בהתאמה) כדי לייצר ההשעיה תא הומוגנית ציפוי המכיל כ 70% תאים Sertoli. לאחר 3 ימים בתרבות, באמצעות מדיום זה סרום ללא, באחוז התאים Sertoli מגדילה בכ -90%. זה יכול להיות מיוחס בעיקר מותו של זיהום בתאי הנבט. תאי peritubular שיורים (PTCs), לעומת זאת, להישאר מחוברים היטב באמצעות תאי מטריקס שלהם. PTCs, אבל לא התאים Sertoli, ידועים לייצרפיברונקטין שיכולים לשמש חלבון סמן להערכת זיהום עם PTCs. לכן, טונג ואח. מנומק כי טיפול hyaluronidase נוסף עשוי לשפר את הטוהר של שבר 7 תא סרטולי. ואכן הם יכולים להראות כי טיפול נוסף הצליח להפחית את הזיהום על ידי PTCs כ פי 20, אשר הופך בולט במיוחד כאשר בהשוואה מדיום סרום המכיל משמש לטיפוח התאים Sertoli מטוהרים. מכאן ואילך נוהל משופר ואח טונג. הפך פרוטוקול הרווח וכן נעשה שימוש נרחב על ידי קבוצות גדולות אחרות בתחום 8 (איור 1 ב). במהלך טיפול collagenase רוב PTCs משתחררים ניתן לבודד במקביל לתאי Sertoli. והואיל PTCs במרץ להתרבות אינו מגיב הורמון מגרה זקיק (FSH), תאי Sertoli אינם עוברים מיטוזה יותר ולהגיב FSH ידי שינויים מורפולוגיים מאפייןוגידול monophosphate המחזורית אדנוזין (cAMP) ריכוז 9. מאוד דומה פרוטוקולים עיכול אנזימטי יכול לשמש עבור בידוד של תאים Sertoli העיקרי מבעלי חיים אחרים כמו גבר 10, עכבר 11,12, אוגר סיבירי 13 או יאק 14. למען הסר כמויות גדולות של זיהום בתאי הנבט הלם hypotonic יכול להיות מועסק בסוף ההליך בבידוד 15. זה מאפשר גם בידוד יעיל של תאים Sertoli מן החולדה למבוגרים האשכים 16. השעית תא סרטולי מועשרת יכולה גם להפריד בתאי ניבט ידי ציפוי ההשעיה על מנות לקטינים מצופים ב&quot;דאטורה Stramonium agglutinin 17. רק תאי Sertoli וכמה PTCs שיורית לדבוק צלחות לקטינים. בתרביות תאים ראשוניים Sertoli, בעיקר מן החולדה, שימשו בתחילה על חקירת היענות להורמונים או הקמת שורות תאים כמו li תא העכבר Sertoline TM4 18. שורת תאים זו נחקרה יותר ממאה מחקרים עד היום. בגישה translational תאי Sertoli כבר נוצלו למטרות הגנה חיסונית של תאי שיתוף תרבותיים ורקמות כמו שיתוף השתלת איי לבלב xeno- או אלוגנאית להישרדות שתל לטווח ארוך ללא דיכוי חיסוני מערכתי 19. תאי Sertoli מבודד גם שימשו בניסויים לתרבות משותפת ללימוד-mesenchymal אפיתל (תאים Sertoli - PTCc) ואת תא סומטי-נבט (תאים Sertoli - תאי נבט) אינטראקציות 20, 21. לאחרונה תאי Sertoli ראשיים הועסק על חקירת הביטוי של קולטנים דמוי אגרה ואת הפרשת ציטוקינים מעודדי דלקת וכן מפלי הולכת אותות המוביל ציטוקינים הביטוי בעקבות זיהום עם א פתוגניים ו uropathogenic coli 22. חקירות אחרות האחרונות השתמשו בתאי Sertoli ללימוד p אשכים חיסונייםrivilege 23 והוכיח כי טיפול מקדים טסטוסטרון מדכא את התגובה הדלקתית נגרם LPS 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:289px;">Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4</td>
			<td style="width:111px;">Dako</td>
			<td style="width:124px;">M0851</td>
			<td style="width:289px;">Monoclonal mouse anti human antibody. 
			Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Albumin bovine fraction V 
			Standard grade, lyophilized</td>
			<td style="width:111px;">Serva</td>
			<td style="width:124px;">11930.04</td>
			<td style="width:289px;">Filter (0.45 &#181;m) BSA solutions used for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Corning&#8482; Cell Strainers 70&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">431751</td>
			<td>White color</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Collagenase A from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">DAPI mountant ProLong&#174; Gold Antifade</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:124px;">P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">D-glucose</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">G8644</td>
			<td>100 g/l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Dulbecco&#180;s PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">DNase I</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Electron microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td>EM 109S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:124px;">Axioplan 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Hyaluronidase from bovine testis</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:111px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">CKX41</td>
			<td>Routine cell culture microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal 
			secondary Antibody&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:124px;">A-10684</td>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">O0625</td>
			<td style="width:289px;">Has replaced Sudan III and Sudan IV 
			because of brighter color.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">P6148</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Penicillin (5,000&#160;U/ml)/ 
			Streptomycin (5,000 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15070-063</td>
			<td>100x solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">21875-034</td>
			<td>Contains 300 mg/L L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">T5266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:289px;">Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">T6522</td>
			<td style="width:289px;">The Sigma product is considerably cheaper than the previously used 
			BPTI (Aprotinin) from Roche.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:289px;">Vimentin antibody (V9)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">V6630</td>
			<td style="width:289px;">Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.&#160; Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Wistar WU rats</td>
			<td style="width:111px;">Charles River</td>
			<td style="width:124px;">N/A</td>
			<td>Should be 19 days old on day of experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of sertoli cells and peritubular cells from rat testes

לאשכים, ובפרט הגמטות הזכריות, קורא תיגר על המערכת החיסונית בדרך ייחודית שהזרע הבדיל מופיעים לראשונה בזמן גיל ההתבגרות - יותר מעשר שנים אחרי הקמת סובלנות החיסונית מערכתית. תאים Spermatogenic להביע מספר חלבונים שעשויים להיראות כמו מה שאינו עצמי על ידי המערכת החיסונית. לאשכים חייב אז יוכלו להקים סובלנות לאנטיגנים-ניאו אלה מצד אחד אך עדיין להיות מסוגל להגן על עצמה מפני זיהומים התפתחות גידולים מצד שני. לכן האשכים הם אחד כמה אתרים חסויים חיסוניים בגוף לסבול אנטיגנים זרים מבלי לעורר תגובה חיסונית דלקתית מזיקה. תאי Sertoli לשחק תפקיד מפתח לשמירה על הסביבה חסויה חיסונית זו של אשכים וגם להאריך הישרדות של תאי cotransplanted בסביבת זרה. לכן התאים Sertoli העיקריים הם כלי חשוב ללימוד זכות החיסונית של האשכים כי לא יכול להיות דוארasily שהחליף שורות תאים הוקם או מודלים תאיים אחרים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט ומקיף עבור בידוד של תאים Sertoli - ותאי peritubular אם תרצה בכך - מן האשכים עכברוש בתוך יום אחד.

<html> ההליך המתואר מאפשר בידוד של כ 12 x 10 7 תאים Sertoli מ -10 האשכים חולדה. 3 x 10 6 תאים מצופים בכל טוב על צלחת 6-היטב, כך שש עד שבעה 6 צלחות גם זמינות עבור ניסויים ביום 7. עיכול טריפסין-DNase I הוא השלב הקריטי ביותר במהלך בידוד תא סרטולי. אם עיכול בנקודה זו מקדמת רחוק מדי, היחס בין תאי נבט / תאי Sertoli יגדל עד לא פרופורציונלי עד הסוף. במהלך היום 3-6 של התרבות חשוב לשטוף בזהירות משם כלא דבקות רב או רופף מצורפים בתאים ניבטים ככל האפשר. כחלופת כביסות נרחבות יותר מ -4 ימים בתאי ניבט ניתן להסיר על ידי טיפול hypotonic ביום 3 27. יתרון של השיטה זו היא כי הזמן של תרבית תאי Sertoli נשמר למינימום כך Sertoli פונקציות תא הספציפי הן פוטנציאל טוב יותר שמור מאשר אחרי תקופה של התרבות ממושכת. תחת = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; למרות שטיפול Hyaluronidase משמש כדי להסיר את רוב תאי peritubular שיורית, מספר התאים ישרוד את הטיפול. טוהר תאי Sertoli המבודדים הוא&gt; 95% כפי שניתן שמפגין vimentin immunolabeling (איור 5). מכיוון שתאי peritubular יש פוטנציאל שגשוג חזק, תרבית תאי Sertoli צריכה להתבצע בהעדר בסרום. בנוכחות 10% PTCs בסרום יהווה כ 20% מכלל תאים לאחר 6 ימים של תרבות ואילו החלק שלו יכול להיות צפוי להיות מתחת ל -1% בהיעדר הסרום 7. כמעט כל התאים Sertoli מבודדים הם קיימא כמו להישפט על ידי מכתים כחול Trypan (לא מוצג). בסביבות יום 7 תרבות תאי Sertoli המבודדים מזוהמים לפחות עם בתאים ניבטים ובתאים peritubular (איור 4), כך יש לבצע ניסויים סביב עצם היום הזה, אם אפשר. עבור שחזור טוב חשוב לחזור על הניסויתמיד באותו יום של תרבות. אם transfections מתוכנן הם צריכים להתבצע ביום 4 או 5, ותמציות תא צריכה להתבצע ביום 5 או 6. במהלך לפחות שבועיים בתאים Sertoli תנאי סרום ללא מגיבים FSH ולייצר יותר חלבון מחייב אנדרוגן, activator plasminogen ו transferrin על טיפול FSH. לתרבות עוד שכבת מזין של תאים או בסרום peritubular נדרש. לאחר ארבעה שבועות תרבויות להידרדר, תאים להתנתק תשתית 7. ביום 6 תאי Sertoli ביותר בתרבות רכשו טיפות שומנים. ברוב המכריע של לתאי vacuole הגדול יחיד יצר (איור 5 ג ו 5D). תוכן השומנים הניטראלי ניתן מדמיין בקלות על ידי מכתים שמן האדום O (האיור 4F). בנוסף cel Sertoli<html> ls PTCs שהוסר יכול להיות מתורבת כמו גם (איור 4 א ו -4). PTCs מ -10 אשכים להניב חמש צלוחיות T75 שניתן לצפות כדי ליצור שכבה ומחובר לאחר 2 ימי התרבות. כמו תאי Sertoli מבודד PTCs טרי מבודדים מזוהמים על ידי תאי נבט כי ניתן להסיר במידה רבה על ידי passaging. צלוחיות חצויים 1: 2 על ידי trypsinization סטנדרטי כך 10 צלוחיות יהיה ומחוברות ביום 5 לאחר בידוד. טוהר PTCs המבודד&gt; 95% וניתן אשר באמצעות immunolabeling יקטין שריר α-החלקה (איור 5 א). מהיום ואילך PTCs יכול לשמש בניסויים. בקבוק אחד מספיק עבור כ צלחת אחת 6-היטב, ובארות צריכות להיות ומחוברות למחרת. תאים יכולים להיות passaged פעמים רבות, אך ניסויים צריך להתבצע תמיד באותו מעבר כדי לוודא שתאי להתנהג באופן לשחזור. להעלות / 53,389 / 53389fig1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. מורפולוגיה של האשך ואת זרימת העבודה של ההליך. (א) במגזר של אבובית seminiferous עם רקמת ביניים סמוך מוצג באופן סכמטי. tubules seminiferous מוקף על ידי קרום בסיס (BM) ושכבה היקפית של תאי peritubular myoid (PTC). אפיתל הנבטי ממוקם בצד luminal של קרום הבסיס. תאי Sertoli (SC), פורש האפיתל נבטי שלמות מחוברת חזק אל בע&quot;מ והחברות ביניהם באמצעות צמתים הגורם לחסימה ממוצבת basolateral המייצג את מחסום דם-אשך (BTB). הגרעין הסדיר שלהם (N) מראה אחד או יותר חריצים דמויים פיסורה ומכיל nucleolus. תאי נבט (GC) נמצאים בקשר אינטימי עם גיל בכל שלבי התפתחותם. תא הביניים בין tubules מכיל תאים ליידיג (LC) ותאי חיסון כגון מקרופאגים (MΦ) וכן כולים דם (BV). דְמוּתעיבוד Fijak ו מיינהרדט 28. (ב) Workflow של ההליך; קידוד צבע הוא כמו ב (א). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig2.jpg" /> איור 2. האשכים של חולדות Wistar הם נכרת ו decapsulated. (א) חלל הצפק נפתח דרך חתך אורכי כמתואר בטקסט. כוכבית (*) מציינת את כרית שומן epidydimal. (ב) האשכים מוסרים על ידי חיתוך חבל הזרע ו- (ג) שנאספו צינור חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל 20 מ&quot;ל PBS. כשכל האשכים נאספו הם לחטא ב 20 מ&quot;ל של 1% (w / v) יוד באתנול. למען הסר של יוד הם נשטפים במהירות פעמיים עם 25 מ&quot;לPBS כל. (ד) אשכים לאחר לשטוף PBS הראשון. אשכים (E) מועברים בצלחת פטרי (מימין), ואת tubules seminiferous הם סחטו של albuginea Tunica נפתח באמצעות להבי מספריים סגורים (מהשמאל) כפי שמתוארים בטקסט. (F) אשכי decapsulated עדיין יוצרים מסה קומפקטית בצורת אשך עם tubules היחיד בולט. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig3.jpg" /> בידוד איור 3. תאי Sertoli. (א) לאחר הסרת תאי ביניים ידי 9x עיכול הכביסה טריפסין-DNase אני עם tubules PBS להיות מגויס ולחפש נקי. (ב) במהלך הטיפול collagenase-hyaluronidase-DNase אני peritubular התאהים מתאי שכבת ניבט החיצונית משתחרר. הצינוריות לקבל מקוצרת ולקבל מראה מחוספס. (ג) שברים Tubular לאחר 4x כביסה עם PBS. (ד) Hyaluronidase-DNase אני משחרר טיפול תאי peritubular שיורי וכן בתאי הנבט. קשיות לקבל מקוצר נוסף, אגרגטים צינורי יוצרים. (E) Tubular אגרגטים לאחר שטיפה 4x עם PBS. (F) תאי Sertoli היחיד מיוצרים על ידי העברת אגרגטים 10x באמצעות מחט 18G. ברים בקנה מידה (AE) = 200 מיקרומטר, ב (F) = 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig4.jpg" /> איור 4. תרבות של תאים peritubular (AB) ותאי סרטולי (CF) והסרת contaminat<html> בתאי הנבט ing. (א) PTCs Resuspended משלב 4.5 היו זורעים מיד וצילם למחרת. (ב) לאחר פיצול על זיהום יום 3 עם בתאי הנבט מצטמצם. (ג) ביום 4 תאי Sertoli להראות דפוס מרוצף דמוית טיפוסי. צפים והקפדה בתאי הנבט גלויים לפני הכביסה עם PBS. אותו (ד) גם לאחר שטיפת 3x עם PBS. מספר תאי נבט זיהום מופחת. כביסה שלוש פעמים עם PBS חוזרת ביום 5 ו -6 (ה) ביום 6 של התרבות כמעט כל תאי נבט הוסרו. תאי Sertoli יצרו שכבת תאי מראה ייחודית, ואת רוב התאים רכשו vacuole גדול אחד. (F) O מכתים אדום שמן מראה כי vacuoles אלה טיפות שומנים המכילים שומנים ניטראליים במידה רבה. ברים בקנה מידה (AD) = 200 מיקרומטר, ב (E) = 50 מיקרומטר ו ב (F) = 25 מיקרומטר..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig5.jpg" /> איור 5. Immunofluorescence מכתים. צביעת תאי peritubular העיקרית מטוהרת עם אקטין (שריר חלק) נוגדנים (א) ושל Sertoli תאים עם נוגדנים vimentin (B). לא התאים לזהם גלויים בשני תחומי המבט. סרגל קנה מידה ב (א) ו- (ב) = 10 מיקרומטר. (ג) ו- (ד) תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים של תאי Sertoli אחרי 4 ימים בתרבות. (ג) שים לב בקשר ההדוק של תאים סמוכים (ראשי החץ) מוביל אל הדפוס המרוצף דמוית כפי שניתן לראות באיור 4C. אגל שומנים יחיד (L) הוא ציין בציטופלסמה של כל תא. (ד) אברונים הנפוצים ביותר הם המיטוכונדריה (M) ואת המערכה גולג&#39;י (G).הגרעין (N) מכיל nucleolus (NC) ומראה את כניסת פיסורה דמוית הטיפוסית. סרגל קנה מידה (C) = 1 מיקרומטר (ד &#39;) = 0.25 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes at JoVE.com

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

תאי Sertoli הראשי נדרשים ללימוד זכות testis-אימוניות, הולך אותות בזמן דלקת או זיהום, וניצול של נכסי immunoprotective שלהם. כאן אנו מתארים פרוטוקול אנזים המבוסס עבור בידוד של תאי Sertoli העיקרי נקיים במיוחד ותאי peritubular מן אשכי חולדה.

תאי בידוד של תאי Sertoli ו Peritubular מן חולדת האשכים

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

isolation-of-sertoli-cells-and-peritubular-cells-from-rat-testes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.3K Views.  Justus-Liebig-Universität Gießen.  תאי Sertoli הראשי נדרשים ללימוד זכות testis-אימוניות, הולך אותות בזמן דלקת או זיהום, וניצול של נכסי immunoprotective שלהם. כאן אנו מתארים פרוטוקול אנזים המבוסס עבור בידוד של תאי Sertoli העיקרי נקיים במיוחד ותאי peritubular מן אשכי חולדה. 

Video: Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...