This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

הערה: חלק מהצעדים להלן דורשים הפרוטוקול עובדים במנדף נקי. בנוסף, השיטה דורשת מיקרוסקופ לנתיחה שמרי הטטרדה מצויד מטרת מרחק 10X עבודה ארוכה כדי לפקח spheroplasting. מיקרוסקופ יש להגדיר בשכונה לפני הזמן. הסר את זרוע micromanipulator ובעל צלחת מההיקף ולמקם את הפריטים האלה במקום בטוח הרחק מאזור העבודה. 1. הכנת Spheroplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בתנאי שמרים רצויים. השתמש על 2 x 10 8 תאים עבור כל דגימה, למשל 4 מיליליטר של תרבות בOD600 1.4 = 5 x 10 7 תאים / מיליליטר. למרות עיבוד מיידי של דגימות עשוי להיות עדיף במקרים מסוימים, עבור מרבית היישומים, ניתן לאחסן aliquots הסלולרי בקרח לעד 8 שעות לפני העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות וספין בצנטריפוגה קלינית בהגדרת 5 (2,345 סל&quot;ד / 857.5 XG) במשך 3 דקות עד גלולה התאים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג טיפול לקיחה הבינוני לא לאבד את התאים מגלולים. בעדינות resuspend התאים במאגר ZK מיליליטר 1 ולאחר מכן להוסיף 40 dithiothreitol μl M 1 (DTT). דגירה 2 דקות עם ערבוב עדין. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורים גלולים במאגר ZK 1 מיליליטר. הוסף 5 μl של פתרון מוכן טרי של 100T zymolyase שכבר מעורב באופן יסודי. דגירה במשך 20-30 דקות על 30 מעלות צלזיוס להסיר את דופן התא ולייצר spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay אגל 10 μl של השעיה תא בשקופית מיקרוסקופ כדי לקבוע אם spheroplasting הוא מלא. תאים שנצפו תחת מיקרוסקופ לנתיחה ללא coverslip. תאים אמורים להופיע נפוחים ועגולים ולא מעט מוארכים וצריכים lyse הבא תוספת של 20 μl של מים. אם תאים לא מצליחים lyse, להחזיר את המדגם ל -30 מעלות צלזיוס ומחדש assay כל 10 דקות עד תמוגה מים מושרה הוא ציין בקלות. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend ולשטוף אני תא גלולהn 2.5 מיליליטר MES / חיץ סורביטול קר. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). בעדינות resuspend תא גלולה ב300-400 MES / חיץ סורביטול קר μl. יכולים להיות כל הזמן בתאים על קרח בשלב זה לכמה שעות. </li></ol> 2. כרומוזום הפצת הערה: משטחי הזכוכית שעליו כרומוזומים ייפרסו-או שקופיות או coverslips-צריך להיות מוכנים מבעוד מועד. כל שקופית או coverslip צריכה להיות שקוע במים, ואז EtOH, אז להתייבש, ומלוטש עם נייר עדשה. אם הכרומוזומים יתפרסו על coverslips, coverslip צריך להיות מודבקים לשקופית עם סקוטש או מלט גומי. אלא אם נאמר אחרת, שאר הפרוטוקול יתארו מתפשטים משני שקופיות או coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipettor P20, pipet 20 μl של השעיה תא על פני השטח של שקופית נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor P200, להוסיף 40 μl של 3% פתרון PFA / סוכרוז ולערבב בעדינות solution על ידי &quot;מתערבל&quot; השקופיות עם היד עד קווי Schlieren ייעלמו. מניחים שקופיות תחת מיקרוסקופ ולאשר כי תאים הם בפוקוס. את פתרון PFA צריך להיות מוכן טרי-במנדף ביום שימוש. הערה: אם החלבון של עניין לא נבדק על ידי השיטה בעבר, מומלץ להכין שקופיות נוספות באמצעות פתרונות המכילים 2 ו -4% PFA כדי לקבוע אם השמירה של החלבון רגישה לתנאי קיבעון. פתרון / סוכרוז 4% PFA משמש במקרים שבם רצוי לדמיין microtubules טובולין קשור. החסרון של הריכוז גבוה יותר הוא שמקבע את הכרומוזומים יהיו &quot;underspread,&quot; 2% PFA גם נוטה להניב כרומוזומים &quot;underspread&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor P200, להוסיף 80 μl של 1% Lipsol, מערבולת כמו קודם לערבב פתרונות שלמים ככל האפשר, להתחיל טיימר. במידת Lipsol לא זמין, 80 μl 1% NP40 או 80 μl DH 2 O יכולים להיותהוחלף (ראה נציגי תוצאות, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בתאים בזהירות ובעדינות מערבולת השקופית כל 15 שניות. כאשר כ -80% מהתאים lysed (נעלם) לעצור את שעון העצר, להסיר באופן מיידי את השקופית ממיקרוסקופ, להוסיף 80 μl של פתרון PFA / סוכרוז, ומערבולת לערבב. תמוגה צריכה להתרחש מבין 30 ל 90 שניות לאחר תחילת שעון העצר. הערה: אם כמה שקופיות להראות תמוגה בערך באותו הזמן, אחד יכול סופו של דבר להשמיט ניטור מיקרוסקופי לשארית השקופיות ופשוט זמן תקופה שבין תוספת של lipsol ותוספת של aliquot הסופי של מקבע בזהירות. עם זאת, קיצור זה רק אמין בעת ​​הכנת שקופיות מרובות מאותה הדגימה. עדיף לפקח תמוגה של כל דגימה מיקרוסקופית כאשר שקופיות שונות מוכנות מדגימות שנלקחו בזמנים שונים או מתרבויות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על משטח נקי ושטוח ולהפיץ את הנוזל על פני surfac unfrosted כלדואר של השקופית באמצעות הצד של pipet נקי, חד פעמי מרעה שנערך מתחת להמניסקוס של &quot;השלולית&quot; אבל מעל פני השטח של השקופית עצמה, כלומר. לא &quot;לגרוף&quot; את פני השטח של השקופיות עם pipet. אל תעשה שימוש חוזר pipet בשקופיות שונות, כדי למנוע זיהום של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את השקופיות לייבוש למשך הלילה במנדף. רכיבים גרעיניים מסיסים יישבו על פני השטח השקופיות ולהיקשר אליו. לניסויים גדולים, מתכנן את השימוש בחלל לצעד הייבוש חשוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתייבש, תוצאות אופטימליות מתקבלות על ידי התקדמות לשלב immunostaining באותו היום. עם זאת, פתרון סוכרוז המיובש מטביע כרומוזומים התפשטות ב&quot; דבש &quot;המאפשר הקפאה של דוגמאות: ניתן להעביר שקופיות לתיבת שקופיות פלסטיק ומאוחסנות ב -20 ° C במשך שנים. </li></ol> 3. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות בתמונה 0.2%-פלו למשך 30 שניות. כדי להסיר דבש. שקופיות להישען עלקצה, עם הקצה מונח על מגבת נייר, כדי להסיר תמונה-פלו שייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות ב1x TBS במשך 5 דקות לשטוף. הסר נוזל עודף על ידי נשען שקופיות על קצה, אבל לא נותן להם להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות חלבית צד עד, pipet 300 μl TBS / BSA לשקופית מעבר לחלק unfrosted של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתא לח על RT במשך 15 דקות. (מיכל פלסטיק גדול מרופד במגבות נייר מים רוויים בתיבת שקופיות לוחית מתכת או פלסטיק מחוררת עם מגבות נייר רוויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים שקופיות על ידי מנוחה קצה קצר של השקופית על מגבת נייר ונשען השקופית נגד תמיכה מתאימה (כגון מדף מבחנה). אל תאפשר משטח לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחיל 80 μl של חיץ TBS / BSA המכיל את הדילול המתאים של נוגדן ראשוני. אם נוגדן הגבלה, להשתמש 40 μl וcoverslip 22 מ&quot;מ x 22. לסרום ארנבת גולמי, זה בדרך כלל בין דילול 1/50 ו1/500. הערה:בצע titrations להכנות נוגדן חדשים. ההכנה לדלל ביותר שתשואות גבוהות אות מעל הרקע נבחרה. כדי לשלוט על הרמה של מכתים רקע, צריכים להיות מוכנים מזן המוטציה המחיקה המתאים ו / או שקופיות כפולות גרעינים צריכים להיות מוכתם בדם לפני חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip 22 x 50 מ&quot;מ מלוטש בשקופית הימנעות בועות. לעשות זאת על ידי החזקת coverslip בין האגודל והאצבע לאורך הקצה הארוך בעמדות ליד קצה אחד קצר. מחזיק coverslip בביחס זווית של 30 מעלות כדי להחליק, הרחוק ביותר מקצה קצר האצבעות הוא הוריד עד שהיא נחה בשקופית רק בתוך קצה &quot;השלולית&quot; הקרוב ביותר לאזור החלבית של השקופית. אז לאט לאט להוריד את coverslip בתנועה חלקה עד האצבעות מחזיקות את מגע שקופיות הספסל, ולאחר מכן שחרר. אל תנסה להתאים את המיקום של coverslip רגע שנוחת. הערה: אם מרווחי כרומוזום הוכנו עלcoverslips המודבק (ולא ישירות על פני השטח של שקופיות), coverslip מדגם זה יישאר מודבקים לשקופית בכל שלבי הצביעה וכביסה. Coverslip נוסף יוצב על גבי coverslip המדגם להפיץ את פתרון הנוגדנים באופן שווה במהלך מכתים ולאחר מכן הושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בתא לח אטום ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק העברת הקצה החלבית השקופיות למדף צביעת שקופיות זכוכית ולצלול בצנצנת מכתים המכילה TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לטבול את השקופית למעלה ולמטה כדי להסיר את coverslip. נסה לא להשתמש בכוח רב מדי כדי לעשות את זה. שטוף את שקופיות 2x 10 דקות על ידי השריית בTBS. הסר שקופיות ממדף וניקוז נוזל עודף על ידי הנגיעה קצה למגבת נייר. אל תתנו יבש פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת אור עמום, מייד להוסיף 80 μl TBS / BSA המכיל דילול פי 1/1000 של נוגדן fluorochrome מצומדות המשני (או 40 μl עם coverslip 22 x 22 מ&quot;מ). מודעהcoverslip ד כמו קודם ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 בתא הלח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר coverslips כמו קודם, לנקז שקופיות, ולאפשר משטח לייבוש באוויר ל1-2 שעות בחושך. שקופיות להישען על מגבות נייר כמו קודם. הערה: אם הפצה בוצע על coverslip רכוב, לנתק את coverslip מהשקופית לפני הייבוש. אז coverslips מיובש כפי שתואר עבור שקופיות בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת אור מאופק, להוסיף כ -30 μl של הרכבה בינונית מכיל DAPI (שלוש 10 טיפות μl) ולאחר מכן להוריד את coverslip בזהירות. אם המרווחים הם על coverslips, למקם את הטיפות של מדיום הרכבה בשקופית נקייה ולהפחית את coverslip, צד כרומוזום למטה, לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדיין באור עמום, לחכות 2 דקות לcoverslip להתיישב ולאטום קצוות של coverslip עם לק ברור. מניחים שקופיות בתיבת שקופיות שטוחות. הערה: למיקרוסקופיה STED, הר עם להאריך זהב. השתמש 30 μl של להאריך זהבללא DAPI ולאפשר לרפא לילה. איטום עם לק הוא מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בשקופיות על ידי מיקרוסקופ epifluorescence widefield עם 40 או אובייקטיבי 100X באמצעות מסנן להגדיר מתאים לDAPI להתמקד. לחלופין לאחסן את השקופית בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. לא להקפיא. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalized for each spheroplast sample by direct observation of lysis with a light microscope. To the trained eye, round spheroplasts darken as they swell before lysis; after lysis cellular remnants appear as floating &#8220;ghosts&#8221;. The combination of experimentally optimized reagent concentrations, and inter-sample standardization of timing, yields consistently well-spread nuclei. 
The choice of fluorophore and microscope used to visualize spread chromosomes depends on the desired structure. In general, spread nuclei are very thin (about 200 nm or less) and soluble protein is removed by the procedure. Thus, the reduction of out-of-focus fluorescence provided by confocal or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy yields little benefit. In fact, if manual focusing reveals staining in multiple focal planes, the nucleus is likely underspread. Although any fluorophore compatible with the microscope can be used for staining, shorter wavelength fluors will improve spatial resolution. For example, spatial resolution progressively decreases as the same structure is stained with a green (Alexa 488), red (Alexa 594), far-red (Alexa 647), or infrared (Alexa 750) fluor. This relationship should be considered in the planning and interpretation of experiments. If an even greater level of structural detail is desired, a super-resolution microscope is required. The details of the staining procedure required for each of these applications differ from those described above and the appropriate staining protocol should be followed9. 
Finally, although direct spreading of nuclei on microscope slides is relatively easy, spreading on slide-mounted coverslips yields significantly improved resolution as it avoids viewing the chromosomes through a layer of mounting medium that contains a high concentration of glycerol. Mounting coverslips on slides requires more dexterity and patience than spreading on slides, but this extra effort can be worthwhile depending on the type of structures being analyzed.

שמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae מציעים יתרונות רבים ללימודים של מנגנונים מולקולריים של תהליכים ביולוגיים, כוללים המחקר של חלבונים השולטים פונקצית כרומוזום. למרות שיש יתרונות ידועים של שמרי ניצנים למחקרים גנטיים, מולקולריים, וביוכימיים, מחקרי ציטולוגית של ההפצה של חלבונים בגרעין התא מסובך על ידי גודלו הקטן. יש שמרי הגרעין הטיפוסי בקוטר של פחות ממיקרון אחד, וזה רק על 5 פעמים גבול הרזולוציה של אור הנראה. לפיכך, כמות המידע על ההפצה של חלבונים גרעיניים שניתן להשיג מimmunostaining הקונבנציונלי או באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוגבלת. גישה שימושית לאפיון הפצת subnuclear של חלבונים היא משטח כרומוזום הפצה. גישה זו כרוכה בהסרת קיר התא, שיבוש תא וקרום גרעין, וllowing תוכן בלתי מסיס של הגרעין להתיישב על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ. רכיבים מסיסים אלה כוללים את המטריצה ​​הגרעינית וכרומוזומים. בנוסף מאפשר הסרת תוכן גרעיני מסיס, אשר משפרת את היכולת לזהות חלבונים מחויבים הכרומטין, כרומוזום הפצת תוצאות שיטה בלחץ משמעותי של כרומוזומים כך שיש לי גרעיני התפשטות קטרים ​​של 3 עד הסביבות 5 מיקרומטר (לגרעיני meiotic דיפלואידי) ו 2 עד 3 מיקרומטר לגרעיני mitotic דיפלואידי. לחץ זה מאפשר זיהוי של מסד גרעיני שקשה יחסית או בלתי אפשרי לפתרון בגרעינים שלמים. חסרון ברור לכרומוזום הפצה הוא האפשרות שהליך הפצה עשוי באופן חלקי או לחלוטין לשבש את המבנה של עניין. מדאיג במיוחד הוא שחלבון כרומוזום מחויב מסוים עלול ללכת לאיבוד כתוצאה מההליך מתפשט. שו סיבוך פוטנציאלי זהLD לזכור כאשר לפרש נתונים. דוגמא אחת של חלבון שהוא רגיש להליך הפצה היא בטא טובולין. בתנאים מסוימים, הציר, המורכב בעיקר מטובולין, נשמר במהלך הפצת 3. ויזואליזציה של הציר היא לעתים קרובות שימושית לשלב גרעינים של עניין. עם זאת, הדמיה טובולין דורשת טיפול עם מקבע ריכוז גבוה; צירים הולכים לאיבוד בתנאים הסטנדרטי המתוארים להלן. דוגמא זו ממחישה כי, בעת ניתוח ההפצה של חלבון uncharacterized בעבר, חשוב לגוון את הריכוז של מקבע כדי לקבוע כיצד רגיש החלבון הוא וריאציה כזו. למרות הדאגה לגבי ההשפעה של תנאי הפצה במבנה הכרומוזומים, השירות וכוחה של שיטת הפצה הודגם בהקשרים רבים ויש לו שירות רחב באפיון של mitotic ו, במיוחד תאי meiotic 4-7. Two שיטות הפצה נעשתה שימוש נרחב. הראשון של שיטות אלה, שפותחו על ידי השידה וג&#39;ירו 8, ימנע את השימוש בחומרי הניקוי ויכול להניב הכנות התפשטות שנראה שיש לי מורפולוגיה כרומוזום יחסית השתמרה היטב כאשר מוכתם עבור DAPI צבע DNA הספציפי. עם זאת, שיטה זו היא קשה יחסית למושלם והאיכות של גרעיני ההתפשטות משתנה באופן דרמטי, כאשר אזור אחד של שקופית בהשוואה לאזורים אחרים. בעיה זו יכולה לסבך גישות כמותיות שכרוכות הדמיה רבות גרעינים שלא נבחרו משקופית אחת, כדי למנוע הטיה רכישת נתונים. כרומוזום השני הפצת שיטה, שפותח על ידי Loidl ו1 קליין, כרוך איזון קיבעון על ידי paraformaldehyde, עם תמוגה ולחץ הכרומטין מקודם על ידי תמיסת ניקוי. כאשר מבוצעים כהלכה, שיטה זו נותנת תוצאות מאוד לשחזור עם פחות וריאציה אזור לאזור בהשוואה לשיטת השידה וג&#39;ירו. מצגת זו מתמקדת בmodifieגרסת ד של השיטה של ​​Loidl וקליין, בגלל האמינות והפשטות שלה. כרומוזום הפצה היא לא מסובכת או זמן רב; ניתן להכין עד 100 שקופיות עבור immunostaining ביום אחד. יתר על כן, הכנות ההתפשטות ניתן לאחסן במקפיא במשך שנים לפני immunostaining, ובכך מעבדות יכולות לפתח מאגר של ממרחי כרומוזום קפוא, שניתן להשתמש בי שאלות ביולוגיות חדשות להתעורר או חומרים כימיים צביעה חדשות הופכים לזמינים. שיטת כרומוזום הפצה היא נפוצה ביותר בשילוב עם immunostaining ומיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield, אבל אפשר גם להכין שקופיות לשיטות אור ברזולוציה סופר מיקרוסקופיות כגון דלדול פליטה המאולץ מיקרוסקופיה (STED).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

המראה של גרעיני התפשטות ביקורתי תלוי באיזון בין קיבעון כרומוזום ודה-דחיסה. גם כאשר ריאגנטים מאוזנת כראוי, וריאציה במידת כרומוזום דה-דחיסה יכולה להתרחש באזורים שונים של אותה השקופית ו / או בין שקופיות שונות. לפיכך, את האיכות של מרווחים באזור נתון של שקופית יש לבחון לפני תמונות מתפרשות. ההשפעות של &quot;פורש&quot; ו- &quot;underspreading&quot; ניתן להדגים באמצעות נוגדנים נגד חלבוני רקומבינציה meiotic. באיור 1, גרעיני meiotic כפולים immunostained לשני חלבוני חילופי גדיל אוקריוטים Rad51 וDmc1 ודלפק מוכתמים עבור DNA עם DAPI. שתי דוגמאות של גרעינים להפיץ בצורה אופטימלית מוצגות באיור 1 א. איור 1 מציגה דוגמא של גרעין underspread ודוגמאות איור 1C של שני גרעינים פשטו בי. הערהשפחות מוקדי Rad51 וDmc1 הם נצפו בשני שוב וunderspread גרעינים לעומת להפיץ כראוי גרעינים. במקרה של גרעיני underspread, כמה מוקדים נמצאים מחוץ למוקד כי המדגם הוא לא מספיק שטוח. בנוסף, נגישות epitope עשויה לתרום לכישלון כדי לזהות את כל המוקדים. יתר על כן, בקוטר הקטן יותר של ההתפשטות יכול למנוע רזולוציה של מבנים צפופים. במקרה של גרעינים פשטו בי, חלבון עלול ללכת לאיבוד בגלל קיבעון מספיק ו / או טיפול חומר ניקוי מוגזם. וריאציות של השיטה סטנדרטית יכולות להימנע מהשימוש בLipsol. הגרסה המקורית של שיטת הפצה שתוארה על ידי אל Loidl et. עושה שימוש בLipsol, חומר ניקוי זכוכית מעבדה תקינות 1. למרות שחומר הניקוי הזה משמש כיום לכרומוזום מתפשט במעבדות רבות, הניסוח המקורי הוא כבר לא זמין באופן מסחרי והמוצר נמכר כיום תחת שם זה כבר ניסח מחדש. Furthermore, הנוסחה המקורית לLipsol היא גם לא זמינה (פרנץ קליין, תקשורת אישית). במאמץ להתגבר על בעיה זו, בצענו ניסויים שבי NP40 חומרי הניקוי זמין מסחרי והגדרה כימית היה בשימוש במקום של Lipsol; שינוי זה של הפרוטוקול הסטנדרטי נמצא לתת תוצאות משביעות רצון לניסוי שבו התפשט גרעיני meiotic היו מוכתמים עבור Rad51 וZip1, רכיב של האזור (איור 2 א) המורכבים synaptonemal המרכזי. מעניין לציין, החלפת פתרון Lipsol עם אותו הנפח של DH 2 0 גם הניב תוצאות משביעות רצון (איור 2). למרות שהממצאים אלה מצביעים על כך ששיטת הפצה שתוארה לעיל יכולה להיות מועסקות בהצלחה ללא Lipsol, ייתכן שהחלק מהתוצאות שתוארו קודם לכן תלויות בשימוש בLipsol ולא תהיינה לשחזור אם NP40 או H 2 0 משמש במקום שלה. פרט לומד את שיטת מיל מתפשטלהילחם לבחור סביר להתחיל באמצעות NP40 ו / או H 2 O במקום של Lipsol. במקרה שהם נתקלו בקשיים, החוקר רשאי לבקש aliquot של Lipsol ממעבדה שהתקבלה מאגר של המגיב לפני שהופסק; Lipsol היה זול והסכום המינימאלי שאפשר להזמין היה מספיק כדי ליצור מיליונים שקופיות. שיטת הפצה מתאימה לשימוש בשיטות מיקרוסקופיה האור ברזולוציה סופר. מורכב synaptonemal מורכב משני אלמנטים צירי / ליניארי לרוחב כל אחד מהם מארגנים זוג chromatids אחות לקבוצה של מערכי לולאה, עם הבסיס של כל לולאה קשורה לאלמנט. כרומוזומים Pachytene לי synapsed זוגות של אלמנטי רוחב שנערכו במקביל במרחק של 100 ננומטר על ידי חלבונים היוצרים את האזור של מתחם synaptonemal המרכזי. לא ניתן לפתור אלמנטי רוחב לזווג אלה על ידי מיקרוסקופ epifluorescence widefield הקונבנציונלי, אך ניתן לפתור על ידי סופר-resoluשיטות tion. באיור 3, גרעין pachytene הוא הראה כי הוא מוכתם באותו הנוגדן לחלבון Zip1, המשמש לניסוי באיור 2. המדגם גם מוכתם לחלבון אדום 1 color, רכיב של אלמנטים לרוחב צירי /. התוצאה מגלה כי נוגדן Zip1 מכיר האזור מחייב אלמנט הרוחבי של Zip1, ולא סליל אלפא המוארך סליל מפותל תחום שבין אזורי אלמנט המחייב לרוחב. לפיכך, דפוס מכתים נצפה עם נוגדן Zip1 זה חושף את הנתיבים המקבילים של אלמנטי הרוחב לזווג. חלוקת מוקדי אדום 1 color לאורך אלמנטי רוחב היא דלילה יחסית בהשוואה למוקדי Zip1, אבל השיטה הכפולה מכתימה מראה כי אדום 1 color מוקדים בדרך כלל לשכב ליד הנתיבים ליניארי שהוגדרו על ידי מוקדי Zip1. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים שבו באותה שיטת הפצה שימשה להכנת דגימות לבדיקה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים; המבנה המשולש של comp synaptonemallex נשמר במהלך ההליך מתפשט. התמונה שמוצגת באיור 3 נוצרה על ידי STED מיקרוסקופיה 9. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig1.jpg" /> איור 1: דוגמאות לגרעיני התפשטות גרעיני meiotic המוכתמות לDmc1 (ירוק), Rad51 (אדום), וה- DNA (DAPI, כחול).. בר = 1 מיקרומטר. () 2 דוגמאות של גרעינים להפיץ בצורה אופטימלית. (ב) דוגמא של גרעין underspread. (ג) שתי דוגמאות של גרעינים פשטו בי. הדוגמא בצד השמאל היא גרעין שבו רק החלק העליון הוא פשט בי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig2.jpg" /> איור 2: גרעיני meiotic הוכנו ללא שימוש בLipsol מורחים גרעיני meiotic מהשלבים הצביעו מוכתמים לRad51 (אדום),.Zip1 (ירוק), ו- DNA (DAPI, כחול). שים לב שדחיסת כרומוזום המתרחש בתאי מעבר מleptonema לpachynema היא במידה רבה נשמרה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig3.jpg" /> איור 3: ויזואליזציה של מתחם synaptonemal באמצעות מיקרוסקופיה STED גרעין pachytene המוכתם לZip1 (ירוק) ואדום 1 color (אדום).. הנתונים עובדו באמצעות תוסף DeconvolutionLab ImageJ 10 לרוץ 100 חזרות תוך שימוש במודל ריצ&#39;רדסון-לוסי עם כוחות הביטחון הפלסטיניים STED מדוד.

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Views.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS ייצור המכשיר ושינוי פני השטח

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.