Gli autori desiderano ringraziare Guido Verhoeven e Ludo Deboel, Leuven, che erano estremamente utile per stabilire l&#39;isolamento delle cellule di Sertoli primarie in laboratorio Meinhardt a Giessen. Monika Fijak, Gießen, è riconosciuto per il suo aiuto con la figura 1A e consigli. Gli studi sono stati sostenuti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft attraverso concessione BH 93 / 1-1 (SB) e il finanziamento della ricerca internazionale laureato JLU Giessen (Germania) / Monash University (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). Il sostegno è stato ottenuto anche da un contributo dello Stato di Hessen nell&#39;ambito del programma &quot;Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) chiamato &quot;männliche Infertilität bei Infektion &amp; Entzündung&quot; (MIBIE).

Dichiarazione 1. Animal Ethics Gli esperimenti qui descritti sono stati eseguiti secondo le linee guida del Regierungspräsidium Giessen, in Germania, in qualità di autorità locale e confermano il codice tedesco di condotta per la cura e l&#39;uso di animali a fini sperimentali (permesso. No: GI 20/23 Nr A 31 / 2012). 2. Preparazione di media, soluzioni di enzimi e animali <ol><li> Preparare 1% di alcool iodio sciogliendo 1 g di iodio in 100 ml di etanolo. </li><li> Preparare 2x 500 ml Dulbecco&#39;s tampone fosfato (PBS) senza Ca 2+ e Mg 2+ integrato ciascuno con 7,5 ml di D-glucosio (100 g / L) e 5 ml 100x penicillina / streptomicina soluzione madre (15 mg / ml D -Glucosio, 50 U / ml penicillina e 50 mg / ml di streptomicina finale). </li><li> Supplemento 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 5 ml di soluzione madre 100x penicillina / streptomicina (50 U / ml penicillina e 50 mg / ml di streptomicina pinnaal). </li><li> Preparare una soluzione di tripsina-I DNasi (2,5 mg / ml di tripsina e 10 ug / ml DNasi I) aggiungendo 25 mg tripsina e 0,1 ml DNasi I (1 mg / ml DNasi I) a 9,9 ml di PBS. </li><li> Sciogliere inibitore della tripsina 50 mg in 5 ml di PBS per tripsina inibitore Una soluzione (10 mg / ml). Sciogliere inibitore della tripsina 25 mg in 10 ml di PBS per soluzione tripsina inibitore B (2,5 mg / ml). </li><li> Per una soluzione di collagenasi-ialuronidasi-Deoxyribonuclease I (DNasi I) sciogliere 10 mg collagenasi A (1 mg / ml finale), 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml finale) e 0,1 ml di DNasi I (1 mg / ml DNasi I) ( 10 ug / ml finale) in 10 ml di PBS. </li><li> Preparare una soluzione di I Hyaluronidase DNasi aggiungendo 10 mg ialuronidasi (1 mg / ml finale) e 0,1 ml di soluzione di DNasi I (1 mg / ml) (10 ug / ml finale) a 9,9 ml di PBS. </li><li> Order ratti Wistar in tempo in modo che siano 19 giorni dal giorno di isolamento delle cellule Sertoli. Nota: Il protocollo descritto è progettato per 10 ratti, ma può essere modificata per un minimo di 5 ad un massimo di 20 ratti.I volumi di tutte le soluzioni devono essere regolati di conseguenza. </li><li> Preparare soluzione madre Oil Red O sciogliendo 0,35 g Oil Red O in 100 ml di isopropanolo. Stir O / N, filtrare 0,2 micron e conservare a temperatura ambiente per un massimo di un anno. </li><li> Preparare soluzione colorante Oil Red O mescolando 6 ml di soluzione madre Oil Red O con 4 ml di acqua (3: 2). Dopo 10-20 minuti filtro attraverso 0,2 micron. Utilizzare entro il prossimo 2 hr. </li><li> Preparare un 4% (w / v) di formaldeide in una cappa ventilata aggiungendo 4 g di polvere paraformaldeide (PFA) a 80 ml di PBS 1x mescolando delicatamente. Calore a ~ 60 ° C, aggiungere 1 ml di 1 M NaOH e continuare a mescolare fino a quando la paraformaldeide si scioglie. Lasciare raffreddare la soluzione fino a RT, regolare il pH a 7,4 con 1 M HCl e il volume a 100 ml con PBS 1x. Filtrare la soluzione (0,45 micron) e utilizzare fresche o conservare in aliquote a -20 ° C per diversi mesi. Nota: polimerizzato formaldeide (PFA) depolimerizza a formaldeide monomerica in acqua. Questo processo ècatalizzata da moderato riscaldamento e un pH leggermente alcalino. Preparare tutte le soluzioni enzimatiche fresco e filtro sterilizzare (0,2 pM) loro il giorno di utilizzo. Se un produttore diverso per un enzima (vedi Materiali / attrezzature Table) è usato, regolare con cura la sua concentrazione / attività. Nel protocollo a seguito di una &quot;pipetta&quot; sta per una pipetta sierologica. </li></ol> 3. Preparazione del seminiferi tubuli <ol><li> Anestetizzare 10 ratti maschi Wistar uno per uno in un essiccatore con CO 2 e una portata che sposta almeno il 20% del volume della camera per minuto. Attendere fino a quando si ferma la respirazione, prova anestesia schiacciando un rilievo del piede, e se non vi è alcuna reazione eutanasia ogni ratto da dislocazione cervicale. Drenare il sangue dal sezionamento vena giugulare e carotide (carotica vagina) sotto l&#39;acqua corrente. Disinfettare l&#39;addome strofinando con etanolo al 70%. </li><li> Uso pinze sollevare la pelle dal Mus addominaleCles e tagliare fuori una forma ovale lobo pelle che si estende dalla sinfisi pubica allo sterno (Figura 2A) e flap verso l&#39;alto sul petto. Successivamente, afferrare i muscoli addominali e fare una incisione mediale della sinfisi pubica allo sterno. <ol><li> Comprimere la addome con i pollici dal bacino verso l&#39;alto in modo da spingere i testicoli su bacino inferiore. Scegliere il cuscinetto di grasso dell&#39;epididimo (Figura 2B) con una pinza per tirare su il testicolo ulteriormente. Tagliare il funicolo spermatico (Figura 2B), lasciando la tunica albuginea intatto, e raccogliere tutti i testicoli in 20 ml di PBS in un tubo da 50 ml (Figura 2C). </li></ol></li><li> Dopo aver raccolto tutti testicoli, disinfettare aggiungendo un volume uguale (20 ml) di 1% (w / v) di iodio in etanolo. Invertire il tubo per due volte e decantare immediatamente il surnatante. Lavare rapidamente i testicoli due volte con 25 ml di PBS ciascuno (Figura 2D). </li><li> Trasferire i testicoli ad una capsula di Petri contieneing 15 ml di PBS (figura 2E). Afferrare ogni testis saldamente pinza ad una estremità, una piccola incisione nella tunica albuginea all&#39;estremità opposta, e spremere tubuli con lame a forbice chiusi come strumento raschiatura. Nota: I tubuli devono ancora formare un compatto fascio a forma testicolo con pochi tubuli estende nella soluzione per consentire omogenea digestione enzimatica (Figura 2F). </li><li> Trasferire i testicoli de-incapsulato in un flacone da 100 ml con tappo a vite contenente 10 ml di tripsina-DNasi I soluzione. Eseguire la digestione in un bagno d&#39;acqua a 32 ° C (120 oscillazioni / min). Dopo 4 minuti di valutare i tubuli ad occhio nudo per la dispersione dei tubuli. Una volta tubuli cominciano a disperdersi nella soluzione, interrompere immediatamente la digestione. Se necessario, continuare l&#39;incubazione per un massimo di 2 min. </li><li> Smettere di digestione tripsina con l&#39;aggiunta di 5 ml di soluzione di inibitore della tripsina A. Mescolare bene la soluzione pipettando su e giù 3-4 tempos utilizzando una pipetta 10 ml e trasferirlo in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Dopo 5 minuti di incubazione osservano tubuli depositano per unità gravità, rimuovere con attenzione il surnatante utilizzando la pipetta 10 ml di passaggio 3.6 e aggiungere 10 ml di soluzione di inibitore della tripsina B per fermare completamente tripsina digestione. Risospendere i tubuli pipettando su e giù per 2-3 volte. </li><li> Al fine di rimuovere contaminanti cellule interstiziali lavare i tubuli 9 volte con 25 ml di PBS ciascuno. Risospendere tubuli in ogni lavaggio utilizzando una pipetta da 25 ml e permettere loro di stabilirsi per unità gravità per 10 min. Utilizzare sempre la stessa pipetta 25 ml pipettando PBS, risospensione e la rimozione del supernatante. </li></ol> 4. Rimozione / Isolamento di cellule peritubulari (PTC) <ol><li> Trasferire tutti i tubuli per una bottiglia con tappo a vite 100 ml e aggiungere la soluzione di collagenasi I-Hyaluronidase-DNasi (Figura 3A). Eseguire la digestione per 10 minuti in un bagno d&#39;acqua a 32 ° C (120 oscillazioni / min). </li><li> Pipettare una goccia della sospensione su un vetrino e controllare rapidamente i tubuli sotto un microscopio ottico invertito per coltura cellulare di routine a ingrandimento 100X. Se la digestione non è avanzata abbastanza continuare incubazione per altri 2 minuti (non contare il tempo necessario per il controllo microscopica). Nota: Durante questa fase tutti i tubuli vengono ridotti in bordi di lunghezza e tubuli dovrebbe diventare ruvida (Figura 3B e C). spigoli sono indicativi per il rilascio di cellule peritubulari. </li><li> Trasferire la sospensione con tubuli digeriti ad un tubo conico da 50 ml con la pipetta 25 ml dal punto 3.8. Lavare il flacone 100 ml con 10 ml di PBS e aggiungerlo tubuli nel tubo conico. Lasciare i tubuli digeriti di stabilirsi per unità gravità per 10 minuti, e con attenzione aspirare il surnatante, contenente le PTC, utilizzando di nuovo la pipetta 25 ml e le trasferisce in un nuovo tubo conico. Per l&#39;aspirazione degli ultimi millilitri utilizzare una pipetta da 5 ml in order per impedire qualsiasi riporto di tubuli. </li><li> Aggiungere 20 ml di terreno RPMI 1640 supplementato con 10% siero bovino fetale inattivato al calore (FBS) per i supernatanti tubulo raccolti, mescolare e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT senza utilizzare la pausa. </li><li> decantare con cautela il surnatante e risospendere le PTC in pellet in 20 ml di RPMI 1640 medium supplementato con 10% FBS inattivato al calore e di semi di 4 ml ciascuno su cinque palloni T75 contenenti 16 ml di mezzo ciascuno. Incubare a 37 ° C in 5% CO 2 nell&#39;atmosfera (Figura 4A). </li><li> Al 3 ° giorno di coltura trypsinize i PTC e dividerli 1: 2 da fiasche T75 contenenti 16 ml RPMI 1640 supplementato con 10% FBS inattivato al calore ciascuno (resa 10 flaconi complessivamente) (Figura 4B). Continua incubazione a 37 ° C in 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Al 5 ° giorno di coltura trypsinize nuovamente i PTC e piatto su 6 pozzetti o 24 pozzetti seconda dell&#39;esperimento(Una beuta T75 per piastra). Gli esperimenti possono essere eseguite il giorno 6. </li></ol> 5. L&#39;isolamento di cellule di Sertoli (SC) <ol><li> Risospendere i tubuli stabiliti dal punto 4.3 a fondo in 25 ml di PBS utilizzando una pipetta da 25 ml e permettere loro di stabilirsi per unità gravità per 12 min. Utilizzare la stessa pipetta da 25 ml per la dispensazione di PBS, risospensione dei tubuli e la rimozione dei surnatanti. Ripetere il lavaggio per 3 volte (4 lavaggi in totale). </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio trasferire i tubuli digeriti per altri 100 ml vite tappo di bottiglia contenente la soluzione Hyaluronidase-DNasi I. Eseguire la digestione in un bagno d&#39;acqua a 32 ° C (120 oscillazioni / min). </li><li> Dopo 5 minuti controllare i tubuli di nuovo mediante ispezione al microscopio a luce ingrandimento 100X come descritto al punto 4.2. Nota: tubuli brevi, aggregati tubulari e le cellule rilasciati dovrebbero essere visibili (Figura 3D). <ol><li> Lasciare gli aggregati tubolari accontentarsi di 10 min, e aspirare il surnatante noiing una pipetta 25 ml. Lavare aggrega 4 volte con 25 ml di PBS e un tempo di sedimentazione di 10 min per ogni fase di lavaggio (Figura 3E). </li></ol></li><li> Aggiungere 20 ml di RPMI 1640 medium e passare la sospensione per 10 volte attraverso un ago 18 G montato su una siringa da 20 ml. Evitare di bolle d&#39;aria. Nota: Tirando la sospensione in e fuori attraverso l&#39;ago è considerato come un passaggio. L&#39;interruzione ed omogeneizzazione delle cellule per tranciatura idrodinamico è una tecnica standard per la preparazione di cellule che tendono ad aggregarsi. Il passaggio di cellule attraverso un ago ipodermico di piccolo diametro interno è improbabile che abbia un impatto sulle loro proprietà funzionali 25. Figura 5C e D mostra la normale ultrastruttura delle cellule di Sertoli purificate il giorno 4 della cultura. <ol><li> Dispensare una goccia di sospensione su un vetrino e controllare i tubuli sotto un microscopio ottico invertito per coltura cellulare di routine a 10X di ingrandimento se il agg rapidamenteRegates sono tutti dispersi (Figura 3F). Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cella 70 micron per ottenere una sospensione di cellule singole puro nel filtrato. </li></ol></li><li> Centrifugare il filtrato del punto 5.4 a 200 xg per 10 min a RT senza utilizzare la pausa. Con attenzione aspirare il surnatante con una pipetta 25 ml, e sospendere nuovamente le cellule di Sertoli in 40 ml RPMI 1640 medium (privo di siero). </li><li> Mescolare 100 ml sospensione cellulare con 100 ml di Trypan Blue Stain e contare le cellule con una camera migliorata Neubauer. Regolare la concentrazione cellulare a 3 x 10 6 cellule / ml in base al risultato del conteggio. Seed 1 ml per bene su un 6-pozzetti (= giorno 1). Se è prevista una colorazione Oil Red O (fase 6) mettere un vetrino in uno o pochi pozzi prima della semina cellule di Sertoli. Nota: cellule di Sertoli in sospensione si depositano rapidamente in modo che il tubo deve essere agitato brevemente ogni volta prima di una aliquota di cellule è presa con la pipetta. Fino al giorno 4 sono fermamente attach al substrato. </li><li> Al fine di rimuovere le cellule germinali galleggianti o aderenti il giorno 4 (Figura 4C) lavare i pozzetti delle piastre 6 pozzetti utilizzati per la placcatura isolate cellule di Sertoli (passo 5,6) con PBS (Figura 4D). Aspirare il terreno, aggiungere 1-2 ml di soluzione salina in ogni pozzetto e agitare le 6 pozzetti orizzontalmente su un tavolo con forza, ma senza spargimento PBS. Ripetere il lavaggio per 3 volte ed eseguire la stessa procedura di lavaggio al giorno 5 e 6 (figura 4E). Nota: Il giorno 4 cellule di Sertoli sono ben attaccati e mostrare un acciottolato come il modello sotto il microscopio ottico invertito (Figura 4C). Gli esperimenti possono essere eseguiti dal giorno 7 in poi. <ol><li> (Alternativa a passo 5.7) Per la rimozione di galleggianti e cellule germinali aderenti eseguono uno shock ipotonico 3 giorni dopo la semina su piastre da 6 pozzetti. Rimuovere il supporto e aggiungere 1 ml di 20 mM Tris pH 7.5 presi direttamente fuori dal frigo. Aspirare il tampone Tris dopo 90 a 120 secondi, ma nondopo. Lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere 2 ml di RPMI 1640 medium (senza siero). Facoltativamente, eseguire esperimenti il ​​giorno successivo. Nota: Più lunga la durata dello shock ipotonico è più cellule germinali può essere rimosso, ma i più cellule di Sertoli perdersi pure. Il primo lavaggio PBS dovrebbe essere eseguita rapidamente, ma con cura per non spostare le cellule di Sertoli. Subito dopo il trattamento ipotonico numerosi vacuoli di diverse dimensioni si possono osservare nel citoplasma al microscopio a contrasto di fase. I vacuoli scompaiono nel giro di poche ore dopo il trattamento ipotonico. </li></ol></li></ol> 6. Oil Red O Colorazione <ol><li> Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente. Il giorno cellule di Sertoli 7 lavaggio coltivate su un vetrino (passo 5,6) con PBS due volte e fissarli con formalina al 10% in PBS. Dopo 10 min sostituire formalina con soluzione fresca, e continuare fissazione per altri 60 min. Nota: Tutte le soluzioni vengono aggiunti al pozzo (s) con un vetrino e aspirati prima del passaggio successivo. </li&gt; <li> Aspirare formalina, lavare le cellule con acqua due volte e aggiungere il 60% di isopropanolo. Dopo 5 minuti consentono alle cellule di aria secca per qualche minuto. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di colorazione Oil Red O per pozzetto e incubare per 10 min. Aspirare la soluzione e lavare le cellule immediatamente 4 volte con acqua e montare copertura scivola in glicerolo-PBS (9: 1). Prendere immagini in campo chiaro con un microscopio ottico di routine (Figura 4F). </li></ol> 7. immunofluorescenza colorazione <ol><li> Lavare PTC (dal punto 4.5) o cellule del Sertoli (dal punto 5.5) coltivate su un vetrino con PBS due volte e fissarli con il 4% PFA per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare con 5% BSA in PBS per 1 ora a RT. Scartare la soluzione BSA-PBS e aggiungere fresca soluzione BSA-PBS contenente actina (muscolo liscio) (per PTC) o vimentina (per le cellule di Sertoli) anticorpo primario (diluizione 1: 100 per entrambi gli anticorpi) e incubare a 4 ° CO / N. Nota: L&#39;incubazione con blocchi BSA legame non specifico dell&#39;anticorpo primario. </li><li> Coperchio Wash scivola 3 volte per 5 min in PBS-0.1% Tween 20 e incubare con anticorpi di capra colorante verde fluorescente coniugato anti-topo secondario (diluizione 1: 1.000) a temperatura ambiente per 1 ora al buio. </li><li> Coperchio Wash scivola 3 volte per 5 min in PBS-0.1% Tween 20 e montarle in DAPI mezzo di montaggio. </li></ol> 8. Analisi ultrastrutturali <ol><li> Lavare le cellule di Sertoli (dal punto 5.6) cresciuti su una piastra di coltura cellulare 6 centimetri con PBS e fissare per 2 ore a 4 ° C in una miscela di glutaraldeide al 2,5%, 2,5% paraformaldeide e acido picrico 0,05% in 67 mM tampone cacodilato ( pH 7.4) secondo Ito e Karnovsky 26. </li><li> Eseguire post-fissazione in 1% tetrossido di osmio seguito da un / N incubazione O a 0,3% acetato di uranile sciolto in 50 mM tampone maleato (pH 5). campioni Incorpora in embedding dei media secondo le procedure standard. Tagliare sezioni sottili, li contrastano con citrato di piombo ed esaminare con un microscopio elettronico. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+response+elements+of+the+c-fos+promoter+and+involvement+of+intermediate+transcription+factor(s)+in+the+induction+of+Sertoli+cell+differentiation+(transferrin+promoter+activation)+by+the+testicular+paracrine+factor+PModS.">Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS.</a> Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).</li><li>Bhushan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uropathogenic+Escherichia+coli+block+MyD88-dependent+and+activate+MyD88-independent+signaling+pathways+in+rat+testicular+cells.">Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells.</a> J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).</li><li>Meinhardt, A., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+paracrine+and+endocrine+aspects+of+testicular+immune+privilege.">Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).</li><li>Fijak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Testosterone+on+Inflammatory+Response+in+Testicular+Cells+and+Expression+of+Transcription+Factor+Foxp3+in+T+Cells.">Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells.</a> Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).</li><li>Mamidi, M. 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Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, when Sertoli cells are isolated using the procedure described here they get deprived of their intimate contacts to neighboring PTCs and spermatogenic cells. Nevertheless they appear to retain many properties that are characteristic for them in vivo like hormone responsiveness and expression of marker genes although in a time-dependent manner and on a lower level. 
Primary Sertoli cells develop large neutral lipid droplets after six days of culture. One of the vital functions of Sertoli cells is phagocytosis of degenerating and apoptotic germ cells and of germ cell material like the so called residual bodies29. It is known that residual bodies and cytoplasts from elongated spermatids adhere to isolated Sertoli cells and get phagocytosed30. As it is impossible to remove all germ cells during the isolation procedure we therefore hypothesize that contaminating germ cells can also adhere to Sertoli cells after plating and get phagocytosed. Since residual bodies contain small lipid droplets it is easily conceivable that Sertoli cells acquire large lipid droplets after extensive phagocytosis of adhering and damaged germ cells. There is also evidence that phagocytotic clearance of apoptic cells actively downregulates inflammatory and immune responses31 which could be important for establishing and maintaining the testis as an immune priviliged organ.
When isolated Sertoli cells are plated on top of a layer of primary peritubular cells both cell types survive longer and do form a basal lamina between them. Morphologically they are able to form structures reminiscent of seminiferous tubules indicating that both cell types have retained their capacity to properly interact7. Like freshly isolated primary Sertoli cells the frequently used mouse Sertoli cell line TM4 does respond to FSH with increased production of cAMP18, but contrary to primary cells it is not able to produce androgen binding protein32. Moreover it has been shown that the mouse Sertoli cell line 1 lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells12. 
Similarly the rat Sertoli cell line SCIT-C8 expresses the epithelial markers transferrin, clusterin and stem cell factor but has lost androgen receptor expression and androgen responsiveness whereas it has aquired expression of some mesenchymal markers like fibronectin and entactin-133. Therefore, primary Sertoli cells, although expensive and tedious to isolate, appear to retain significantly more qualitative in vivo properties during cell culture than cell lines do. 
Future applications of primary Sertoli cells will focus on immuno-protection of co-cultured or co-transplanted cells, on experiments studying cell-cell interactions, and on investigating the immune privilege of testis.

Testicoli producono gameti maschili e ormoni sessuali, cioè, gli androgeni. L&#39;organo è composto di due compartimenti. Nel vano interstiziale, che rappresenta circa il 10-12% del volume testicolare totale 1, steroidogenesi avviene all&#39;interno delle cellule di Leydig. Il vano tubolare rappresenta circa il 60-80% del volume testicolare 1 e contiene le cellule germinali e due tipi di cellule somatiche - cellule peritubulari e cellule di Sertoli. Il testicolo è diviso da setti di tessuto connettivo in 250-300 lobuli, ciascuna contenente 1-3 altamente contorte tubuli seminiferi. Questi tubuli sono racchiusi da una membrana basale, un foglio di collagene, e uno strato circonferenziale di cellule peritubulari (Figura 1A). L&#39;epitelio germinale si trova sul lato luminale della membrana basale. cellule di Sertoli sono grandi cellule allungate che si estendono su tutta la epitelio germinale dalla membrana basale al lume. Sono fortemente attdoleva alla membrana basale e formare un foglio cellulare continuo attraverso basolaterale giunzioni strette organizzati che occlude l&#39;epitelio germinale dall&#39;interstizio e rappresenta la barriera emato-testicolare. cellule di Sertoli hanno proiezioni citoplasmatici di primo piano e ramificazioni che permettono loro di entrare in contatto morfologica e funzionale stretto con un numero di specie-specifica, ma costante di cellule germinali. Le cellule staminali germinali diploidi proliferano e si differenziano in spermatogoni. Durante la meiosi I breve durata spermatociti tetraploide sono generate che si sviluppano ulteriormente in quattro spermatidi aploidi durante la meiosi II. Tutte le cellule germinali sono interconnesse da ponti citoplasmatici in modo da formare una rete cellulare. L&#39;evento principale durante la maturazione di spermatidi è l&#39;estrusione di gran parte del citoplasma, formando corpi residui, in un processo chiamato spermiogenesi. corpi residui vengono fagocitati dalle cellule del Sertoli. spermatidi tardivi vengono poi rilasciati inlume tubulare e trasportati nelle epididimo di ulteriore maturazione. cellule di Sertoli e le cellule germinali sembrano coordinare reciprocamente spermatogenesi topograficamente e funzionale. Preparazione dei singoli tipi di cellule testicolari iniziata quasi un secolo fa, quando piccoli pezzi testicolari sono state coltivate e tipi di cellule identificate al microscopio 2. Con un&#39;attenta dissezione dei tubuli dopo l&#39;apertura della tunica albuginea con pinze punta fine è stato poi possibile separare tubolare e compartimenti interstiziali 3. Nel 1975 Welsh e Wiebe introdotto un trattamento collagenasi per liberare i tubuli di aderire tessuto interstiziale e un trattamento pancreatina per la rimozione dello strato di cellule peritubulare esterna 4. Fin dall&#39;inizio ratti giovani immaturi (circa 20 giorni) erano stati utilizzati in cui le cellule di Sertoli comprendono una grande frazione della popolazione delle cellule tubulari, perché la spermatogenesi non è ancora iniziato. A questo ratto Sert etàcellule oli cessano di dividersi, e giunzioni strette tra le cellule vicine formano in modo che la barriera emato-testicolare è stabilito 5. Indipendente di Welsh e Wiebe Dorrington et al. Ha introdotto una combinazione di tripsina e deossiribonucleasi seguito da inibitore della tripsina e soybeen trattamento collagenasi che è stato pubblicato nello stesso anno 6. Entrambi i gruppi utilizzati anche forza meccanica (disegno frammenti digeriti tubolari volte attraverso un ago siringa o una pipetta Pasteur, rispettivamente) per produrre una sospensione omogenea per la placcatura che contiene circa il 70% di cellule di Sertoli. Dopo 3 giorni di coltura, utilizzando un mezzo che è privo di siero, la percentuale di cellule di Sertoli aumenta di circa il 90%. Questo potrebbe essere in gran parte attribuito alla morte di contaminare cellule germinali. Residui cellule peritubulari (CTP), tuttavia, rimanere saldamente attaccati tramite il loro matrice extracellulare. CTP, ma non le cellule di Sertoli, sono noti per la produzionefibronectina che può servire come una proteina marker per valutare la contaminazione con PTC. Pertanto, Tung et al. motivato che un trattamento ialuronidasi ulteriore potrebbe migliorare la purezza della frazione di cellule di Sertoli 7. In effetti si potrebbe dimostrano che un trattamento aggiuntivo è stato in grado di ridurre la contaminazione da PTC di circa 20 volte, che diventa particolarmente evidente quando in confronto un mezzo di siero contenente viene utilizzato per la coltivazione di cellule di Sertoli purificate. Da allora la procedura perfezionata di Tung et al. è diventato il protocollo prevalente ed è stato ampiamente utilizzato da altri gruppi importanti nel campo 8 (Figura 1B). Durante il trattamento collagenasi la maggioranza dei PTC vengono rilasciati e può essere isolato in parallelo alle cellule di Sertoli. Considerando che le PTC vigorosamente proliferano e non rispondono al follicolo-stimolante (FSH), cellule di Sertoli non subiscono mitosi più e rispondere alle FSH da cambiamenti morfologici caratteristicie un aumento adenosina monofosfato ciclico (cAMP) concentrazione 9. Molto simili protocolli digestione enzimatica può essere utilizzato per l&#39;isolamento delle cellule di Sertoli primarie da altri animali come l&#39;uomo 10, il mouse 11,12, criceto siberiano 13 o 14 yak. Per la rimozione di grandi quantità di contaminanti cellule germinali uno shock ipotonico può essere impiegato al termine della procedura di isolamento 15. Ciò consente anche l&#39;isolamento efficiente delle cellule di Sertoli da ratto adulto testicoli 16. Una sospensione di cellule di Sertoli arricchito può essere separato dalle cellule germinali dalla placcatura la sospensione su piatti lectina rivestiti con Datura stramonium agglutinine 17. Solo le cellule di Sertoli e un paio di PTC residui aderiscono alle piastre lectina. colture cellulari primarie di Sertoli, soprattutto dal ratto, sono stati utilizzati inizialmente per studiare la reattività agli ormoni o la creazione di linee cellulari, come la Li cellule del mouse Sertoline TM4 18. Questa linea cellulare è stata valutata in più di un centinaio di studi fino ad oggi. In un approccio traslazionale cellule di Sertoli sono stati utilizzati per immuno-protezione delle cellule e dei tessuti, come nella co-trapianto di isole pancreatiche xeno- o allogenici per la sopravvivenza del trapianto a lungo termine co-coltura senza immunosoppressione sistemica 19. Cellule di Sertoli isolate sono stati utilizzati anche in esperimenti di co-coltura per lo studio epitelio-mesenchimale (cellule di Sertoli - PTCC) e di cellule somatiche di germi (cellule di Sertoli - cellule germinali) INTERAZIONI 20, 21. Cellule di Sertoli Recentemente primarie sono stati impiegati per studiare l&#39;espressione dei recettori Toll-like e la secrezione di citochine pro-infiammatorie, così come le cascate di trasduzione del segnale che porta a citochine espressione a seguito dell&#39;infezione da non patogeni e uropatogeni E. coli 22. Altre indagini recenti stavano usando cellule del Sertoli per lo studio del testicolo p immunitariorivilege 23 e ha dimostrato che il testosterone pretrattamento sopprime la risposta infiammatoria LPS-indotta 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:289px;">Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4</td>
			<td style="width:111px;">Dako</td>
			<td style="width:124px;">M0851</td>
			<td style="width:289px;">Monoclonal mouse anti human antibody. 
			Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Albumin bovine fraction V 
			Standard grade, lyophilized</td>
			<td style="width:111px;">Serva</td>
			<td style="width:124px;">11930.04</td>
			<td style="width:289px;">Filter (0.45 &#181;m) BSA solutions used for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Corning&#8482; Cell Strainers 70&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">431751</td>
			<td>White color</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Collagenase A from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">DAPI mountant ProLong&#174; Gold Antifade</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:124px;">P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">D-glucose</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">G8644</td>
			<td>100 g/l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Dulbecco&#180;s PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">DNase I</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Electron microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td>EM 109S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:124px;">Axioplan 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Hyaluronidase from bovine testis</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:111px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">CKX41</td>
			<td>Routine cell culture microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal 
			secondary Antibody&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:124px;">A-10684</td>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">O0625</td>
			<td style="width:289px;">Has replaced Sudan III and Sudan IV 
			because of brighter color.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">P6148</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Penicillin (5,000&#160;U/ml)/ 
			Streptomycin (5,000 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15070-063</td>
			<td>100x solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">21875-034</td>
			<td>Contains 300 mg/L L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">T5266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:289px;">Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">T6522</td>
			<td style="width:289px;">The Sigma product is considerably cheaper than the previously used 
			BPTI (Aprotinin) from Roche.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:289px;">Vimentin antibody (V9)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">V6630</td>
			<td style="width:289px;">Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.&#160; Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Wistar WU rats</td>
			<td style="width:111px;">Charles River</td>
			<td style="width:124px;">N/A</td>
			<td>Should be 19 days old on day of experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of sertoli cells and peritubular cells from rat testes

Il testicolo, ed in particolare il gamete maschile, sfida il sistema immunitario in modo unico perché differenziato spermatozoi appaiono prima al momento della pubertà - più di dieci anni dopo l&#39;istituzione della tolleranza immunitaria sistemica. cellule spermatogeniche esprimono un certo numero di proteine ​​che possono essere visti come non-self dal sistema immunitario. Testicolo deve quindi essere in grado di stabilire tolleranza a questi neo-antigeni da un lato ma comunque in grado di proteggersi dalle infezioni e sviluppo tumorale dall&#39;altro. Pertanto il testicolo è uno dei pochi siti privilegiati immunitarie del corpo che tollerano antigeni estranei senza evocare una risposta immunitaria infiammatoria dannosa. cellule di Sertoli svolgono un ruolo chiave per il mantenimento di questo ambiente privilegiato immunitario del testicolo e anche prolungare la sopravvivenza delle cellule cotransplanted in un ambiente straniero. Pertanto cellule di Sertoli primarie sono uno strumento importante per lo studio del privilegio immunitario del testicolo che non può essere postaasily sostituito da linee cellulari stabilizzate o altri modelli cellulari. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato e completo per l&#39;isolamento delle cellule di Sertoli - e le cellule peritubulari se lo si desidera - da testicoli di ratto in un solo giorno.

La procedura descritta permette l&#39;isolamento di circa 12 x 10 7 cellule del Sertoli da 10 testicoli di ratto. 3 x 10 6 cellule sono placcati per pozzetto su una piastra da 6 pozzetti in modo tale che da sei a sette 6 pozzetti sono disponibili per esperimenti sulla giorno 7. La digestione tripsina-DNasi I è la fase più critica durante l&#39;isolamento delle cellule di Sertoli. Se la digestione, a questo punto avanza troppo lontano, il rapporto tra cellule germinali / cellule del Sertoli sarà sproporzionatamente aumenterà fino alla fine. Durante il giorno 3-6 della cultura è importante lavare accuratamente via come molti non aderente o debolmente allegate cellule germinali possibile. Come alternativa ad ampie lavaggi in 4 giorni le cellule germinali può essere rimosso mediante trattamento ipotonico il giorno 3 27. Un vantaggio di questo metodo è che il tempo di coltura cellulare Sertoli è ridotto al minimo in modo che funzioni specifiche cellule di Sertoli sono potenzialmente migliore mantenuto che dopo un prolungato periodo di coltura. <p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Anche se il trattamento Hyaluronidase serve a rimuovere la maggior parte delle cellule peritubulari residue, poche cellule sopravviveranno il trattamento. La purezza delle cellule di Sertoli isolate è&gt; 95%, come può essere dimostrato da vimentina immunomarcatura (Figura 5B). Poiché le cellule peritubulari hanno un forte potenziale proliferativo, coltura cellulare Sertoli deve essere eseguita in assenza di siero. In presenza del 10% di siero PTC costituirebbero circa il 20% di tutte le cellule dopo 6 giorni di coltura mentre la sua frazione può essere previsto per essere inferiore all&#39;1% in assenza di siero 7. cellule di Sertoli Praticamente tutti gli isolati sono vitali come giudicato da Trypan blu colorazione (non mostrato). Intorno giorno 7 della cultura delle cellule di Sertoli isolate sono meno contaminati con le cellule germinali e le cellule peritubulari (Figura 4), ​​in modo che gli esperimenti devono essere eseguiti intorno a questo giorno, se possibile. Per una buona riproducibilità è importante ripetere esperimentos sempre lo stesso giorno di coltura. Se trasfezioni sono previsti devono essere eseguite il giorno 4 o 5, e gli estratti di cellule devono essere effettuate il giorno 5 o 6. Nel corso di almeno due settimane in condizioni di cellule del Sertoli senza siero sono sensibili alle FSH e produrre più androgeni-binding protein, attivatore del plasminogeno e transferrina in seguito al trattamento FSH. Per la cultura è più necessario uno strato di cellule di alimentazione peritubulari o siero. Dopo quattro settimane culture si deteriorano, e le cellule si staccano dal substrato 7. Il giorno 6 di coltura le cellule di Sertoli più hanno acquisito gocce lipidiche. Nella maggior parte delle cellule di un unico grande vacuolo è formato (Figura 5C e 5D). Il contenuto lipidico neutro può essere facilmente visualizzato con Oil Red O colorazione (Figura 4F). Oltre a Sertoli cel<html> ls i PTC rimossi possono essere coltivate e (Figura 4A e 4B). PTC da 10 testicoli cedere cinque palloni T75 che ci si può aspettare per formare uno strato confluente dopo 2 giorni di coltura. Come le cellule di Sertoli isolate PTC appena isolate sono contaminati da cellule germinali che possono essere in gran parte rimossi da passaging. Boccette sono divisi 1: 2 da tripsinizzazione standard in modo che 10 palloni saranno confluenti il ​​giorno 5 dopo l&#39;isolamento. La purezza del PTC isolati è&gt; 95% e può essere confermata utilizzando immunomarcatura actina del muscolo liscio α-(Figura 5A). Da questo giorno in poi PTC possono essere utilizzati per gli esperimenti. Un pallone è sufficiente per circa un 6-pozzetti e pozzi dovrebbero essere confluenti il ​​giorno successivo. Le celle possono essere diversi passaggi molte volte, ma gli esperimenti devono essere eseguiti sempre allo stesso passaggio per assicurarsi che le cellule si comportano in modo riproducibile. caricare / 53389 / 53389fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Morfologia del testicolo e flusso della procedura. (A) Un settore di un tubulo seminifero con tessuto interstiziale adiacente viene mostrato schematicamente. tubuli seminiferi sono racchiusi da una membrana basale (BM) e uno strato circonferenziale di cellule peritubulari myoid (PTC). L&#39;epitelio germinale si trova sul lato luminale della membrana basale. cellule del Sertoli (SC), che coprono l&#39;intero epitelio germinale sono fortemente attaccati alla BM e interconnessi tramite basolaterale posizionato svincoli otturatori che rappresentano la barriera emato-testicolare (BTB). Il loro nucleo irregolare (N) mostra una o più rientranze fessura-like e contiene un nucleolo. Le cellule germinali (GC) sono in contatto intimo con SCs in tutte le fasi del loro sviluppo. Il compartimento interstiziale tra i tubuli contiene cellule di Leydig (LC) e cellule immunitarie quali macrofagi (MΦ) e vasi sanguigni (BV). figuraadattato da Fijak e Meinhardt 28. (B) del flusso di lavoro della procedura; codifica dei colori è come in (A). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig2.jpg" /> Figura 2. I testicoli di ratti Wistar sono rimossi e decapsulated. (A) La cavità peritoneale è aperto attraverso una incisione longitudinale, come descritto nel testo. Un asterisco (*) indica il cuscinetto adiposo epidydimal. (B) I testicoli sono rimossi tagliando funicolo spermatico e (C) raccolti in una provetta conica da 50 ml contenente 20 ml di PBS. Quando tutti i testicoli sono stati raccolti vengono disinfettati in 20 ml di 1% (w / v) di iodio in etanolo. Per la rimozione dello iodio sono rapidamente lavate due volte con 25 mlPBS ciascuno. (D) I testicoli dopo primo lavaggio PBS. (E) I testicoli sono trasferiti ad una piastra di Petri (a destra), e tubuli seminiferi vengano espulsi tunica albuginea aperto mediante lame delle forbici chiuse (a sinistra), come descritto nel testo. (F) I testicoli decapsulate ancora formano una massa a forma di testicoli compatta con singoli tubuli sporgenti. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig3.jpg" /> Figura 3. Isolamento di cellule di Sertoli. (A) Dopo la rimozione delle cellule interstiziali di tripsina-DNase I digestione e lavaggio 9x con tubuli PBS mobilitarsi e aspetto pulito. (B) Durante il trattamento collagenasi-ialuronidasi-DNasi I peritubulari cellulares dalle cellule germinali e strato esterno vengono rilasciati. I tubuli vengono accorciate e ottenere un aspetto ruvido. (C) i frammenti tubolari dopo 4x di lavaggio con PBS. Trattamento stampa (D) Hyaluronidase-DNase I cellule peritubulari residue così come cellule germinali. Tubuli vengono ulteriormente ridotti, e aggregati tubulari formano. (E) tubolare aggregati dopo il lavaggio 4x con PBS. Cellule (F) Singolo Sertoli sono prodotti facendo passare gli aggregati 10x attraverso un ago 18G. Barre di scala a (AE) = 200 micron, a (F) = 50 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig4.jpg" /> Figura 4. coltura di cellule peritubulari (AB) e Sertoli cellule (CF) e la rimozione di contaminat<html> ing cellule germinali. (A) PTC risospese dal punto 4.5 sono state seminate immediatamente e fotografati il giorno successivo. (B) Dopo aver diviso il giorno 3 di contaminazione con le cellule germinali si riduce. (C) Il giorno 4 cellule di Sertoli mostrano un andamento tipico acciottolato-like. Galleggianti e aderenti cellule germinali sono visibili prima di lavare con PBS. (D) La stessa bene dopo il lavaggio 3x con PBS. Il numero di cellule germinali contaminanti è ridotta. Lavare tre volte con PBS si ripete il giorno 5 e 6. (E) Il giorno 6 della cultura sono stati rimossi praticamente tutte le cellule germinali. cellule di Sertoli hanno formato uno strato di cellule cercando unica, e la maggior parte delle cellule hanno acquisito un unico grande vacuolo. (F) Olio O colorazione rossa indica che questi vacuoli sono gocce lipidiche contenenti lipidi in gran parte neutrale. Barre di scala a (AD) = 200 micron, a (E) = 50 micron e in (F) = 25 micron..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig5.jpg" /> Figura 5. Immunofluorescenza. La colorazione delle cellule peritubulari primarie purificate con l&#39;actina (muscolo liscio) anticorpo (A) e di Sertoli cellule con l&#39;anticorpo vimentina (B). Non ci sono cellule contaminanti sono visibili entrambi i campi di vista. bar Scale in (A) e (B) = 10 micron. (C) e (D) Electron immagini microscopiche di cellule di Sertoli dopo 4 giorni di coltura. (C) Nota lo stretto contatto di celle adiacenti (frecce) che porta al modello ciottoli simile, come mostrato nella figura 4C. Una singola gocciolina lipidica (L) viene osservato nel citoplasma di ciascuna cella. (D) più abbondanti organelli sono i mitocondri (M) e l&#39;apparato di Golgi (G).Il nucleo (N) contiene un nucleolo (Nc) e mostra il tipico rientro fessura-like. Barra della scala in (C) = 1 micron e (D) = 0,25 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

pile Sertoli sono necessari per lo studio testicolo-immunitario privilegio, trasduzione del segnale durante l&#39;infiammazione o infezione, e l&#39;utilizzo delle loro proprietà immunoprotettivi. Qui si descrive un protocollo a base di enzimi per l&#39;isolamento delle cellule di Sertoli primaria altamente purificate e cellule peritubulari da testicoli di ratto.

Isolamento delle cellule di Sertoli e peritubulari cellule da Rat testicoli

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.3K Views.  Justus-Liebig-Universität Gießen.  pile Sertoli sono necessari per lo studio testicolo-immunitario privilegio, trasduzione del segnale durante l'infiammazione o infezione, e l'utilizzo delle loro proprietà immunoprotettivi. Qui si descrive un protocollo a base di enzimi per l'isolamento delle cellule di Sertoli primaria altamente purificate e cellule peritubulari da testicoli di ratto. 

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Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Isolamento di cellule della cavità peritoneale mouse

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall&#39;intestino mouse

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...