Los autores desean agradecer a Guido Verhoeven y Ludo Deboel, Lovaina, que eran extremadamente útil para establecer el aislamiento de las células de Sertoli primarias en el laboratorio Meinhardt en Giessen. Monika Fijak, Giessen, es reconocido por su ayuda en la figura 1A y asesoramiento. Los estudios fueron apoyados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través BH subvención 93 / 1-1 (SB) y la financiación de la Investigación de Graduados de la universidad de Giessen JLU Internacional (Alemania) / Universidad de Monash (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). El apoyo también se obtuvo de una subvención del Estado de Hessen, dentro del programa &quot;Landes-ofensivo zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) llamado &quot;männliche Infertilität bei Infektion y Entzündung&quot; (MIBIE).

1. Declaración de Ética Animal Los experimentos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Regierungspräsidium Giessen, Alemania, como la autoridad local y confirman a la Ley alemana de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines experimentales (Permiso. No: 20/23 GI Nr A 31 / 2012). 2. Preparación de los medios de comunicación, soluciones de enzimas y Animales <ol><li> Preparar 1% de alcohol de yodo mediante la disolución de 1 g de yodo en 100 ml de etanol. </li><li> Preparar 2x 500 ml de fosfato de Dulbecco solución salina tamponada (PBS) sin Ca2 + y Mg2 + suplementado cada uno con 7,5 ml de D-glucosa (100 g / L) y 5 ml 100x penicilina / estreptomicina solución madre (15 mg / ml D -glucosa, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina final). </li><li> Suplemento 1 x 500 ml Parque Memorial Instituto Roswell (RPMI) 1640 con 5 ml 100x penicilina / estreptomicina solución madre (50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina aletaAlabama). </li><li> Preparar una solución de tripsina-DNasa I (2,5 mg / ml de tripsina y 10 mg / ml de ADNasa I) mediante la adición de 25 mg de tripsina y 0,1 ml de DNasa I (1 mg / ml de ADNasa I) a 9,9 ml de PBS. </li><li> Disolver 50 mg de inhibidor de tripsina en 5 ml de PBS para la tripsina inhibidor de una solución (10 mg / ml). Disolver 25 mg de inhibidor de tripsina en 10 ml de PBS para solución de tripsina inhibidor B (2,5 mg / ml). </li><li> Para una solución de colagenasa-hialuronidasa-desoxirribonucleasa I (ADNasa I) disolver 10 mg de colagenasa A (1 mg / ml final), 10 mg de hialuronidasa (1 mg / ml final) y 0,1 ml de DNasa I (1 mg / ml de ADNasa I) ( 10 g / FINAL ml) en 10 ml de PBS. </li><li> Preparar una solución de hialuronidasa de DNasa I mediante la adición de 10 mg de hialuronidasa (1 mg / ml final) y 0,1 ml de solución de DNasa I (1 mg / ml) (10 mg / ml final) a 9,9 ml de PBS. </li><li> Ordenar ratas Wistar en el tiempo de manera que sean 19 días de edad el día del aislamiento de células de Sertoli. Nota: El protocolo descrito está diseñado para 10 ratas, pero puede ser modificado por un mínimo de 5 y un máximo de 20 ratas.Los volúmenes de todas las soluciones tienen que ajustarse en consecuencia. </li><li> Preparar Oil Red O solución madre disolviendo 0,35 g Oil Red O en 100 ml de isopropanol. Stir S / N, filtrar a través de 0,2 micras y se almacena a temperatura ambiente durante un máximo de un año. </li><li> Preparar la solución de tinción con Oil Red O mediante la mezcla de 6 ml Oil Red O solución madre con 4 ml de agua (3: 2). Después de 10 a 20 min a través de filtro de 0,2 micras. Usar dentro de los siguientes 2 horas. </li><li> Preparar un 4% (w / v) de solución de formaldehído en una campana ventilada mediante la adición de 4 g de polvo de paraformaldehído (PFA) a 80 ml de 1x PBS mientras se agitaba suavemente. Calentar a ~ 60 ° C, añadir 1 ml de NaOH 1 M y continuar revolviendo hasta que se disuelva el paraformaldehído. Deje que la solución se enfríe hasta la temperatura ambiente, ajustar el pH a 7,4 con HCl 1 M y el volumen a 100 ml con PBS 1x. Filtrar la solución (0,45 m) y utilizar fresca o almacenar en alícuotas a -20 ° C durante varios meses. Nota: polimerizado formaldehído (PFA) depolymerizes al formaldehído monómero en agua. Este proceso escatalizada por calentamiento moderado y un pH ligeramente alcalino. Preparar todas las soluciones de enzima recién y esterilizar por filtración (0,2 M) en el día de uso. Si un fabricante diferente para una enzima (véase Materiales / Equipos de la tabla) se utiliza, ajustar cuidadosamente su concentración / actividad. En el siguiente protocolo un &quot;pipeta&quot; se refiere a una pipeta serológica. </li></ol> 3. Preparación de los túbulos seminíferos <ol><li> Anestesie 10 ratas Wistar macho de uno en uno en un desecador usando CO 2 y una velocidad de flujo que desplaza al menos 20% del volumen de la cámara por minuto. Espere hasta que la respiración se detiene, la anestesia prueba apretando una almohadilla de la pata, y si no hay reacción eutanasia a cada rata por dislocación cervical. Drenar la sangre seccionando la vena yugular y la arteria carótida (carotica vagina) con agua corriente. Desinfectar el abdomen frotando con un 70% de etanol. </li><li> Utilizando unas pinzas levantar la piel de la mus abdominalculos y recorten un lóbulo de la piel de forma ovalada que se extiende desde la sínfisis del pubis hasta el esternón (Figura 2A) y la solapa hacia arriba sobre el pecho. A continuación, apoderarse de los músculos abdominales y hacer una incisión medial de la sínfisis del pubis hasta el esternón. <ol><li> Aprieta el abdomen con los pulgares de la pelvis hacia arriba con el fin de empujar los testículos fuera de la pelvis inferior. Recoger la almohadilla de grasa del epidídimo (Figura 2B) con unas pinzas para tirar del testículo más. Cortar el cordón espermático (Figura 2B), dejando la túnica albugínea intacta, y recoger todos los testículos en 20 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml (Figura 2C). </li></ol></li><li> Después de recoger todos los testículos, desinfectarlos mediante la adición de un volumen igual (20 ml) de 1% de yodo en etanol (v / w). Invierta el tubo dos veces y se decanta el sobrenadante inmediatamente. Lavar rápidamente los testículos dos veces con 25 ml de PBS cada uno (Figura 2D). </li><li> La transferencia de los testículos para una placa de Petri contieneing 15 ml de PBS (Figura 2E). Sujete firmemente cada testículo por una pinza en un extremo, hacer una pequeña incisión en la túnica albugínea en el extremo opuesto, y exprimir los túbulos utilizando hojas de las tijeras cerradas como una herramienta de raspado. Nota: Los túbulos todavía deben formar un haz compacto en forma de testículo-con sólo unos pocos túbulos que se extiende en la solución con el fin de permitir la digestión enzimática homogénea (Figura 2F). </li><li> La transferencia de los testículos de-encapsulada a una botella de 100 ml con tapón de rosca que contiene 10 ml de solución de tripsina-DNasa I. Realizar la digestión en un baño de agua con agitación a 32 ° C (120 oscilaciones / min). Después de 4 minutos evalúan los túbulos con el ojo desnudo para la dispersión de los túbulos. Una vez túbulos comienzan a dispersarse en la solución, detener la digestión inmediatamente. Si es necesario, continuar la incubación durante hasta 2 min. </li><li> Deja de digestión con tripsina mediante la adición de 5 ml de solución de inhibidor de tripsina A. Mezclar la solución con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 vezs utilizando una pipeta de 10 ml y la transfiere a un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Después de 5 min de incubación observan los túbulos se asientan por unidad de gravedad, retirar con cuidado el sobrenadante mediante el uso de la pipeta 10 ml de la etapa 3.6 y añadir 10 ml de solución de inhibidor de tripsina de B con el fin de detener completamente la digestión con tripsina. Resuspender los túbulos pipeteando arriba y abajo 2-3 veces. </li><li> Con el fin de eliminar la contaminación de células intersticiales lavan los túbulos 9 veces con 25 ml de PBS cada una. Resuspender túbulos en cada lavado utilizando una pipeta de 25 ml y dejar que se asienten por unidad de gravedad durante 10 minutos. Siempre use la misma pipeta 25 ml para pipetear PBS, la resuspensión y eliminación del sobrenadante. </li></ol> 4. Remoción / Aislamiento de células peritubulares (PTC) <ol><li> Transferir todos los túbulos a una botella con tapón de rosca de 100 ml y añadir la solución de colagenasa-hialuronidasa-DNasa I (Figura 3A). Realizar la digestión de 10 min en un baño de agua con agitación a 32 ° C (120 oscilaciones / min). </li><li> Pipetear una gota de la suspensión en un portaobjetos de vidrio y comprobar rápidamente los túbulos bajo un microscopio de luz invertida para el cultivo celular de rutina a un aumento de 100x. Si la digestión no es lo suficientemente avanzada continuar la incubación durante 2 minutos adicionales (no cuente el tiempo necesario para la verificación microscópica). Nota: Durante este paso todos los túbulos quedan acortados en longitud y túbulo bordes deben llegar a ser áspero (Figura 3B y C). Los bordes ásperos son indicativos para la liberación de células peritubulares. </li><li> Transferir la suspensión con los túbulos digeridos a un tubo cónico de 50 ml usando la pipeta 25 ml de la etapa 3.8. Se lava la botella de 100 ml con 10 ml de PBS y añadirlo a los túbulos en el tubo cónico. Permitir que los túbulos digeridos se asienten por gravedad unidad durante 10 min, y con cuidado aspirar el sobrenadante, que contiene los PTCs, usando la pipeta 25 ml de nuevo, y la transfiere a un nuevo tubo cónico. Para la aspiración de los últimos mililitros utilizar una pipeta de 5 ml en el ordeR Para evitar cualquier arrastre de los túbulos. </li><li> Añadir 20 ml de medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS) a los sobrenadantes recogidos de los túbulos, mezclar y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA sin usar la pausa. </li><li> decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender los PTCs sedimentadas en 20 ml de RPMI 1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y las semillas 4 ml cada uno en cinco matraces T75 que contienen 16 ml de medio cada uno. Se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 (Figura 4A). </li><li> En el 3er día de la cultura trypsinize los PTC y los dividieron 1: 2 en matraces T75 que contenían 16 ml de medio RPMI 1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% cada uno (rendimiento 10 frascos por completo) (Figura 4B). Continuar la incubación a 37 ° C en 5% de CO2. </li><li> En el 5º día de cultivo trypsinize los PTCs una y otra placa ellas en placas de 6 pocillos o de 24 pocillos, dependiendo del experimento(Un frasco T75 por placa). Los experimentos se pueden realizar en el día 6. </li></ol> 5. Aislamiento de células de Sertoli (SCS) <ol><li> Volver a suspender los túbulos asentado desde el paso 4.3 a fondo en 25 ml de PBS utilizando una pipeta de 25 ml y dejar que se asienten por unidad de gravedad durante 12 minutos. Utilice la misma pipeta de 25 ml de PBS para el pipeteado, la resuspensión de los túbulos y la eliminación de los sobrenadantes. Repita el lavado 3 veces (4 lavados en total). </li><li> Después del último lavado transferir los túbulos digeridos con otros 100 ml frasco que contiene la solución de hialuronidasa-DNasa I-tapón de rosca. Realizar la digestión en un baño de agua con agitación a 32 ° C (120 oscilaciones / min). </li><li> Después de 5 min comprobar los túbulos de nuevo mediante inspección al microscopio óptico con un aumento de 100X como se describe en el paso 4.2. Nota: Los túbulos cortos, agregados tubulares y células liberadas deben ser visibles (Figura 3D). <ol><li> Permitir que los agregados tubulares se asientan durante 10 minutos, y aspirar el sobrenadante nosotrosing una pipeta de 25 ml. Lavar los agregados de 4 veces utilizando 25 ml de PBS y un tiempo de sedimentación de 10 min para cada etapa de lavado (Figura 3E). </li></ol></li><li> Añadir 20 ml de medio RPMI 1640 y pasar la suspensión 10 veces a través de una aguja de 18 G montado en una jeringa de 20 ml. Evitar las burbujas de aire. Nota: Al tirar de la suspensión de entrada y salida a través de la aguja se considera como una sola pasada. La interrupción y la homogeneización de las células por cizallamiento hidrodinámico es una técnica estándar en la preparación de células que tienden a agregarse. El paso de células a través de una aguja hipodérmica de pequeña diámetro interior es poco probable que tenga un impacto en sus propiedades funcionales 25. La figura 5C y D muestra la ultraestructura normal de las células de Sertoli purificó en día 4 de cultivo. <ol><li> Pipetear una gota de la suspensión en un portaobjetos de cristal y controlar los túbulos bajo un microscopio de luz invertida para el cultivo celular de rutina a un aumento de 10X si el agg rápidamenteregates están dispersas (Figura 3F). Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micras con el fin de obtener una suspensión de células individuales puro en el filtrado. </li></ol></li><li> Se centrifuga el filtrado de paso de 5,4 a 200 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente sin necesidad de utilizar la pausa. aspirar con cuidado el sobrenadante utilizando una pipeta de 25 ml, y resuspender las células de Sertoli en 40 ml de medio RPMI 1640 (sin suero). </li><li> Mezclar 100 l de suspensión celular con 100 l de azul de tripano de maquillaje y contar las células con una cámara de Neubauer mejorada. Ajustar la concentración de células a 3 x 10 6 células / ml de acuerdo con el resultado del recuento. Semilla de 1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos (= día 1). Si se planea una tinción con Oil Red O (paso 6) poner una hoja de cubierta en uno o unos pocos pozos antes de la siembra de células de Sertoli. Nota: las células de Sertoli en suspensión se depositan rápidamente de modo que el tubo se debe agitar brevemente cada vez antes de una parte alícuota de células se toma con la pipeta. Hasta el día 4 que firmemente attACH al sustrato. </li><li> Con el fin de eliminar las células germinales que flotan o adherentes en el día 4 (Figura 4C) lavar cada pocillo de las placas de 6 pocillos utilizados para el recubrimiento de las células de Sertoli aisladas (paso 5.6) con PBS (Figura 4D). Aspirar el medio, añadir 1-2 ml de PBS a cada pocillo y agitar las placas de 6 pocillos horizontalmente sobre una mesa con vigor, pero sin derramar PBS. Repita el lavado 3 veces y llevar a cabo el mismo procedimiento de lavado en el día 5 y 6 (Figura 4E). Nota: En el día 4 células de Sertoli se hayan fijado firmemente y mostrar un adoquín como patrón bajo el microscopio de luz invertida (Figura 4C). Los experimentos se pueden realizar desde el día 7 en adelante. <ol><li> (Alternativa para el paso 5.7) Para la eliminación de las células germinales flotante y adherentes realizan un choque hipotónico 3 días después de la siembra en placas de 6 pocillos. Retirar el medio y añadir 1 ml de 20 mM Tris pH 7,5 tomadas directamente de la nevera. Aspirar el tampón Tris después de 90 a 120 seg pero noluego. Lavar las células dos veces con PBS, y añadir 2 ml de medio RPMI 1640 (sin suero). Opcionalmente, realizar experimentos al día siguiente. Nota: La mayor es la duración del choque hipotónico es las células germinales más se pueden eliminar pero los más células de Sertoli se perdió también. El primero de lavado PBS se debe realizar rápidamente, pero con cuidado a fin de no desplazar las células de Sertoli. Directamente después de tratamiento hipotónico numerosas vacuolas de diferentes tamaños pueden ser observados en el citoplasma por microscopía de contraste de fase. Vacuolas desaparecen a las pocas horas después del tratamiento hipotónico. </li></ol></li></ol> 6. Oil Red O tinción <ol><li> Realizar todos los pasos a TA. En el día 7 de células de Sertoli de lavado cultivan en una hoja de cubierta (paso 5.6) con PBS dos veces y fijarlas con formalina al 10% en PBS. Después de 10 min reemplazar formalina con solución fresca, y continuar la fijación durante otros 60 min. Nota: Todas las soluciones se añaden a la bien (s) con una hoja de cubierta y aspiraron antes del siguiente paso. </li&gt; <li> Aspirar formalina, lavar las células con agua dos veces y añadir un 60% de isopropanol. Después de 5 min permitir que las células se sequen al aire durante unos minutos. </li><li> Añadir 1 ml Oil Red O tinción solución por pocillo y se incuba durante 10 min. Aspirar la solución, y lavar las células inmediatamente 4 veces con agua y montar la cubierta se desliza en glicerol-PBS (9: 1). Tomar imágenes de campo claro con un microscopio óptico de rutina (Figura 4F). </li></ol> 7. La tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Lavar PTCs (del paso 4.5) o células de Sertoli (del paso 5,5) cultivadas en un cubreobjetos con PBS dos veces y fijarlas con 4% PFA durante 10 min a RT. </li><li> Incubar con 5% de BSA en PBS durante 1 hora a RT. Desechar la solución de BSA-PBS y añadir nueva solución de BSA-PBS que contiene actina (músculo liso) (para los PTC) o vimentina (para células de Sertoli) anticuerpo primario (dilución 1: 100 para ambos anticuerpos) y se incuba a 4 ° CO / N. Nota: La incubación con BSA bloques de la unión no específica del anticuerpo primario. </li><li> la cubierta se desliza Wash 3 veces durante 5 minutos en PBS-0,1% de Tween 20 y se incuba con un tinte verde fluorescente conjugado de cabra anti-ratón anticuerpo secundario (dilución 1: 1000) a TA durante 1 h en la oscuridad. </li><li> la cubierta se desliza Wash 3 veces durante 5 minutos en PBS-0,1% de Tween 20 y montarlos en DAPI medio de montaje. </li></ol> 8. Análisis ultraestructural <ol><li> Lavar las células de Sertoli (del paso 5,6) cultivadas en una placa de cultivo celular de 6 cm con PBS y fijarlos durante 2 horas a 4 ° C en una mezcla de 2,5% de glutaraldehído, 2,5% de paraformaldehído y ácido pícrico al 0,05% en tampón de cacodilato 67 mM ( pH 7,4) de acuerdo con Ito y Karnovsky 26. </li><li> Realizar post-fijación en tetróxido de osmio al 1% seguido de un / N incubación O en acetato de uranilo al 0,3% disuelto en 50 mM de tampón de maleato (pH 5). muestras incrustar en la incorporación de los medios de comunicación de acuerdo con procedimientos estándar. Los cortes de secciones delgadas, contrastarlas con citrato de plomo y examinar con un microscopio electrónico. </li></ol>

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L., Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+in+vitro+the+phagocytic+function+of+Sertoli+cells+in+the+rat.">Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat.</a> Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).</li><li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+the+importance+of+being+eaten.">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).</li><li>Ducray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+mouse+Sertoli+cell+line+producing+rat+androgen-binding+protein+(ABP).">Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP).</a> Steroids. 63, 285-287 (1998).</li><li>Konrad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Sertoli+cells+express+epithelial+but+also+mesenchymal+genes+after+immortalization+with+SV40.">Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, when Sertoli cells are isolated using the procedure described here they get deprived of their intimate contacts to neighboring PTCs and spermatogenic cells. Nevertheless they appear to retain many properties that are characteristic for them in vivo like hormone responsiveness and expression of marker genes although in a time-dependent manner and on a lower level. 
Primary Sertoli cells develop large neutral lipid droplets after six days of culture. One of the vital functions of Sertoli cells is phagocytosis of degenerating and apoptotic germ cells and of germ cell material like the so called residual bodies29. It is known that residual bodies and cytoplasts from elongated spermatids adhere to isolated Sertoli cells and get phagocytosed30. As it is impossible to remove all germ cells during the isolation procedure we therefore hypothesize that contaminating germ cells can also adhere to Sertoli cells after plating and get phagocytosed. Since residual bodies contain small lipid droplets it is easily conceivable that Sertoli cells acquire large lipid droplets after extensive phagocytosis of adhering and damaged germ cells. There is also evidence that phagocytotic clearance of apoptic cells actively downregulates inflammatory and immune responses31 which could be important for establishing and maintaining the testis as an immune priviliged organ.
When isolated Sertoli cells are plated on top of a layer of primary peritubular cells both cell types survive longer and do form a basal lamina between them. Morphologically they are able to form structures reminiscent of seminiferous tubules indicating that both cell types have retained their capacity to properly interact7. Like freshly isolated primary Sertoli cells the frequently used mouse Sertoli cell line TM4 does respond to FSH with increased production of cAMP18, but contrary to primary cells it is not able to produce androgen binding protein32. Moreover it has been shown that the mouse Sertoli cell line 1 lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells12. 
Similarly the rat Sertoli cell line SCIT-C8 expresses the epithelial markers transferrin, clusterin and stem cell factor but has lost androgen receptor expression and androgen responsiveness whereas it has aquired expression of some mesenchymal markers like fibronectin and entactin-133. Therefore, primary Sertoli cells, although expensive and tedious to isolate, appear to retain significantly more qualitative in vivo properties during cell culture than cell lines do. 
Future applications of primary Sertoli cells will focus on immuno-protection of co-cultured or co-transplanted cells, on experiments studying cell-cell interactions, and on investigating the immune privilege of testis.

Testículos producen gametos masculinos y hormonas sexuales, es decir, los andrógenos. El órgano se compone de dos compartimientos. En el compartimiento intersticial, que representa alrededor del 10-12% del volumen total de testículo 1, la esteroidogénesis se lleva a cabo dentro de las células de Leydig. El compartimento tubular representa aproximadamente el 60-80% del volumen testicular 1 y contiene células germinales y dos tipos de células somáticas - células peritubulares y células de Sertoli. El testículo está dividido por tabiques de tejido conectivo en 250-300 lóbulos, cada uno con 1-3 túbulos seminíferos intrincadas. Estos túbulos están rodeados por una membrana basal, una hoja de colágeno, y una capa circunferencial de células peritubulares (Figura 1A). El epitelio germinal se encuentra en el lado luminal de la membrana basal. células de Sertoli son grandes células alargadas que se extienden a todo el epitelio germinal desde la membrana basal al lumen. Son muy attdolía a la membrana basal y formar una lámina celular continua a través de las uniones estrechas organizados basolateral que ocluye el epitelio germinal del intersticio y representa la barrera sangre-testículo. Las células de Sertoli tienen proyecciones citoplasmáticas prominentes y ramificaciones que les permiten entrar en contacto morfológica y funcional apretado con un número específico de especie pero constante de células germinales. Las células madre germinales diploides proliferan y se diferencian en espermatogonias. Durante la meiosis I de corta duración espermatocitos tetraploides son generados que se desarrollan a su vez en cuatro espermátidas haploides durante la meiosis II. Todas las células germinales están interconectadas por puentes citoplasmáticos de manera que formen una red celular. El evento principal durante la maduración de las espermátidas es la extrusión de grandes partes del citoplasma, formando cuerpos residuales, en un proceso llamado espermiogénesis. cuerpos residuales son fagocitados por las células de Sertoli. espermátidas tardías son luego liberados enla luz tubular y transportados en el epidídimo para su posterior maduración. las células de Sertoli y las células germinales aparecen para coordinar mutuamente espermatogénesis topográficamente y funcionalmente. Preparación de tipos de células testiculares individuales comenzó hace casi un siglo, cuando pequeñas piezas testiculares fueron cultivadas y tipos de células identificados por microscopía 2. Mediante una cuidadosa disección de los túbulos después de la apertura de la túnica albugínea con unas pinzas de punta fina que era más tarde posible separar tubular y compartimentos intersticiales 3. En 1975 Welsh y Wiebe introdujo un tratamiento con colagenasa con el fin de liberar a los túbulos se adhiera tejido intersticial y un tratamiento de pancreatina para la eliminación de la capa de células peritubular exterior 4. Desde el principio ratas inmaduras jóvenes (alrededor de 20 días de edad) habían sido utilizados en el que las células de Sertoli comprenden una gran parte de la población de células tubulares debido a la espermatogénesis no ha comenzado aún. A esta edad Sert ratacélulas oli dejan de dividirse, y uniones estrechas entre las células vecinas de modo que forman la barrera sangre-testículo se establece 5. Independiente de Gales y Wiebe Dorrington et al. Introduce una combinación de tripsina y desoxirribonucleasa seguido de inhibidor de tripsina y soybeen tratamiento con colagenasa que fue publicado en el mismo año 6. Ambos grupos también utilizan la fuerza mecánica (dibujo los fragmentos digeridos tubulares repetidamente a través de una aguja de jeringa o una pipeta Pasteur, respectivamente) con el fin de producir una suspensión celular homogénea para el chapado que contiene las células de Sertoli de aproximadamente 70%. Después de 3 días en cultivo, utilizando un medio que está libre de suero, el porcentaje de células de Sertoli aumenta a aproximadamente el 90%. Esto podría atribuirse en gran parte a la muerte de contaminación de las células germinales. células peritubulares residuales (PTCs), sin embargo, se mantienen firmemente unidos a través de su matriz extracelular. PTCs, pero no las células de Sertoli, son conocidos por producirfibronectina que puede servir como una proteína marcadora para la estimación de la contaminación con PTCs. Por lo tanto, Tung et al. razonó que un tratamiento adicional hialuronidasa puede mejorar la pureza de la fracción de células de Sertoli 7. De hecho podían muestran que un tratamiento adicional fue capaz de reducir la contaminación por los PTC aproximadamente 20 veces, lo que se hace particularmente evidente cuando en comparación un medio que contiene suero se utiliza para el cultivo de células de Sertoli purificados. A partir de entonces el procedimiento mejorado de Tung et al. se convirtió en el protocolo vigente y fue utilizado ampliamente por otros grupos importantes en el campo 8 (Figura 1B). Durante el tratamiento de colagenasa la mayoría de los PTCs se liberan y se puede aislar en paralelo a las células de Sertoli. Mientras que los PTCs proliferan enérgicamente y no responden a la hormona estimulante del folículo (FSH), las células de Sertoli no sufren mitosis más y responden a la FSH por los cambios morfológicos característicosy un aumento de la adenosina monofosfato cíclico (cAMP) concentración 9. Protocolos de digestión enzimática muy similar se pueden utilizar para el aislamiento de células de Sertoli primarios de otros animales como el hombre 10, ratón 11,12, hámster siberiano 13 o yak 14. Para la eliminación de grandes cantidades de contaminación de las células germinales de un choque hipotónico pueden emplearse en el extremo del procedimiento de aislamiento 15. Esto permite también el aislamiento eficiente de células de Sertoli del testículo de rata adulta 16. Una suspensión de células de Sertoli enriquecido también puede ser separado de las células germinales en placas la suspensión en placas revestidas con lectina aglutinina de Datura stramonium 17. Sólo las células de Sertoli y algunas PTCs residuales se adhieren a las placas de lectina. cultivos de células primarias de Sertoli, principalmente de la rata, se han utilizado inicialmente para la investigación de la capacidad de respuesta a las hormonas o el establecimiento de líneas celulares como el li celular de ratón Sertoline TM4 18. Esta línea celular se ha investigado en más de un centenar de estudios hasta la actualidad. En un enfoque de traslación se han utilizado las células de Sertoli para inmuno-protección de las células y tejidos, como en la co-trasplante de islotes pancreáticos xeno o alogénicos para la supervivencia del injerto a largo plazo co-cultivadas sin inmunosupresión sistémica 19. Las células de Sertoli aisladas también se han utilizado en los experimentos de co-cultivo para el estudio de epitelio-mesenquimal (células de Sertoli - PTCC) y de células somáticas de gérmenes (células de Sertoli - células germinales) las interacciones 20, 21. Se han empleado células de Sertoli Recientemente primarias para la investigación de la expresión de receptores de tipo Toll y la secreción de citocinas proinflamatorias, así como las cascadas de transducción de señales que conduce a la expresión de citoquinas después de la infección con E. no patógeno y uropathogenic coli 22. Otras investigaciones recientes estaban usando células de Sertoli para estudiar testicular p inmunerivilege 23 y demostró que la testosterona pre-tratamiento suprime la respuesta inflamatoria inducida por LPS-24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:289px;">Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4</td>
			<td style="width:111px;">Dako</td>
			<td style="width:124px;">M0851</td>
			<td style="width:289px;">Monoclonal mouse anti human antibody. 
			Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Albumin bovine fraction V 
			Standard grade, lyophilized</td>
			<td style="width:111px;">Serva</td>
			<td style="width:124px;">11930.04</td>
			<td style="width:289px;">Filter (0.45 &#181;m) BSA solutions used for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Corning&#8482; Cell Strainers 70&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">431751</td>
			<td>White color</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Collagenase A from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">DAPI mountant ProLong&#174; Gold Antifade</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:124px;">P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">D-glucose</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">G8644</td>
			<td>100 g/l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Dulbecco&#180;s PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">DNase I</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Electron microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td>EM 109S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:124px;">Axioplan 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Hyaluronidase from bovine testis</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:111px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">CKX41</td>
			<td>Routine cell culture microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal 
			secondary Antibody&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:124px;">A-10684</td>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">O0625</td>
			<td style="width:289px;">Has replaced Sudan III and Sudan IV 
			because of brighter color.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">P6148</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Penicillin (5,000&#160;U/ml)/ 
			Streptomycin (5,000 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15070-063</td>
			<td>100x solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">21875-034</td>
			<td>Contains 300 mg/L L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">T5266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:289px;">Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">T6522</td>
			<td style="width:289px;">The Sigma product is considerably cheaper than the previously used 
			BPTI (Aprotinin) from Roche.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:289px;">Vimentin antibody (V9)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">V6630</td>
			<td style="width:289px;">Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.&#160; Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Wistar WU rats</td>
			<td style="width:111px;">Charles River</td>
			<td style="width:124px;">N/A</td>
			<td>Should be 19 days old on day of experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of sertoli cells and peritubular cells from rat testes

El testículo, y en particular el gameto masculino, desafía al sistema inmunológico de una manera única porque los espermatozoides diferenciados aparecen por primera vez en el momento de la pubertad - más de diez años después del establecimiento de la tolerancia inmune sistémica. espermatogénica células expresan una serie de proteínas que pueden ser vistos como no propio por el sistema inmune. El testículo debe entonces ser capaz de establecer tolerancia a estos neo-antígenos, por un lado, pero aún ser capaz de protegerse de infecciones y el desarrollo de tumores en el otro lado. Por lo tanto el testículo es uno de los pocos sitios privilegiados inmune en el cuerpo que toleran los antígenos extraños sin evocar una respuesta inmune inflamatoria perjudicial. células de Sertoli desempeñan un papel clave para el mantenimiento de este entorno privilegiado inmunitario de los testículos y también prolongan la supervivencia de las células cotransplanted en un entorno exterior. Por lo tanto, las células de Sertoli primarias son una herramienta importante para el estudio del privilegio inmune de los testículos que no puede ser correoasily reemplazado por líneas celulares establecidas o otros modelos celulares. Aquí se presenta un protocolo detallado y completo para el aislamiento de las células de Sertoli y las células peritubulares - si se desea - a partir de testículos de ratas dentro de un solo día.

El procedimiento descrito permite el aislamiento de aproximadamente 12 x 10 7 células de Sertoli de 10 testículos de ratas. 3 x 10 6 células se colocan por pocillo en una placa de 6 pocillos de manera que entre seis y siete placas de 6 pocillos están disponibles para los experimentos en el día 7. La digestión con tripsina-DNasa I es el paso más crítico durante el aislamiento de células de Sertoli. Si la digestión en este punto está avanzando demasiado lejos, la proporción de células germinales / células de Sertoli será desproporcionadamente aumentar hasta el final. Durante los días 3-6 de la cultura es importante lavar cuidadosamente a medida que muchos no adherente o ligeramente unidas las células germinales como sea posible. Como alternativa a extensos lavados más de 4 días las células germinales pueden ser eliminados por tratamiento hipotónico en días 3 27. Una ventaja de este método es que el tiempo de cultivo de células de Sertoli se mantiene a un mínimo de modo que las funciones específicas de las células de Sertoli son potencialmente mejor retenido que después de un período prolongado de cultivo. <p clculo = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; A pesar de que el tratamiento con hialuronidasa sirve para eliminar la mayoría de las células peritubulares residuales, unas pocas células sobrevivirán el tratamiento. La pureza de las células de Sertoli aisladas es&gt; 95% como se puede demostrar por la vimentina immunolabeling (Figura 5B). Dado que las células peritubulares tienen un gran potencial proliferativo, cultivo de células de Sertoli tiene que ser realizado en ausencia de suero. En presencia de 10% de suero PTCs constituirían aproximadamente 20% de todas las células después de 6 días de cultivo mientras que su fracción se puede esperar que estar por debajo de 1% en ausencia de suero 7. células de Sertoli Virtualmente todos los aislados son viables como se juzga por tinción con azul tripán (no mostrados). Alrededor del día 7 de cultivo, las células de Sertoli aisladas son menos contaminados con células germinales y las células peritubulares (Figura 4), ​​por lo que los experimentos deben realizarse en torno a este día si es posible. Para una buena reproducibilidad es importante repetir experimentoSiempre es el mismo día de la cultura. Si se planifican transfecciones que deben llevarse a cabo en el día 4 o 5, y los extractos celulares se deben hacer en el día 5 o 6. Durante al menos dos semanas en las células de Sertoli condiciones libres de suero son sensibles a la FSH y producir más proteína de unión de andrógenos, activador del plasminógeno y transferrina al tratamiento con FSH. Para el cultivo ya se requiere una capa de alimentación de células peritubulares o suero. Después de cuatro semanas culturas se deterioran, y las células se desprenden del sustrato 7. En el día 6 de cultivo de células de Sertoli más han adquirido las gotas de lípidos. En la mayoría de las células una sola gran vacuola ha formado (Figura 5C y 5D). El contenido de lípidos neutros puede ser fácilmente visualizado por tinción con Oil Red O (Figura 4F). Además de Sertoli cel<html> ls los PTCs eliminados se pueden cultivar también (Figura 4A y 4B). PTCs de 10 testículos dió cinco matraces T75 que se pueden esperar para formar una capa confluente después de 2 días de cultivo. Como las células de Sertoli aisladas PTCs recién aisladas están contaminados por células germinales que se pueden eliminar en gran medida por pases. Los matraces se dividieron 1: 2 por tripsinización estándar de modo que 10 frascos serán confluentes en el día 5 después del aislamiento. La pureza de los PTC aisladas es&gt; 95% y se puede confirmar mediante inmunomarcaje actina de músculo liso α-(Figura 5A). A partir de este día en adelante PTC se pueden utilizar para los experimentos. Un matraz es suficiente para una placa de 6 pocillos, aproximadamente, y los pocillos se debe confluente el día siguiente. Las células pueden ser pasados ​​muchas veces, pero los experimentos deben realizarse siempre en el mismo paso a fin de asegurarse de que las células se comportan de una manera reproducible. cargar / 53389 / 53389fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Morfología de los testículos y el flujo de trabajo del procedimiento. (A) Un sector de un túbulo seminífero con el tejido intersticial adyacente se muestra esquemáticamente. túbulos seminíferos están rodeados por una membrana basal (BM) y una capa circunferencial de células peritubulares mioides (PTC). El epitelio germinal se encuentra en el lado luminal de la membrana basal. células de Sertoli (SC), que cubre todo el epitelio germinal están fuertemente unidos a la BM y interconectados a través de basolateral posicionado uniones de oclusión que representan la barrera sangre-testículo (BTB). Su núcleo irregular (N) muestra una o más muescas fisuras similar y contiene un nucléolo. Las células germinales (GC) están en contacto íntimo con los SC en todas las etapas de su desarrollo. El compartimiento intersticial entre los túbulos contiene células de Leydig (LC) y las células inmunes, tales como macrófagos (MΦ), así como los vasos sanguíneos (BV). Figuraadaptado de Fijak y Meinhardt 28. (B) de flujo de trabajo del procedimiento; código de colores es como en (A). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig2.jpg" /> Figura 2. Los testículos de ratas Wistar se escinden y decapsulated. (A) La cavidad peritoneal se abre a través de una incisión longitudinal como se describe en el texto. Un asterisco (*) indica la almohadilla de grasa epidydimal. (B) Los testículos son eliminados mediante el corte del cordón espermático y (C) recogida en un tubo cónico de 50 ml que contiene 20 ml de PBS. Cuando todos los testículos se han recogido que se desinfectan en 20 ml de 1% (w / v) de yodo en etanol. Para la eliminación del yodo que desaparecen rápidamente dos veces con 25 mlPBS cada una. (D) Los testículos después del primer lavado PBS. (E) Los testículos son transferidos a una placa de Petri (a la derecha), y los túbulos seminíferos se aprietan hacia fuera de la túnica albugínea abierto por medio de cuchillas de la tijera cerradas (a la izquierda) como se describe en el texto. (F) Los testículos Decapsulated todavía forman una masa en forma de testículo-compacto con túbulos individuales que sobresale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig3.jpg" /> Figura 3. Aislamiento de células de Sertoli. (A) Después de la eliminación de las células intersticiales por la tripsina de DNasa I 9x de digestión y el lavado con PBS túbulos convertirse movilizada y un aspecto limpio. (B) durante el tratamiento de colagenasa-hialuronidasa de DNasa I peritubular células de las células de la capa germinal externa y se liberan. Los túbulos quedan acortados y obtener un aspecto rugoso. (C) fragmentos tubulares Después de lavar 4 veces con PBS. Comunicados de tratamiento (D) hialuronidasa de DNasa I células peritubulares residuales, así como células germinales. Túbulos consiguen acortar aún más, y forman agregados tubulares. (E) tubular agregados después de lavar 4 veces con PBS. Células (F) Individual de Sertoli se producen haciendo pasar los agregados 10x través de una aguja 18G. Las barras de escala en (AE) = 200 m, en (F) = 50 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig4.jpg" /> Figura 4. Cultivo de células peritubulares (AB) y células de Sertoli (CF) y la eliminación de contaminat<html> ing células germinales. (A) PTCs resuspendidas de la etapa 4.5 se sembraron inmediatamente y se fotografiaron el día siguiente. (B) Después de dividir el día 3 contaminación con células germinales se reduce. (C) En el día 4 células de Sertoli muestran un patrón típico de adoquines similar. Flotantes y se adhieren las células germinales son visibles antes de lavar con PBS. (D) El mismo pozo después de lavar 3 veces con PBS. El número de células germinales contaminantes se reduce. Lavar tres veces con PBS se repite en días 5 y 6. (E) En el día 6 de cultivo se han eliminado prácticamente todas las células germinales. Las células de Sertoli han formado una capa de células de mirada única, y la mayoría de las células han adquirido una única vacuola grande. (F) Aceite O tinción roja muestra que estas vacuolas son las gotas de lípidos que contienen lípidos neutros en gran medida. Las barras de escala en (AD) = 200 m, en (E) = 50 micras y en (F) = 25 micras..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="La Figura 5" src="/files/ftp_upload/53389/53389fig5.jpg" /> Figura 5. La tinción de inmunofluorescencia. La tinción de las células peritubulares primarias purificadas con la actina (músculo liso) anticuerpo (A) y de Sertoli células con anticuerpo vimentina (B). No hay células contaminantes son visibles en ambos campos de visión. La barra de escala en (A) y (B) = 10 micras. (C) y (D) de microscopía electrónica imágenes de células de Sertoli después de 4 días en cultivo. (C) Nota el estrecho contacto de las células adyacentes (puntas de flecha) que conduce al patrón de adoquines similar como se ve en la Figura 4C. Una gotita de lípidos única (L) se observa en el citoplasma de cada célula. (D) orgánulos más abundantes son las mitocondrias (M) y el aparato de Golgi (G).El núcleo (N) contiene un nucléolo (Nc) y muestra la típica sangría fisura similar. La barra de escala en (C) = 1 micras y en (D) = 0,25 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53389/53389fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Se requieren células de Sertoli primaria para el estudio de testículo-inmune privilegio, la transducción de señales durante la inflamación o infección, y la utilización de sus propiedades inmunoprotectivos. Aquí se describe un protocolo basado en enzima para el aislamiento de células de Sertoli primaria altamente purificadas y células peritubulares de testículos de ratas.

Aislamiento de células de Sertoli y peritubulares Las células de testículos de ratas

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.3K vistas.  Justus-Liebig-Universität Gießen.  Se requieren células de Sertoli primaria para el estudio de testículo-inmune privilegio, la transducción de señales durante la inflamación o infección, y la utilización de sus propiedades inmunoprotectivos. Aquí se describe un protocolo basado en enzima para el aislamiento de células de Sertoli primaria altamente purificadas y células peritubulares de testículos de ratas. 

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Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...