התזמורת סימפונית נתמכת על ידי NIH רות ל &#39;Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK נתמך על ידי מלגת דוקטורים מהאגודה האמריקנית לסוכרת (7-10-MI-05), והוא נתמך על ידי אהה פרס איגוד לב אמריקאי הוקם חוקר (12EIA8270000). ניסויי cytometry זרימה בוצעו במשאבים משותפים Cytometry זרימת VMC. משאבי cytometry זרימת VMC משותפים נתמך על ידי המרכז לחקר מחלות העיכול ונדרבילט (DK058404).

1. חומרים כימיים ומתכלה לפני שתתחיל בפרוטוקול הניסוי הזה, להכין את ריאגנטים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X DPBS (ללא Ca וMg) בתוספת 0.5% BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS חיץ: 1X DPBS (ללא Ca ומ&quot;ג), 2 mM EDTA, ו -1% FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ ACK: Cl 150 מ&quot;מ NH 4, 10 מ&quot;מ 3 KHCO, ומ&quot;מ Na 2 EDTA 0.1 במים </li></ol> 2. קצירת והכנה של רקמת שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי נהלים שאושרו IACUC ספציפיים לכל מוסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יסודיות להרטיב את הפרווה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך ברמה של תהליך xiphoid (חלק תחתון של עצם החזה) ולפתוח את חלל בית החזה כדי לחשוף את הלב, נזהר שלא לנתק את כל כלי דם גדולים. </li></ol> הערה: בשלב זה, היא גם מועילה להשאיר את הדיאפרגמה שלמה ככל<html> אפשר ולחתוך חריץ מהצד של כלוב הצלעות הימני כדי לאפשר לדם לזרום וperfusate מתוך חלל בית החזה. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ העלייה הימנית כדי לאפשר לדם וperfusate להימלט מערכת הדם. </li></ol> שים לב: כאשר מתמודדים עם עכברים שמנים, קרום לב עודף בייתכן שיהיה הצורך להסיר על מנת לאפשר גישה אל הלב. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את הלב עם מלקחיים ובעדינות להכניס מחט לתוך החדר השמאלי דרך הקודקוד. לאט perfuse העכבר עם 15 מ&quot;ל סטרילי PBS. </li></ol> שימו לב: להפחית את שיעור זלוף אם הריאות מתחילות למלא ולהרחיב. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הצפק ולהסיר את רפידות שומן perigonadal באמצעות טיפול, כדי למנוע כל רקמות האשכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כריות שומן במשקל סירה על קרח המכיל 2 DPBS מ&quot;ל 1X (ללא מ&quot;ג או Ca) בתוספת 0.5% BSA, ובשר טחון AT לחתיכות דקות. </li></ol>התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; הערה: הגבל את כמות AT לשוקלת סירה עד 1.2 גרם. אם הכמות של AT עולה על 1.2 גרם, לחלק אותו שווה בשווה בין שתי סירות שוקלות. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דגימות על קרח ולהכין לעכל פתרון מיליליטר collagenase 3 לכל מדגם AT בהיקף של 1X DPBS בתוספת 0.5% BSA, 10 מ&quot;מ CaCl 2, ו -4 מ&quot;ג / מיליליטר collagenase, מהסוג II. </li></ol> 3. עיכול collagenase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לצינורות חרוטי 50 מ&quot;ל על ידי שפיכת homogenate ושטיפת סירה לשקול עם 1 DPBS מ&quot;ל (0.5% BSA) ופתרון לעכל מיליליטר collagenase השני 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על homogenate בייקר סיבובי (200 סל&quot;ד) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל DPBS (0.5% BSA) לצינורות החרוטים ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate homogenate פעמים רבות באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ&quot;ל, ולהעביר השעיות תא דרך 100 מיקרומטר במסנן לצינור חדש 50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיה תא בXG 500 עבור 10 דקות ב 4 &amp; Dלמשל, ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה SVF במאגר ACK 3 מ&quot;ל לlyse מזהמים אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ FACS מ&quot;ל 12 והשעית תא צנטריפוגות ב XG 500 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה ב SVF חיץ FACS. </li></ol> הערה: השתמש בגודל של התא גלולה כמדריך לכמה חיץ FACS לresuspend פנימה אם התא גלולה מכסה את החלק התחתון של צינור חרוטי 50 מ&quot;ל, השתמש 0.5-1 חיץ FACS מ&quot;ל, אחרת resuspend ב0.25-0.5 מ&quot;ל. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מניחים על קרח ולהכין aliquots דילול 1:10 של כל דגימה לספירת תאים על ידי ערבוב 40 μl חיץ FACS, פתרון כחול 50 μl trypan (0.2%), ו10 השעיה תא μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא המבוסס על הרחקת trypan הכחולה ולדלל השעיות תא לריכוז סופי של x 05-10 אוקטובר 6 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> 4. צביעה של אנטיגנים תא שטח <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אנטי עכבר CD16/CD32 נוגדן (FC בלוק) לריכוז סופי של 0.5-1 μg/10 6 תאים, ולדגור על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות העברה (≥ 10 6 תאים) עד 12 x 75 צינורות תחתית עגולות קלקר מ&quot;מ. הכן צינורות נפרדים אם ניתוח כספומטים ותאי T, ולשלב את תאים נוספים כדי להכין מספר מספיק של צינורות כדי להתאים את הפיצוי הנדרש וקרינה שונה מינוס אחד (FMO) פקדים. </li></ol> הערה: כדוגמה, כאשר כימות שיעור הכספומטים המבוסס על פקדי FMO F4/80 וCD11b, הפיצוי הבא ויצטרך להיות מוכנים: - מחולל (תאים) - DAPI או יודיד propidium (PI) כתם בודד (תאים, לא להוסיף צבע כדאיות עד שלב 5.1) - F4/80 APC (תאים או חרוזים פיצויים) כתם בודדים - CD11b FITC תאים בודדים או כתם (חרוזים פיצויים) - FMO 1 (תאים): + + CD11b FITC צבע כדאיות עכברוש IgG2a κ אלוטיפ השליטה APC (הוסיף בשלב 5.1) - FMO 2 (תאים): F4/80 APC + עכברוש IgG2b κ אלוטיפ השליטה FITC + צבע כדאיות (הוסיף בשלב 5.1) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדנים fluorophore-מצומדות עיקריים ו / או פקדי אלוטיפ בריכוז המתאים (ראה טבלה של חומרים כימיים וחומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן על דגימות מאור ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ FACS מ&quot;ל 2 והשעית תא צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה ב SVF 2 חיץ FACS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG תא ההשעיה 500 דקות 5 ב 4 ° C, ו resuspend תא גלולה ב SVF ≥ 400 חיץ FACS μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הדגימות ל12 x 75 צינורות תחתית עגולות קלקר מ&quot;מ מאובזר עם 35 סטרפלס מסננת תא מיקרומטר.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגן מפני אור, ודגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח FACS. </li></ol> הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות יש לנתח תאי immeadiately, עם זאת, ניתוח FACS עם פרוטוקול זה נערך בהצלחה על תאים שכותרתו מאוחסנים במאגר FACS ל1-2 שעות ב 4 ° C. אם תאים צריכים להיות קבועים כדי להגדיל את זמן אחסון, ניתן לתקן תאים שכותרתו עם paraformaldehyde 2% על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני ניתוח FACS. חברות נוגדנים מצביעות על כך שניתן לאחסן את תאי שכותרתו לתקופה של עד שבוע אחד, עם זאת, זה לא נבדק במסגרת הליך זה. 5. ניתוח FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח FACS, להוסיף צבע כדאיות לדגימות ובקרות מתאימות כדי לאפשר לאפליה תא חי / מת. </li></ol> הערה: צבעי כדאיות רבים זמינים באופן מסחרי, אבל DAPI וPI מומלצים בהתאם לפרופ &#39;עירור / פליטהIles של נוגדני fluorophore-מצומדות בשימוש. DAPI ויודיד Propidium מתווספים לכל דגימה בריכוז סופי של 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדגם בלא כתם שלילי שליטה, רצוי תאים מבודדים מאותה הרקמה כמו דגימות ניסוי, כדי להתאים את פיזור צד (SSC) ופיזור קדימה (FSC), כך שאוכלוסיית התא (ים) של עניין הן בקנה מידה. </li></ol> הערה: לניתוח של AT תאי SVF, מומלץ שSSC יוצג בקנה מידה לעומת יומן FSC בקנה מידה ליניארי. השימוש בקנה מידת יומן לSSC חשוב במיוחד בעת ניתוח כספומטים, שהן לעתים קרובות גדולות מאוד ופרטניות. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר שער פיזור אור ראשוני המבוסס על הסוג של התא (ים) להיות מנותחים, ולהתאים את הצינור המכפיל (PMT), כך שעלייה בתאים בלא הכתם הם בקצה שמאלי של ההיסטוגרמה פרמטר יחיד (מרוכז כ ב -10 ב2) עבור הערוצים המתאימים. &lt;/ P&gt; </ol> הערה: מומלץ שלימפוציטים ומקרופגים (או תאי מיאלואידית אחרים) להיות מנותחים בנפרד בשל הבדלים בautofluorescence. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפקדים מוכתמים בודדים או חרוזים פיצויים ללכוד נוגדנים לבצע פיצוי צבע רב. </li></ol> הערה: השימוש בחרוזי פיצויים מומלץ, עם זאת, התאימות של כל נוגדן חייבת להיות מובטחת. לדוגמה, חרוזים פיצוי עשויים שלא לחצות-מגיבים עם נוגדני ארנבות, במקרה שבו תאים מבודדים נדרשים להשיג שליטת כתם יחידה מתאימה. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע שערים ניסיוניים המבוססים על פקדי FMO שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את cytometer הזרימה לאסוף את המספר המתאים של אירועים המבוססים על השכיחות של האוכלוסייה של עניין ולהקליט את נתוני ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי נתונים FCS יצוא לניתוח מצב לא מקוון. ישנם מספר רב של תוכניות זמינות לcytometr הזרימהניתוח נתונים y. אנו ממליצים Cytobank, פלטפורמה מבוססת אינטרנט המאפשרת investigatores לאחסן ולנתח נתונים וליצור דמויות מכל מחשב עם גישה לאינטרנט 18. בנוסף, Cytobank מציע את היכולת לבצע ציבור נתונים נגיש או להגביל את הגישה למשתפי פעולה. </li></ol>

<ol>
	<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis.">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).</li><li>Danse, L. H., Verschuren, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+oil-induced+yellow+fat+disease+in+rats.+III.+Lipolysis+in+affected+adipose+tissue.">Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue.</a> Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).</li><li>Weisberg, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+is+associated+with+macrophage+accumulation+in+adipose+tissue.">Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+in+fat+plays+a+crucial+role+in+the+development+of+obesity-related+insulin+resistance.">Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).</li><li>Mathis, D., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunometabolism:+an+emerging+frontier.">Immunometabolism: an emerging frontier.</a> Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).</li><li>Stefanovic-Racic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+promote+macrophage+infiltration+and+comprise+a+substantial+proportion+of+obesity-associated+increases+in+CD11c++cells+in+adipose+tissue+and+liver.">Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver.</a> Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice.">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).</li><li>Feuerer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lean,+but+not+obese,+fat+is+enriched+for+a+unique+population+of+regulatory+T+cells+that+affect+metabolic+parameters.">Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters.</a> Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity.">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).</li><li>Winer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+obesity-associated+insulin+resistance+through+immunotherapy.">Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy.</a> Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+invariant+natural+killer+T+cells+by+lipid+excess+promotes+tissue+inflammation,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice.">Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophils+sustain+adipose+alternatively+activated+macrophages+associated+with+glucose+homeostasis.">Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis.</a> Science. 332, 243-247 (2011).</li><li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding.">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).</li><li>Talukdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+insulin+resistance+in+mice+fed+a+high-fat+diet+through+secreted+elastase.">Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase.</a> Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).</li><li>Hagman, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+quantifying+leukocyte+populations+in+human+adipose+tissue:+impact+of+enzymatic+tissue+processing.">Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing.</a> Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45, 194-205 (2001).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

עניין גובר בתפקידה של המערכת החיסונית בהשלכות מטבוליות של השמנה הוביל לשימוש הנרחב בזרימת cytometry לאפיין תאים חיסוניים של AT. אף על פי הפרוטוקול המדויק ישתנה בין מעבדות המבוססות על הניסיון שלהם וציוד זמין, כוללים את השלבים הקריטיים עיכול collagenase, צנטריפוגה ההפרש, וסימון אנטיגן פני תא. מטרתו של המאמר הנוכחי היא לספק לפרוטוקול מפורט ומדריך מעשי לבידודה של AT SVF לחוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעבודה עם AT ו / או ביצוע cytometry זרימה. כמו בכל טכניקה ניסיונית, יש וריאציות רבות שעשויים או לא עשויים להשפיע על תוצאה הרצויה באופן משמעותי. בהתבסס על הניסיון שלנו, במסמך זה מפורט בפרוטוקול מייצג את האיזון יעיל ביותר בין הזמן, משאבים, תשואה סלולרית, וכדאיויות תא. לדוגמה, מצאנו כי הגדלתיש משך זמן של עיכול collagenase השני לעד 60 דקות בריכוזים דומים של collagenase השפעה זניחה על תשואה סלולרית, ולכן, אנו מנצלים עיכול דקות 20 על מנת לצמצם את משך חשיפת collagenase. Collagenase השני הוא collagenase הנפוץ ביותר עבור digestions רקמת השומן. ניתן למצוא תיאור של כל collagenases השונים והשימושים העיקריים שלהם באתר האינטרנט של סיגמא. תשואות סלולריות טיפוסיות מהפרוטוקול לעיל הן 2-3 x 10 6 ו4-5 x 10 6 תאים / G מעכברים שהוזן בשומן נמוך (10% קלוריות משומנים) ושומן גבוה (60% מקלוריות שומן) לדיאטה 16 שבועות, בהתאמה. בנוסף למשתנה פעמים לעכל collagenase, יש מספר השינויים הפוטנציאליים לפרוטוקול הנוכחי בהתאם לדגם הניסיוני בשימוש, כולל טיפול תזונתי. ראשית, כאשר קצירת AT מעכברים שהוזנו בדיאטה מועשרת לחומצות שומן רוויים או כולסטרול, להימנע משמירה על הדגימות על קרח לפני מיותרות משוםT יהיה לגבש ולהפוך קשים מיותר. שנית, הפרוטוקול שלנו כולל צעד תמוגה כדורית אדומה (3.6), עם זאת, זלוף ראשוני מוצלח לעתים קרובות עושה את הצעד הזה מיותר. יש לקחת שלישית, טיפול שלא להוסיף יותר מ 10 מ&quot;מ CaCl 2 לפתרון לעכל collagenase (ריכוז סופי 5 מ&quot;מ); ריכוזי סידן גדולים יותר עלולים לגרום להיווצרות של משקע סידן פוספט. אם משקע זה יוצר בעקבות הצעד הראשוני צנטריפוגה (3.5), להוסיף שני שלבי כביסה עם 20 מ&quot;ל FACS חיץ (המכיל EDTA) שקדמו לצעד תמוגה הכדורית האדומה כדי להסיר את המשקע. רביעית, אנו ממליצים לחוקרים להשתמש בכרית שומן perigonadal כל אחד לפחות, כאשר בידוד SVF. אנחנו עושים המלצה זו לא בגלל מגבלות בתשואה סלולרית, אלא משום שאוכלוסיות תאים שונות להציג חלוקות אזוריות שונות 19. לפיכך, תוצאות עלולות להיות מוטות, כאשר רק בחלק של כרית שומן perigonadal הואאד לבודד תאים חיסוניים המתגוררים בAT. אם כרית שומן כולו היא גדולה יותר מאשר 1.2 גרם, לחלק את רקמת שומן longitudinally מהמקורי לקצות זנב. אם נחלק לשתיים בדרך זו, כל מחצית צריכה לספק אוכלוסייה מייצג של תאים ובדרך כלל צריכה להיות פחות מ 1.2 גרם. עם זאת, במקרה שזה עדיין יותר מ 1.2 גרם, אנו ממליצים לבצע digestions collagenase של 1.2 מגזרים גרם בצינורות נפרדים, ולאחר מכן משלבים את כל תאי SVF לcytometry הזרימה. בנוסף, לעכברים רזים, ייתכן שיהיה צורך לשלב רפידות שומן מעכברים 2 או 3 כדי להשיג תאי SVF מספיק לניתוח תזרים cytometric. הצורך בעכברים נוספים צריך להיות מטופלת בעת תכנון ניסויים. לבסוף, דרך נוספת להציג את הנתונים היא מספר התאים לגרם של רקמה. אם צפיפות תאים רצויה, יש לשקול את AT לפני הריסוק ומערכת עיכול. בכל הקשור לאפיון תאי AT SVF באמצעות cytometry הזרימה, שתייםנקודות יודגש. ראשית, כל הנוגדנים הראשוניים fluorophore-מצומדות צריכים להיות תוקף לשימוש עם AT תאי SVF וטיטרציה כמו שצריך. למרות שאנחנו הפגנו פיצוי עם חרוזים, היינו לנו בעבר טיטרציה נוגדנים אלה עם AT SVF. כאשר אפיון מקרופאגים, אנו ממליצים על השימוש בצבעי טנדם (למשל PE-Cy7), כפי שהיו לנו תוצאות מעורבות ביחס למחייב הלא ספציפי של כספומטים בעת שימוש בנוגדנים מצומדות לצבעים אלה. בנוסף, fluorophores כגון PE וFITC יש להשתמש רק לאחר טיטרציה זהירה כפי שתואר לעיל. ניתן למצוא רשימה של נוגדנים ספציפיים שמשמשים בדרך כלל לאפיון תאי AT SVF יחד עם ריכוזים מומלצים בספקה בטבלת 1. שנית, משום שautofluorescence חזק תערוכת הכספומטים ומספר הנוגדנים להציג רמה נמוכה של הלא ספציפי מחייב כאשר משתמשים בו בריכוז גבוה, אנו ממליצים על השימוש בעדכון FMO שולט להגדיר שערים ניסיוניים.פקדי FMO מופקים על ידי מכתים קבוצה של דגימות בקרה עם כל אבל אחד מהנוגדנים המשמשים לתייג דגימות ניסוי 20. יש לנו שונה בפקדי FMO בפרוטוקול שלנו כדי להחליף את אחד מהנוגדנים עם שליטת אלוטיפ fluorophore מצומדות מתאימה ולא רק הסרתו. בפועל, זה עשוי להיות מקובל לוותר על פקדי FMO לנוגדנים המספקים הפרדה בין אוכלוסיות חריגות חיוביות ושליליות. בנוסף לבקרות אלה, תוכל לציין כי לפני gating על הנוגדנים, אנו מיון קפדני לאוכלוסיות לימפוציטים ומקרופאג מבוסס על פיזור קדימה וצד. זה יהיה לבטל את זיהוי של מקרופאגים autofluorescent בעת ניתוח אוכלוסיות לימפוציטים עם fluorophores כגון FITC וצבעי טנדם. למרות שפרוטוקולים מפורטים הם מעבר להיקף של מאמר זה, טכניקת הבידוד תאר משמשת כצעד ראשון חשוב לטכניקות רבות שמטרתם מאפייניםterizing תאים חיסוניים המתגוררים בAT. לדוגמה, ניתן להשתמש בבידוד לעיל ופרוטוקול מכתים כדי להקל על מיון של אוכלוסיות ספציפיות שממנו יכול להיות מבודד mRNA לנתח ביטוי גנים. בנוסף, שינויים פשוטים בפרוטוקול יכולים להתבצע כדי לאפשר טיפול vivo לשעבר של כספומטים. שינויים אלו יכללו שימוש בטכניקות סטריליות להשיג SVF, אשר יהיה שטף לאחר מכן פעמיים וresuspended בתרבות תקשורת סלולרי המתאימה. במקום להוסיף נוגדני fluorophore-מצומדות להכתים פני שטח אנטיגנים תא, SVF ניתן להוסיף לצלחות תרבית רקמה שאינן מטופלים להעשרה לכספומטים באמצעות דבקות פלסטיק (אם כי זה לא יכול להיות טען להיות טהור אוכלוסייה כfibroblasts וpreadipocytes יכול גם לדבוק ). המטרה זו מושגת על ידי culturing SVF במשך 2-4 שעות על 37 מעלות צלזיוס ואחריו שני שלבי כביסה כדי להסיר תאים שאינם חסיד. ניתן לטפל בכספומטים אז בהתאם, ונקטפו באמצעות ניתוק תא מבוסס EDTA כךlution לcytometry זרימה או lysed בTrizol או Ripa חיץ לבידודה של RNA או חלבון, בהתאמה. ללא תלות ביישום במורד הזרם, טכניקת collagenase לעכל לבידוד adipocytes ותאי SVF שתואר לראשונה על ידי Rodbell בשנת 1964 1 ממשיכה להיות כלי רב ערך עבור האפיון של AT תאים חיסוניים ותרומתם לתוצאות מטבוליות של השמנת יתר.

מבחינה היסטורית, רקמת השומן (AT) כבר נתפסה כאיבר אדיש של אחסון שומנים בדם, שמתרחב ומתכווץ בתגובה למאזן אנרגיה. כעת אנו מבינים כי AT מייצג איבר האנדוקרינית דינמי שמפריש באופן פעיל מספר ההורמונים, אשר משפיעים באופן ישיר התנהגות אכילה והומאוסטזיס הגלוקוז מערכתי. בנוסף, בעשור האחרון חלה עלייה הולכת וגובר לאוכלוסיות הרבות של תאים חיסוניים המתגוררות בכל חלק סטרומה וסקולרית (SVF), כמו גם את תרומתם ל-AT הומאוסטזיס. היכולת להפריד בין AT adipocyte וSVF באמצעות לעכל collagenase אחריו צנטריפוגה ההפרש תואר לראשונה בשנת 1964 על ידי Rodbell 1. Collagenase השני משמש לרוב להפרדת adipocyte וSVF בשל תחזוקה של הקולטנים לאינסולין adipocyte 1. חלוקה במוקדם, האנזימטית של AT הייתה בעיקר מועסק ללמוד adipocyte חילוף חומרים וכדי לבודד preadipocytes. לאחרונה, בטכניקה זו, בשילוב עם הזמינות הנרחבת של cytometers הזרימה ומספר הגדל וההולך של נוגדני fluorophore-מצומדות זמינים מסחרי, יש להקל אפיון של AT תאים חיסוניים. למרות נוכחותם של תאי מערכת חיסונית בדלקת שתוארה בעבר 2, את המסמכים על ידי הזרע וייסברג ואח&#39;. ושו et al. פורסם בשנת 2003 היו הראשון לתעד את ההצטברות של AT מקרופאגים (כספומטים) בהשמנה יתר, אשר מפרישה ציטוקינים דלקתיים ולתאם עם תנגודת לאינסולין AT ספציפית ומערכתית 3,4. תצפיות אלה שימש כבסיס לשדה חדש של חקירה לאחרונה שטבע, &quot;immunometabolism,&quot; 5 וכבר במעקב על ידי מחקרים לכך לאוכלוסיות תאי חיסון שונות, כוללים תאים דנדריטיים, תאי פיטום 6 7, 8 תאי T -10, 11, תאי B NKT תאים 12, 13, אאוזינופילים ונויטרופילים 14,15 בהתפתחות של תנגודת לאינסולין השמנת יתר קשור. מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הטכניקה לעכל collagenase משמשת לבודד תאים של AT SVF ולאפיין כספומטים ו-AT תאי T באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה כבר מותאם לעכבר ב, עם זאת, צופים יכולים ליהנות מקריאת מאמר מצוין המספק פירוט נרחב על אופטימיזציה של טכניקה זו לאדם בגיל 16. קהל היעד של מאמר זה כולל חוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעבודה עם עכבר ובביצוע cytometry זרימה. כמה שיקולים מעשיים לאיזון תשואה סלולרית וכדאיות עם זמן ומשאבים מוצגים כמו גם בקרות cytometry זרימה אופטימליות לאפיון AT אוכלוסיות תאים חיסוניים. בנוסף לפרוטוקול שלנו, קוראים referrאד למאמר יופיטר לאחרונה על ידי Basu et al. לדיון מצוין של חלק מההיבטים הטכניים של cytometry זרימה לכוללים בקרות ופיצויים נאותות 17.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14190-250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>D3571</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2153-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>collagenase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C6885-5G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>propidium iodide solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P4864-10 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stable stack 20 microliter</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>SS-L10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 microliter filter tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>SRL10F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stable stack 250 microliter tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>SS-L250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1000 microliter tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>GPS-L1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1000 microliter filter tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>GP-L1000F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 microliter Filter Tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>SR-L200F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FC Block</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553142</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>fisher 100mn strainers</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>22-363-549</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>medium weigh dish</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>02-202B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>aluminum foil</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>1213100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mincing scissors</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>089531B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vortex</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>2215365</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>14-959-49A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>filter top FACS tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette case 200</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>1367520</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>round bottom tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352058</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringe</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>309646</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>V Bottom Plates</td>
 <td>Costar</td>
 <td>07-200-107</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>transfer bulb pipette</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>13-711-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>11 676 071</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive mat</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>1368750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Culture Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>75253839</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adapters</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>75003723</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CD16/CD32</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553142</td>
 <td>Concentration: 0.5 - 1 &mu;g/ 106 cells</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse F4/80</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>17-4801</td>
 <td>Fluorophore conjugate: APC 
 Concentration: 0.2 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 17-4321</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CD11b</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>11-0112</td>
 <td>Fluorophore conjugate: FITC 
 Concentration: 0.5 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 11/1/4031</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Armenian Hamster anti-mouse CD11c</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>12-0114</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE 
 Concentration: 0.8 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: Dec-88</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Goat anti-mouse MGL1/2</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>FAB4297P</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE 
 Concentration: 0.1 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: IC108P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Goat anti-mouse CD206</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>FAB2535P</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE 
 Concentration: 0.1 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: IC108P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CCR2</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>FAB5538P</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE 
 Concentration: 0.1 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: IC013P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Armenian Hamster anti-mouse TCR&beta;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553174</td>
 <td>Fluorophore conjugate: APC 
 Concentration: 0.2 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 553956</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CD8a</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>552877</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE-Cy7 
 Concentration: 0.8 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 552784</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CD4</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>557956</td>
 <td>Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 
 Concentration: 0.2 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 557963</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table 1. List of Materials and Reagents.

isolation of adipose tissue immune cells

הגילוי של חדירת מקרופאג גדל ברקמת השומן (AT) של מכרסמים ובני אדם סובלים מהשמנת יתר הוביל להתגברות העניין בתרומה של תאים חיסונית לעמידות לאינסולין מקומית ומערכתית. בידוד וכימות של אוכלוסיות תאי חיסון שונות ברזה והשמנת יתר בחברה הוא טכניקה מנוצל בדרך כלל במעבדות immunometabolism; טיפול עדיין קיצוני יש לנקוט הן בבידוד בתא בכלי דם סטרומה וניתוח תזרים cytometry כך שהנתונים המתקבלים הוא אמין ולפרש . בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך בשר טחון, לעכל, ולבודד את החלק היחסי של כלי הדם המועשר בתאי סטרומה החיסונית. כתוצאה מכך, אנו מראים כיצד מקרופאגים נוגדני התווית ולימפוציטים מסוג T וכיצד כראוי שער עליהם בניסויי cytometry זרימה. חלקות זרימת cytometry נציג מעכברים שמנים שאוכלים שומן רזים וגבוהים בשומן האכילו נמוכים מסופקות. אלמנט קריטי של ניתוח זה הוא השימוש בנוגדנים שעושיםלא לזרוח בערוצים שבו במקרופאגים הם autofluorescent אופן טבעי, כמו גם שימוש בפקדי פיצוי הולם.

עיכול collagenase של AT אחריו צנטריפוגה ההפרש שימש לבודד את SVF מרפידות שומן epididymal של עכברים ממין זכר C57BL/6J האכיל שומן נמוך (10% מקלוריות שומן) או שומן גבוה (60% קלוריות משומנים) דיאטה (LFD וHFD , בהתאמה) במשך 16 שבועות. תאים של SVF אז תויגו עם נוגדנים ראשוניים fluorophore-מצומדות לכמת את שיעור הכספומטים קיימא (איור 1) ובתאי T (איור 2) באמצעות ניתוח FACS. gating הראשוני, כולל פיזור אור, אפליה כפיל, ושערים כדאיות מתואר באיורים 1 א &#39;ו2A. יודגש, כי שער פיזור האור הראשוני באיור 2 א מוגבל לאוכלוסיית הלימפוציטים על מנת למנוע כולל תאי מיאלואידית autofluorescent. דוגמה לשימוש בעדכון FMO שולטת להגדיר שערי ניסוי מתואר באיור 1. בדוגמה זו, F4/80 (עמודה שמאלית) וCD11b (עמודה ימנית) נוגדנים מוחלפים עם פקדי אלוטיפ מתאימים לחשבון לכריכת autofluorescence ואינם ספציפית. שערים ברבע לאחר מכן נמשכים לזהות קיימא כספומטים (F4/80 + CD11b +). Gating לCD4 + וCD8 + בתאי T שמוצג באיור 2. קיימא בימפוציטים הם מגודרים ראשון לTCRβ (עמודה שמאלית). כתוצאה מכך, תאי TCRβ + AT T הם מגודרים לCD4 ו CD8 (עמודה ימנית). <img src="/files/ftp_upload/50707/50707fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50707/50707fig1highres.jpg" /> איור 1. מקרופאגים רקמת שומן. SVF היה מבודד מepididymal AT של עכברים ממין זכר C57BL/6J קבלו תזונה שומן גבוהה או נמוכה במשך 16 שבועות באמצעות collagenase לעכל הפרוטוקול. Subseבעקבות זאת, תאי SVF היו מוכתמים לF4/80 וCD11b וניתוח FACS בוצע באמצעות cytometer זרימה לזהות כספומטים. () פיזור אור ראשוני ושערים כדאיות. (ב) שינוי FMO שולט שילוב נוגדני אלוטיפ לF4/80 וCD11b שמשו כדי ליישר הרבע שערים. (ג) השוואה בין שיעור F4/80 + + CD11b כספומטים בכתובת של עכברים שהוזן שומן גבוה והנמוכים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50707/50707fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50707/50707fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50707/50707fig2highres.jpg" /> איור 2. תאי T רקמת שומן. SVF היה מבודד מרקמת השומן של עכברי epididymal C57BL/6J זכר האכילו דל שומן או דיאטה דלת שומן גבוהה במשך 16 שבועות באמצעות tהוא collagenase לעכל פרוטוקול. כתוצאה מכך, תאי SVF היו מוכתמים לTCRβ, CD4, וCD8a וניתוח FACS בוצעו באמצעות cytometer זרימה לאפיין AT תאי T. () פיזור אור ראשוני ושערים כדאיות. (BC) השוואה של שיעור TCRβ + T תאים (עמודה שמאלית) ושל CD4 + ו CD8 + T תאים (עמודה ימנית) מ-AT של (B) ודל שומן (C) עכברים שהוזן שומן גבוה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50707/50707fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן ל להציג דמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adipose Tissue Immune Cells at JoVE.com

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

רקמת שומן (AT) היא אתר של הפעלת תא חיסונית חזקה ואינטראקציה. כמעט בכל התאים של המערכת החיסונית נמצאים בAT ויחסים שלהם שונו על ידי השמנת יתר. בידוד נכון, כימות, ואפיון של אוכלוסיות בתא חיסון הם קריטיים להבנת תפקידם במחלה immunometabolic.

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.0K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. רקמת שומן (AT) היא אתר של הפעלת תא חיסונית חזקה ואינטראקציה. כמעט בכל התאים של המערכת החיסונית נמצאים בAT ויחסים שלהם שונו על ידי השמנת יתר. בידוד נכון, כימות, ואפיון של אוכלוסיות בתא חיסון הם קריטיים להבנת תפקידם במחלה immunometabolic.

Video: Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...