עבודה זו נתמכה על ידי NIH PBS (R21 AI095484). אנו מודים למתקן גרעין tetramer ביטוח בריאות ממלכתי לtetramer CD1d.

1. הכנת מכשירים, תרבות מדיה וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירים: הכינו את חומרים כימיים בתנאים סטריליים ולהשתמש בזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של מדיום תרבית רקמת RPMI, להוסיף 5% בסרום שור עוברי, 2.1 גרם של סודה לשתייה, 10 מיליליטר גלוטמט 100x, 10 מ&quot;ג HEPES, פירובט מ&quot;ג נתרן 1 ו10 מיליליטר של 100x פניצילין / סטרפטומיצין. הערה: הבינוני מומלצת רקמות התרבות, RPMI, הוא להחלפה עם DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון 5% collagenase &quot;D&quot; (5 מיליליטר של collagenase &quot;D&quot; ל9 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון Percoll בשלושה ריכוזים שונים: 100%, 80% ו40%. הריכוזים הבאים מחושבים למדגם 1. שמור על פתרונות בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Percoll: להוסיף 9 מיליליטר של Percoll חי (מפתרון מניות); להוסיף 1 מיליליטר של PBS 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Percoll: להוסיף 8 מיליליטר של Percoll 100%; להוסיף 2 מיליליטר של PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Percoll:להוסיף 4 מיליליטר של Percoll 80%; להוסיף 4 מיליליטר של PBS 1X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 ליטר של תא הקרינה המופעל מיון חיץ (FACS); להוסיף 5 מיליליטר BSA 10% (BSA 0.1%), 1 מיליליטר 10% אזיד הנתרן (0.1%), 2 סוכן מיליליטר EDTA, לעשות עד 1,000 מיליליטר עם 1X PBS. </li></ol> 2. הכנת עיכול כליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שרכש כל אישור מוסדי צורך, להקריב ולגרום לדימום מחודש העכברים עם שיטות סטנדרטיות ובעקבות התקנות הנוכחיות והנחיות טיפול בבעלי החיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם pentobarbital (0.07 מ&quot;ג / קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך exsanguination. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בעמדת פרקדן על שולחן ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את אזור הבטן עם 70% אתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של תמיסת D collagenase לצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וdecapsulate שני הכליות מכל עכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל abdomimal על ידי ביצוע חתך קו האמצע דרך עור הבטן והצפק מעצם החזה ועדהערווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הכליה השמאלית על ידי הזזת המעי רוחבית לצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד בזהירות את הקפסולה נשארה עם המלקחיים. הערה: הכמוסה מופיעה כשכבת שקופה המקיפה את הכליה ומכוסה חלקית על ידי רקמת שומן perinephric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכליה השמאלית על ידי חיתוך כלי pedicle באמצעות מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו התהליך עבור הכליה הימנית. הערה: הכליה הימנית היא יותר גולגולתי ויותר קרובה לקו האמצע (pedicels הם קצרים יותר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכליה לתוך צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את רקמת הכליה לחתיכות קטנות (1-2 מ&quot;מ בממד) באמצעות סכין מתכת בעיצוב רגיל ומניח את החתיכות לתוך תמיסת collagenase ל30-45 דקות בחממה ב 37 ° C (איור 1). </li></ol> 3. הכנת תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC) מעיכול הכליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבל השעיה תא של הכליהעיכול על ידי מכאני לשבש את הרקמה באמצעות מסננת (70 מיקרומטר) ו resuspend ב 25 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות גלולה ב 4 מיליליטר של 40% פתרון Percoll ועדינות שכבה על גבי 4 מיליליטר של 80% פתרון Percoll עם טפטפת פלסטיק העברה, מאוד לאט ובזהירות. זה יגרום בשני שלבים מופרדים על ידי שכבה שקופה באופן ברור. בחלק העליון תהיה שכבה צהובה המתאימה לשומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עם צנטריפוגות בבלם ממצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר על ידי שאיפה לשכבה הצהובה ועבה העליונה (כ 1-2 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השכבה הקלה בלבד לבנבן השקופה מהממשק של שני השלבים עם טפטפת העברה. להעביר בזהירות השעיה זו לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה ולאחר מכן להוסיף 13 מיליליטר של מדיום כדי להפוך את הנפח כולל של15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הדגימות ב 1 מיליליטר של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר KMNC באמצעות הרחקת trypan הכחולה על hemocytometer ולבטא אותן התוצאות כמו מספרים של KMNC למ&quot;ל לכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם כאמור לעיל. </li></ol> 4. תאי בידוד של hematopoietic (+ CD45) מKMNC (שלב I) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עד 10 7 ל90 μl של הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של microbeads CD45 ודגירה של 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של החיץ פועל כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend ב 500 μl של הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העמודה המגנטית על ידי הצבת במגנט ולשטוף עם 3 מיליליטר של הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא דרך העמודה המגנטית ולאסוף את התאים ללא תווית שעוברים דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 3 מיליליטר של running חיץ. ואז לאסוף את השפכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהמפריד ופיפטה 5 מיליליטר של חיץ פועל על גבי העמודים ולשטוף את החלק שכותרתו באופן מיידי. חלק זה מכיל את CD45 + התאים. ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את המספר המוחלט של תת קבוצות תאי T שונות לתוך הכליות להכפיל את המספר הכולל של KMNC ידי אחוז התאים החיוביים שנקבע על ידי cytometry זרימה (איור 2). </li></ol> 5. בידוד של תא T מDN CD45 + ההכנה על ידי סלקציה שלילית (שלב II) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר, מיקרוגרם 1.25) של כל אחד מנוגדני biotinylated הבאים: אנטי CD4, אנטי CD8, קולט אנטי-FC (CD16/32), אנטי-MHC הכיתה השני (IA ב), אנטי tetramer CD1d PBS-57 לכל 10 תאים 7 hematopoietic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 30 דקות בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 microbeads אנטי ביוטין מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור בtהוא המגנט ולהמשיך לדלדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא כדי לקבוע את המספר הכולל של תאי DN T בחלק השלילי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק טוהר תאי DN T עם cytometry זרימה על ידי ביצוע אסטרטגית gating זה: + CD45 השער ראשון, שער השני TCRαβ +. תכלול CD1d + תאים. עלילה מסוג CD4 + CD8 + לעומת לזהות תאי DN T (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הכולל של אחוז שנקבע בטהרה. הערה: שימוש בתוצאות פרוטוקול זה באוכלוסייה של תאי DN T יותר מ 90% טהורים. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression.">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li><li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li><li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression.">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li><li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells.">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li><li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice.">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li><li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells.">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li><li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25+CD4++TR+cells.">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li><li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220++double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production.">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li><li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li><li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+CD4(+)+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure.">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li><li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li><li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys.">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li><li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL/Mp-lpr/lpr+mice.">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li><li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome.">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li><li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice.">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li><li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function.">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

יש עניין גובר בתאי T DN שכן הם נמצאים מעורבים בתנאים פתולוגיים שונים כגון הפרעות אוטואימוניות, סרטן, סובלנות שתל, ומחלות עיקריות של הכליות כולל פציעת כליות חריפה (AKI), גלומרולונפריטיס 8, 13. לכן, יש צורך להבין טוב יותר ולאפיין את פונקציות pathophysiologic של תאי T DN. עם זאת, כיום יש חוסר בהבנה של התפקוד של התאים אלה בהשוואה לתאי CD4 ו CD8 T. סיבה העיקרית היא מחסור בתאי T DN באיברי הלימפה משניים ומכאן קושי בהשגת תאים מספיקים לניתוח במבחנה וניסויים העברת מאמצת. תאי T DN ממוקמים בעיקר ברקמות שאינן הלימפה כגון כליות 8 אבל חוסר שיטות אמינות לבידודם מאיבר מוצק מונע מאמץ כדי לחקור את תפקידם. לכן, פרוטוקול הרומן שלנו לבידוד של תא T DNשל מהכליות צפויות לזרז את המחקר לתפקוד של תאי T DN. תאי T DN מצטברים בבלוטות הלימפה במספרים גדולים בחסרים פאס (LPR) או עכברי FasL הלקוי (GLD) והם יכולים להיות מבודדים בקלות מאיברים הלימפה 9, 14, 15, אבל זה עדיין עדיין מהווה אתגר לבודד תאים אלה מאחרים רקמות. על פי פרוטוקול זה, כליות משני עכברים להניב כ 0.5 x 10 6 תאי hematopoietic (CD45 +) וסביב 0.2 x 10 6 תאי T DN. מספר זה מספיק כדי לבצע בתרבות חוץ גופית, מבחני תפקודיים ו / או ניתוח FACS. הטוהר של אוכלוסיית תאי DN T חייב להיות מאושר על ידי cytometry זרימה. פרוטוקול זה מספק אוכלוסייה של תאי DN T שיכול להיות טהור כמו 98%. בעוד פרוטוקול זה מיועד לבידוד של תאי T DN מהכליות, זה יכול להיות שונה לבידוד של תאי T מאיברים שאינן הלימפה אחרות כגון<html> כמו לב, בלוטת התריס וכו &#39; מאחר ותאי T DN מייצגים אוכלוסייה קטנה, לפעמים יש צורך להגדיל את התשואה על ידי ביצוע סבבים נוספים של טיהור. עם זאת, אם מספר גבוה יותר של תאי T DN נדרש (גבוה יותר מאשר 0.5 x 10 6 תאים) אנו ממליצים לבצע מיון הפרדה על מנת לצמצם את הזמן ועלות מגיב. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לבידוד של תאי T DN מהכליות. הוא מורכב מהכנה (דרך מערכת העיכול והעשרת KMNC) שלב אחרי סלקציה חיובית ולאחר מכן סלקציה שלילית לדלדול של אוכלוסיות תאים לא רצויים. לכן, יש מניפולציה ישירה מינימאלית של תאי DN T במהלך תהליך הבידוד. ראוי לציין כי ישנם פרוטוקולים קיימים לבידוד של תאי DN T מהדם היקפי בעכברים ובבני אדם ומאיברים הלימפה משניים, בדומה לאלו המשמשים לבידוד של תאי T קונבנציונליים. ove_content &quot;&gt; כי זה הוכח כי חלק מתאי T DN להביע FCR-γ, אופציה חלופית היא שלא לכלול CD16/32 + בקוקטייל 16, 17. בידוד מוצלח של תאי T DN דורש תשומת לב רבה לפרטים. חיוני במיוחד צעדים כוללים: עיכול רקמה, חיתוך של רקמת הכליה לחתיכות קטנות, ואיתור נכון ואיסוף אור השכבה בשיפוע הצפיפות בסך הכל, כמה סיבובים של תרגול וחלק מיומנות ידנית נדרשים על מנת להשיג את התוצאה הרצויה..

A correction was made to: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

ההיקפית αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - כפולה שלילי תאים (DN) T מחולקים לקבוצות משנה שונות שיש להם פנוטיפים ופונקציות 1-4 מובחנים. תאי T DN גרוע הם הבינו, אבל יותר ויותר להיות מעורבים בתגובות חיסונית pathophysiological במודלים של מחלות שונות 4-6. תאי T DN הם סוג תא חיסון ייחודי כי הוא מעורב יותר ויותר ברגולציה של תגובות חיסוניים ומחלות אוטואימוניות שונות והאפנון של סובלנות allotransplant. 4-6, 9 הם נדירים בדם ההיקפי ואיברי הלימפה משניים (בלוטות לימפה וטחול ). עם זאת, הם תושבים עיקריים של האפיתל בכליות ומעיים הנורמלי 10-12. מעט מאוד ידוע על תפקידם 7 בכליות במצב היציב ותחת מצבים פתולוגיים כגון פגיעה אקוטית בכליות (AKI) הקשורים transpl כליותנמלה. בגלל התפקידים המורכבים של תאים חיסוניים שונים בויסות תגובה חיסונית כולל alloresponses, המגדיר את תפקידו של כל שחקן הוא קריטי בהבנת alloresponses ועיצוב תרופות חדשות. בהתחשב במספרים המשמעותיים של תאי T DN הווה בכליות בתנאים פיסיולוגיים ומחלות שונים, תאי T DN עשויים לשחק תפקיד קריטי בויסות תגובה חיסונית ומחלות אוטואימוניות בעכברים ובבני אדם, וalloresponses במושתלים. צבירה למרות שראיות עדיין מפוזרות מפלילה תאי DN T בשתי פונקציות פתוגניים ומדכאות את מערכת חיסון, אבל הוא הבין למה ואיך הם מפגינים פונקציה מזיקה או מדכאת ספציפית ואיך הסביבה משפיעה עליהם בצורה גרועה. בשל השפע הנמוך שלהם בכליות, שיטות משופרות של בידוד נחוצות. אין כרגע פרוטוקול סטנדרטי לבידוד של תאי T מDN tהוא רקמות שאינן הלימפה. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה חדשה לבידוד של תאי T DN מהכליות; עם זאת, השיטה יכולה לשמש גם לרקמות שאינן הלימפה שונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Laminar flow hood&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Baker Company, Inc</td>
			<td style="width:276px;"></td>
			<td style="width:200px;">Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Hemocytometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:276px;">63514-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Atmosphere-controlled incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:200px;">&#160;(37&#176;C with 5% CO2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Analytical flow cytometer</td>
			<td style="width:257px;">LSR II&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:439px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:257px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Catalog&#160; Number</td>
			<td style="width:200px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:257px;">Media Tech</td>
			<td style="width:276px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:257px;">Roche</td>
			<td style="width:276px;">11088858001</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:257px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:276px;">&#160;17-0891-01</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">0.1% sodium azide (NaN3)</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:276px;">S2002</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Buffer phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:257px;">Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">PBS 10X</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">EDTA buffer&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:276px;">E1161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">CD45+ microbeads</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">6.78E-51</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">Biotin microbeads&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MiltenyiBiotec</td>
			<td style="width:276px;">130-090-485</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD45 (clone: 30-F11)&#160; PerCP&#160;</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td style="width:276px;">G1397</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD45 (clone: 30-F11)&#160; APC-Cy7</td>
			<td style="width:257px;">Biolegend&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">103116</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-TCR Pacific Blue&#160; (ab-chain, clone: H57-597)</td>
			<td style="width:257px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:276px;">HM3628</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD4 PE</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td>12-0043</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD8 FITC</td>
			<td style="width:257px;">eBioscience&#160;</td>
			<td>8011-0087</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD4 biotinylated (GK1.5)</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553728</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD8 biotinylated&#160; (clone 53-6.7)</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553029</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553143</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-MHC class II (I-A d) biotinylated</td>
			<td style="width:257px;">BD</td>
			<td style="width:276px;">553609</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:439px;">anti-CD1d PBS-57 tetramer</td>
			<td style="width:257px;">NHI tetramer&#160;</td>
			<td style="width:276px;">lote # 15621-PBS57</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:439px;">AutoMACS Running Buffer-&#160; MACS Separation Buffer&#160;</td>
			<td style="width:257px;">MIlteny I Biotec</td>
			<td style="width:276px;">130-091-221</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td style="width:276px;">000664</td>
			<td>Kidneys - Lymph Nodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Petri dish&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:276px;">356517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">70mc filter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Plunger&#160;</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneMate Tubes 50 ml</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>C-3394-3</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">GeneMate Tubes 15 ml</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td style="width:276px;">C-3394-1</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Petri Dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:276px;">S33580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Plate 24 wells&#160;</td>
			<td style="width:257px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:276px;">354723</td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of double negative &#945;&#946; t cells from the kidney

אין כרגע פרוטוקול סטנדרטי לבידוד של תאי T DN מהרקמות שאינן הלימפה למרות המעורבות דיווחה יותר ויותר שלהם בתגובות חיסוניים שונות. תאי T DN הם סוג תא חיסון ייחודי שהיה מעורב בויסות תגובות וסובלנות חיסוניים ואוטואימוניות לallotransplants 1-6. תאי T DN, לעומת זאת, נדיר בדם היקפי ואיברים משניים הלימפה (בלוטות לימפה וטחול), אבל הם התושבים עיקריים של הכליות תקינות. מעט מאוד ידוע על תפקוד pathophysiologic 7 בשל מיעוטם בפריפריה. לאחרונה תיארו ניתוח פנוטיפי ופונקציונלי מקיף של אוכלוסייה זו בכליות 8 במצב יציב, ובמהלך פגיעת reperfusion איסכמיה. ניתוח של תפקוד תא T DN יהיה משופר מאוד על ידי פיתוח פרוטוקול לבידודם מהכליה. כאן אנו מתארים פרוטוקול רומן המאפשר isolation של תאים טהורים מאוד ab מסוג CD4 + CD8 + T ותאי T DN מהכליות העכבריות. בקצרה, אנחנו לעכל רקמת כליה באמצעות collagenase ובודד תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC) על ידי שיפוע צפיפות. זה ואחריו שני צעדים להעשרת תאי T hematopoietic מ -3% ל 70% מKMNC. הצעד הראשון מורכב מסלקציה חיובית של תאי hematopoietic באמצעות CD45 + ערכת בידוד. בשלב השני, תאי T DN מבודדים באופן שלילי על ידי הסרת תאים הלא רצויים באמצעות CD4, CD8, וMHC הכיתה השני נוגדנים חד שבטיים וtetramer α-galcer CD1d. אסטרטגיה זו מובילה לאוכלוסייה של תאי DN T יותר מ 90% טהורים. צביעת משטח עם הנוגדנים שהוזכרו לעיל ואחרי ניתוח FACS משמשת כדי לאשר את טוהר.

כליות סוג בר C57BL / 6 (B6) מכילה כ 1.5-2.1 x 10 6 תאים חד גרעיניים לכליות. כ פחות מ -10% הם CD45 + תאי hematopoietic. להכנת תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC), הכליות לחתוך לחתיכות קטנות כפי שמוצגים באיור 1 ואחרי עיכול באמצעות collagenase 5%. זה ואחריו על ידי ביצוע צנטריפוגה שיפוע צפיפות לאסוף שכבת KMNC (איור 2, פנל משמאל). KMNC אז היו נתונים לסלקציה חיובית באמצעות + microbeads המגנטי CD45 כאמור בסעיף 4 (אני STEP). תאי העמודה מאוגדת אז היו eluted ונותחו לCD45 + על ידי FACS. התוצאה היא ההעשרה של CD45 + תאים לכ 80-95% כפי שנותח על ידי cytometry זרימה (איור 2, פנל באמצע). בין CD45 + תאי hematopoietic מועשר,% על 40-60 היה αβ TCR + (מידע לא מוצג), כ -30-60% היו תאי DN T (איור 2, פנל מימין). השלב האחרון מעורב הכפפת CD45 + תאים מועשרים ברמה של סלקציה שלילית לתייג ולהסיר מסוג CD4 +, CD8 +, MHC הכיתה השני + וCD16/32 תאים + שימוש מבז ביוטין ספציפי וmicrobeads אנטי ביוטין ועמודות מגנטיות. תוצאה זו במטוהרים מאוד (90-95%) תאי DN T (איור 3). בעקבות פרוטוקול זה אותו ניתן היה להשיג עד CD45 hematopoietic 0.5 x 10 6 + תאי שכותרתו מגנטית לכל עכבר (שתי כליות). <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51192/51192fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51192/51192fig1.jpg" /> איור 1. הכנה של הכליה לעיכול עם 5% פתרון collagenase. כליות העכבר לחתוך לחתיכות קטנות של 1-2 מ&quot;מ והניחו בפתרון 5% D collagenase ל30 דקות לחפירהestion. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51192/51192fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51192/51192fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51192/51192fig2.jpg" /> . איור 2 אסטרטגיה להעשרה של CD45 + תאי hematopoietic מהכליה שמאלית:.. מכתים CD45 של כליות MNC לפני ההעשרה באמצעות CD45 + ערכה ידי סלקציה חיובית מרכז: צביעת CD45 של כליות MNC לאחר העשרה באמצעות CD45 + ערכה ידי סלקציה חיובית ימין.: פרופיל CD4 וCD8 של αβTCR + תאים בין CD45 + תאים מגודרות תת שונה של תאי T. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51192/51192fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זה</a>gure. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51192/51192fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51192/51192fig3.jpg" /> . איור 3 טוהר של תאי T DN מבודדים משמאל:. מכתים CD45 של כליות מבודדות תאי DN T על ידי סלקציה שלילית מרכז:.. מכתים TCRαβ של כליות מבודדות תאי DN T על ידי סלקציה שלילית ימני: צביעת CD4 CD8 ובין תאי T DN מבודדים על ידי סלקציה שלילית. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51192/51192fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51192/51192fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4. לימפוציטים בכליות לפני הטיהור. <strong&gt; שמאל: תאים הכולל ברקמת כליה לפני טיהור תאי CD45 ימני:.. מכתים CD45 ברקמת כליה לפני הטיהור <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51192/51192fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Double Negative ÃŽÂ±ÃŽÂ² T Cells from the Kidney at JoVE.com

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

תאי DNabT הם נדירים בין תאי T היקפיים; עם זאת, הם נמצאים בשפע ברקמות שאינן הלימפה מסוימות. קושי של בידוד תאי T DN מרקמות שאינן הלימפה מעכב אנליזה הפונקציונלית שלהם למרות במיוחד גדל הבחין במשמעות pathophysiologic. אנו מתארים פרוטוקול חדשני לבידוד של תאי T DN נקיים במיוחד מכליות עכבריות.

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.1K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine.  תאי DNabT הם נדירים בין תאי T היקפיים; עם זאת, הם נמצאים בשפע ברקמות שאינן הלימפה מסוימות. קושי של בידוד תאי T DN מרקמות שאינן הלימפה מעכב אנליזה הפונקציונלית שלהם למרות במיוחד גדל הבחין במשמעות pathophysiologic. אנו מתארים פרוטוקול חדשני לבידוד של תאי T...

Video: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of puberty - more than ten years after the establishment of systemic immune tolerance. Spermatogenic cells express a number of proteins that may be seen as non-self by the immune system. The testis must then be able to establish tolerance to these neo-antigens on the one hand but still be able to protect itself from infections and tumor development on the other hand. Therefore the testis is one of a few immune privileged sites in the body that tolerate foreign antigens without evoking a detrimental inflammatory immune response. Sertoli cells play a key role for the maintenance of this immune privileged environment of the testis and also prolong survival of cotransplanted cells in a foreign environment. Therefore primary Sertoli cells are an important tool for studying the immune privilege of the testis that cannot be easily replaced by established cell lines or other cellular models. Here we present a detailed and comprehensive protocol for the isolation of Sertoli cells - and peritubular cells if desired - from rat testes within a single day.

Primary Sertoli cells are required for studying testis-immune privilege, signal transduction during inflammation or infection, and utilization of their immunoprotective properties. Here we describe an enzyme-based protocol for the isolation of highly purified primary Sertoli cells and peritubular cells from rat testes.

תאי בידוד של תאי Sertoli ו Peritubular מן חולדת האשכים

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...