This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

ملاحظة: بعض الخطوات للبروتوكول تتطلب أدناه العمل في غطاء الدخان نظيفة. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب طريقة المجهر تشريح الخميرة الرباعيات مجهزة هدفا بعد 10X العمل الطويلة لمراقبة spheroplasting. يجب تعيين المجهر يصل في غطاء محرك السيارة في وقت مبكر. إزالة الذراع micromanipulator وحامل لوحة من نطاق ووضع هذه العناصر في مكان آمن بعيدا عن منطقة العمل. 1. إعداد Spheroplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخميرة في ظل ظروف المطلوب. استخدام حوالي 2 × 10 8 خلايا لكل عينة، على سبيل المثال 4 مل من ثقافة في OD600 1.4 = 5 × 10 7 خلية / مل. على الرغم من معالجته فورا من عينات قد يكون من الأفضل في بعض الحالات، بالنسبة لمعظم التطبيقات، قسامات خلية يمكن تخزينها على الجليد لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل أن يتم معالجتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتدور في أجهزة الطرد المركزي السريري في تحديد 5 (2345 دورة في الدقيقة / 857.5 x ج) لمدة 3 دقائق لخلايا بيليه. </lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب المتوسطة مع الحرص على عدم فقدان الخلايا من بيليه. بلطف resuspend الخلايا في 1 مل العازلة ZK ثم إضافة 40 ميكرولتر 1 M dithiothreitol (DTT). احتضان 2 دقيقة مع خلط لطيف. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات resuspend في 1 مل العازلة ZK. إضافة 5 ميكرولتر من حل الطازجة من 100T zymolyase التي تم خلطها بشكل تام. احتضان لمدة 20-30 دقيقة في 30 ° C لإزالة جدار الخلية وإنتاج spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقايسة قطرات 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة المجهر لتحديد ما إذا كان spheroplasting كاملة. خلايا ينظر تحت المجهر تشريح دون ساترة. يجب أن تظهر خلايا منتفخة ومستديرة بدلا من مستطيل قليلا، وينبغي أن ليز التالية إضافة 20 ميكرولتر من الماء. إذا فشلت الخلايا لليز، والعودة العينة إلى 30 درجة مئوية، وإعادة فحص-كل 10 دقيقة حتى لوحظ المياه الناجم عن تحلل بسهولة. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend برفق ويغسل خلية بيليه طن 2.5 مل MES البارد / العازلة السوربيتول. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). و resuspend بلطف بيليه خلية في 300-400 MES الباردة ميكرولتر / العازلة السوربيتول. يمكن أن تبقى الخلايا على الجليد في هذه المرحلة لعدة ساعات. </li></ol> 2. كروموسوم نشر ملاحظة: الواجهات الزجاجية التي تقوم عليها سيتم الشرائح أو بإحدى هاتين العقوبتين تنتشر الكروموزومات coverslips-يجب أن يكون مستعدا في وقت مبكر. يجب أن يغطس كل شريحة أو ساترة في الماء، ثم ETOH، ثم يترك ليجف، ومصقول مع ورقة العدسة. إذا كان سيتم نشر الكروموسومات coverslips على أنه ينبغي اضافته ساترة لشريحة بشريط لاصق أو الاسمنت والمطاط. ما لم يذكر غير ذلك، فإن بقية بروتوكول يصف نشر على أي شريحة أو ساترة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P20، الماصة 20 ميكرولتر من تعليق خلية على سطح شريحة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P200، إضافة 40 ميكرولتر من 3٪ PFA / محلول السكروز وتخلط بلطف solutioن من قبل &quot;يحوم&quot; الشريحة مع اليد حتى تختفي خطوط انعراجي. ضع الشريحة تحت المجهر والتأكد من أن الخلايا هي في التركيز. يجب أن يكون الحل PFA أعدت-الطازج في غطاء الدخان في يوم من الاستخدام. ملاحظة: إذا لم يتم فحص البروتين من الاهتمام من خلال الأسلوب السابق، فإنه من المستحسن لإعداد الشرائح إضافية باستخدام الحلول التي تحتوي على 2 و 4٪ PFA لتحديد ما إذا كان الإبقاء على البروتين حساس للشروط التثبيت. يتم استخدام 4٪ PFA حل / السكروز في الحالات التي يكون من المرغوب فيه تصور ميكروتثبول تويولين المرتبطة بها. العيب من تركيز تثبيتي العالي هو أن الكروموسومات ستكون &quot;underspread،&quot; يميل 2٪ PFA أيضا أن تسفر الكروموسومات &quot;underspread&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P200، إضافة 80 ميكرولتر من 1٪ Lipsol، دوامة كما كان من قبل لخلط حلول تماما بقدر الإمكان، وبدء الموقت. إذا Lipsol غير متوفرة، 80 ميكرولتر 1٪ NP40 أو 80 ميكرولتر درهم 2 O قد يكوناستبدال (انظر ممثل النتائج، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاهدة الخلايا بعناية وبلطف دوامة الشريحة كل 15 ثانية. عندما هي lysed حوالي 80٪ من الخلايا (اختفى) إيقاف الموقت، إزالة الشريحة مباشرة من المجهر، إضافة 80 ميكرولتر من PFA / محلول السكروز، ودوامة لخلط. تحلل ينبغي أن يحدث من ما بين 30 و 90 ثانية بعد بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. ملاحظة: إذا أظهرت عدة شرائح تحلل في نفس الوقت تقريبا، يمكن للمرء أن يغفل في نهاية المطاف المراقبة المجهرية للفترة المتبقية من الشرائح وببساطة توقيت بعناية الفترة ما بين إضافة lipsol وإضافة قسامة النهائية من تثبيتي. ومع ذلك، هذا الخفض القصير هو موثوق بها فقط عند إعداد عدة شرائح من نفس العينة. فمن الأفضل لمراقبة تحلل من كل عينة مجهريا عند إعداد الشرائح المختلفة من عينات أخذت في أوقات مختلفة أو من ثقافات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على سطح مستو نظيفة وتنتشر السائل عبر surfac unfrosted كامل(ه) من الشريحة باستخدام جانب نظيفة، يمكن التخلص منها الماصة المراعي التي عقدت تحت الغضروف المفصلي من &quot;بركة&quot; ولكن فوق سطح الشريحة نفسها، أي. لا &quot;أشعل النار&quot; على سطح الشريحة مع الماصة. لا إعادة استخدام الماصة على الشرائح المختلفة لتجنب تلوث العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها في غطاء الدخان. والمكونات النووية غير قابلة للذوبان يستقر على سطح الشريحة وربط ذلك. للتجارب كبيرة، والتخطيط لاستخدام الفضاء للخطوة التجفيف هو المهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جفت مرة واحدة، ويتم الحصول على أفضل النتائج من خلال التقدم إلى المرحلة المناعية في نفس اليوم. ومع ذلك، فإن الحل السكروز المجففة يضمن انتشار الصبغيات في &quot;العسل&quot; الذي يسمح بتجميد عينات: يمكن نقل الشرائح إلى مربع الشريحة البلاستيكية وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة سنة. </li></ol> 3. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في 0.2٪ صور فلو لمدة 30 ثانية. لإزالة العسل. الشرائح الهزيل علىميزة، مع حافة يستريح على منشفة ورقية، لإزالة بقايا صور فلو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في TBS 1X لمدة 5 دقائق لغسل. إزالة السائل الزائد بالانحناء الشرائح على الحافة، ولكن لا تسمح لهم تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرائح متجمد حتى الجانب، الماصة 300 ميكرولتر TBS / BSA على الشريحة عبر الجزء unfrosted من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في غرفة رطبة في RT لمدة 15 دقيقة. (حاوية بلاستيكية كبيرة تصطف مع المياه المشبعة مناشف ورقية تحت لوحة معدنية أو بلاستيكية مربع الشريحة مثقب مع المناشف الورقية المشبعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف الشرائح التي يستريح على حافة قصيرة من الشريحة على منشفة ورقية ويميل الشريحة ضد الدعم المناسب (مثل أنبوب اختبار رف). لا تسمح السطح ليجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق على الفور 80 ميكرولتر من TBS / BSA العازلة التي تحتوي على التخفيف المناسب من الأجسام المضادة الأولية. إذا الأجسام المضادة يحد من استخدام 40 ميكرولتر و22 × 22 مم ساترة. لمصل الأرنب الخام، وهذا هو عادة بين 1/50 و 1/500 التخفيف. ملاحظة:أداء المعايرة للتحضير الأجسام المضادة الجديدة. يتم اختيار إعداد معظم المخفف التي تعطي إشارة عالية فوق الخلفية. للسيطرة على مستوى تلوين الخلفية، ينبغي إعداد نواة من سلالة متحولة الحذف المناسب و / أو الشرائح المكررة وينبغي ملطخة المصل قبل المناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المصقول 22 × 50 مم ساترة على الشريحة تجنب الفقاعات. القيام بذلك عن طريق الضغط على ساترة بين الإبهام والسبابة على طول الحافة الطويلة في مواقع بالقرب من حافة واحدة قصيرة. عقد ساترة على زاوية 30 درجة بالنسبة إلى الشريحة، يتم إنزال أقصى حافة قصيرة من الأصابع حتى يستقر على الشريحة فقط داخل حافة &quot;بركة&quot; الأقرب إلى المنطقة متجمد من الشريحة. ثم خفض ببطء ساترة في حركة سلسة حتى الأصابع عقد لمسة الشريحة على مقاعد البدلاء، ثم يفرج عنه. لا تحاول ضبط الموقف من ساترة بمجرد أن يهبط. ملاحظة: إذا تم إعداد ينتشر كروموسوم علىcoverslips ملحقة (وليس مباشرة على سطح شرائح)، وهذه عينة ساترة تظل الملصقة على الشريحة في جميع أنحاء تلطيخ والغسيل الخطوات. سيتم وضع ساترة إضافية على رأس ساترة عينة لتوزيعها بالتساوي على حل الأجسام المضادة خلال تلطيخ ومن ثم التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في غرفة رطبة مختومة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نقل حافة بلوري الشرائح إلى شريحة زجاجية تلطيخ الرف ويغرق في جرة تلطيخ التي تحتوي على TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع بلطف الشريحة صعودا وهبوطا لإزالة ساترة. ليس محاولة لاستخدام الكثير من القوة للقيام بذلك. تغسل الشرائح 2X 10 دقيقة بواسطة غمر في TBS. إزالة الشرائح من الرف واستنزاف السوائل الزائدة عن طريق لمس حافة منشفة ورقية. لا تدع سطح جاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل تحت ضوء مهزوما، إضافة على الفور 80 ميكرولتر TBS / BSA تحتوي على 1/1000 تخفيف أضعاف تألقي الضد الثانوية مترافق (أو 40 ميكرولتر مع 22 × 22 مم ساترة). إعلاند ساترة كما كان من قبل واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في غرفة رطبة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة coverslips كما كان من قبل، واستنزاف الشرائح، والسماح للسطح في الهواء الجاف ل1-2 ساعة في الظلام. الشرائح الهزيل على مناشف ورقية كما كان من قبل. ملاحظة: إذا تم تنفيذ نشر على ساترة محمولة، فصل ساترة من الشريحة قبل التجفيف. ثم يتم تجفيفها Coverslips كما هو موضح الشرائح في الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل تحت ضوء مهزوما، إضافة حوالي 30 ميكرولتر من تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي (ثلاث قطرات 10 ميكرولتر) ومن ثم خفض بعناية ساترة. إذا كان ينتشر هي coverslips على، ضع قطرات من تصاعد المتوسطة على شريحة نظيفة وخفض ساترة، الجانب كروموسوم إلى أسفل، على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تزال تحت ضوء مهزوما، الانتظار 2 دقيقة لساترة لتسوية وختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة. وضع الشرائح في مربع الشريحة شقة. ملاحظة: للحصول على المجهر STED، جبل مع إطالة الذهب. استخدام 30 ميكرولتر من إطالة الذهبدون دابي والسماح لعلاج بين عشية وضحاها. ختم بطلاء الأظافر غير ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الشرائح التي widefield المجهر epifluorescence مع 40 أو الهدف 100X باستخدام فلتر مجموعة مناسبة للدابي على التركيز. اختياريا تخزين الشريحة في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة عدة أسابيع. لا تجمد. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalized for each spheroplast sample by direct observation of lysis with a light microscope. To the trained eye, round spheroplasts darken as they swell before lysis; after lysis cellular remnants appear as floating &#8220;ghosts&#8221;. The combination of experimentally optimized reagent concentrations, and inter-sample standardization of timing, yields consistently well-spread nuclei. 
The choice of fluorophore and microscope used to visualize spread chromosomes depends on the desired structure. In general, spread nuclei are very thin (about 200 nm or less) and soluble protein is removed by the procedure. Thus, the reduction of out-of-focus fluorescence provided by confocal or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy yields little benefit. In fact, if manual focusing reveals staining in multiple focal planes, the nucleus is likely underspread. Although any fluorophore compatible with the microscope can be used for staining, shorter wavelength fluors will improve spatial resolution. For example, spatial resolution progressively decreases as the same structure is stained with a green (Alexa 488), red (Alexa 594), far-red (Alexa 647), or infrared (Alexa 750) fluor. This relationship should be considered in the planning and interpretation of experiments. If an even greater level of structural detail is desired, a super-resolution microscope is required. The details of the staining procedure required for each of these applications differ from those described above and the appropriate staining protocol should be followed9. 
Finally, although direct spreading of nuclei on microscope slides is relatively easy, spreading on slide-mounted coverslips yields significantly improved resolution as it avoids viewing the chromosomes through a layer of mounting medium that contains a high concentration of glycerol. Mounting coverslips on slides requires more dexterity and patience than spreading on slides, but this extra effort can be worthwhile depending on the type of structures being analyzed.

الخميرة في مهدها خميرة الخباز توفر العديد من المزايا للدراسات الآليات الجزيئية من العمليات البيولوجية، بما في ذلك دراسة البروتينات التي تتحكم في وظيفة كروموسوم. على الرغم من أن هناك مزايا معروفة من مهدها الخميرة للدراسات الجينية والجزيئية والكيمياء الحيوية، ودراسات الخلوي لتوزيع البروتينات في نواة الخلية معقد بسبب صغر حجمها. نواة الخميرة النموذجية التي يبلغ قطرها ميكرون أقل من واحد، هو فقط حوالي 5 أضعاف الحد قرار من الضوء المرئي. وهكذا، فإن كمية المعلومات حول توزيع البروتينات النووية التي يمكن الحصول عليها من المناعية التقليدية أو باستخدام علامات بروتين فلوري، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، محدودة. نهج مفيد لتميز توزيع النووية الدقيقة من البروتينات السطحية كروموسوم الانتشار. هذا النهج ينطوي على إزالة جدار الخلية، وتعطيل الخلايا والأغشية النووية، والنماذج التالية محتويات غير قابلة للذوبان من نواة ليستقر على سطح شريحة المجهر. وتشمل هذه المكونات غير القابلة للذوبان المصفوفة النووية والكروموسومات. بالإضافة إلى السماح إزالة محتويات النووية القابلة للذوبان، التي تعزز من القدرة على الكشف عن لونين البروتينات ملزمة، الكروموسوم نشر نتائج الأسلوب في الضغط كبيرا من الكروموسومات مثل أن انتشار نواة لها أقطار حوالي 3-5 ميكرون (لنوى الانتصافي مضاعفا) و 2-3 ميكرون لنوى الإنقسامية مضاعفا. هذا الضغط يسمح الكشف عن التحتية النووية التي من الصعب نسبيا أو المستحيل حلها في نواة سليمة. والقصور الواضح للكروموسوم نشر هو إمكانية أن الإجراء قد نشر جزئيا أو كليا يعطل بنية الفائدة. ومما يثير القلق بشكل خاص هو أن كروموسوم ملزمة بروتين معين قد تضيع نتيجة لهذا الإجراء الانتشار. هذا شو المضاعفات المحتملةأن تبقى دينار في الاعتبار عند تفسير البيانات. مثال واحد من البروتين التي تعتبر حساسة لإجراء نشر هو بيتا تويولين. تحت بعض الظروف، المغزل، التي تتألف أساسا من تويولين، يتم الاحتفاظ خلال نشر 3. التصور من المغزل في كثير من الأحيان من المفيد تنظيم نوى الفائدة. ومع ذلك، تصور تويولين يتطلب العلاج مع تثبيتي تركيز عال. يتم فقدان مغزل وفقا للشروط القياسية الموضحة أدناه. يوضح هذا المثال، عند تحليل توزيع بروتين لم يسبق توصيفها، من المهم أن تختلف تركيز تثبيتي لتحديد مدى حساسية البروتين هو هذا الاختلاف. على الرغم من القلق بشأن تأثير الظروف نشر على بنية الصبغي، فقد ثبت فائدة وقوة الأسلوب تنتشر في العديد من السياقات ولها فائدة واسعة في توصيف الإنقسامية، وخصوصا الخلايا الانتصافي 4-7. TWس استخدمت أساليب نشر على نطاق واسع. أول هذه الطرق، التي وضعتها تسريحة وجيرو 8، ويتجنب استخدام المنظفات ويمكن أن تسفر عن منتشرة الاستعدادات التي يبدو أن لها نسبيا المحفوظة جيدا التشكل كروموسوم عندما الملون لDNA محددة صبغ دابي. ومع ذلك، وهذه الطريقة من الصعب نسبيا لاتقان وجودة انتشار نوى يختلف بشكل كبير، وعندما تتم مقارنة منطقة واحدة من الانزلاق إلى مناطق أخرى. هذه المشكلة يمكن أن يعقد النهج الكمي التي تنطوي على تصوير العديد من الأنوية غير محددة من شريحة واحدة لتجنب الحصول على البيانات التحيز. الكروموسوم الثاني نشر الطريقة، التي وضعتها LOIDL وكلاين 1، ينطوي على موازنة التثبيت بواسطة امتصاص العرق، مع تحلل وإزالة الضغط لونين التي يروج لها حل المنظفات. عندما أدائها على الوجه الصحيح، وهذا الأسلوب يعطي نتائج استنساخه جدا مع أقل التباين من منطقة إلى منطقة مقارنة لطريقة تسريحة وجيرو. ويركز هذا العرض على modifieنسخة يوميا من طريقة LOIDL وكلاين، بسبب موثوقيتها والبساطة. كروموسوم نشر ليست معقدة أو تستغرق وقتا طويلا. ما يصل الى 100 الشرائح يمكن أن تكون على استعداد لالمناعية في يوم واحد. وعلاوة على ذلك، قد يتم تخزين انتشار الاستعدادات في الثلاجة لسنوات قبل المناعية، وبالتالي مختبرات يمكن أن تتطور مستودعا للهوامش كروموسوم المجمدة التي يمكن استخدامها عندما تنشأ أسئلة البيولوجية الجديدة أو أصبح الكواشف تلطيخ الجديدة المتاحة. يتم استخدام طريقة كروموسوم نشر الأكثر شيوعا في تركيبة مع المناعية وwidefield مضان المجهر، ولكن من الممكن أيضا لإعداد الشرائح لسوبر قرار ضوء أساليب المجهرية مثل استنزاف الانبعاث المستحث (STED) المجهري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

ظهور انتشار نوى يعتمد بشكل حاسم على التوازن بين تثبيت كروموسوم وإزالة الضغط. حتى عندما يتم متوازنة الكواشف بشكل صحيح، يمكن أن يحدث الاختلاف في درجة كروموسوم دي الضغط في مناطق مختلفة من نفس الشريحة و / أو بين الشرائح المختلفة. وبالتالي، ينبغي تقييم نوعية ينتشر في منطقة معينة من الانزلاق قبل أن يتم تفسير الصور. آثار &quot;overspreading&quot; و &quot;underspreading&quot; يمكن توضيح باستخدام أجسام مضادة ضد بروتينات إعادة التركيب الانتصافي. في الشكل 1، نوى الانتصافي هي immunostained لاثنين من البروتينات حقيقية النواة الصرف حبلا Rad51 وDmc1 ومكافحة الملون لDNA مع دابي مزدوجة. وترد مثالين من انتشار الأمثل نوى في الشكل 1A. ويبين الشكل 1B مثال على نواة underspread وأمثلة الشكل 1C من نواتين تتغطى. ملاحظةأن بؤر أقل من Rad51 وDmc1 ويلاحظ في كل أنحاء وunderspread نوى مقارنة لنشر صحيح نوى. في حالة نوى underspread، بعض البؤر هي من التركيز لأن العينة ليست مسطحة بما فيه الكفاية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسهم حاتمة الوصول إلى عدم الكشف عن كافة البؤر. وعلاوة على ذلك، فإن قطره أصغر من انتشار يمكن أن يحول دون قرار من الهياكل متباعدة عن كثب. في حالة نوى تشعبت، البروتين يمكن أن تضيع بسبب عدم كفاية التثبيت و / أو العلاج المنظفات المفرطة. يمكن أن الاختلافات في الطريقة القياسية تجنب استخدام Lipsol. النسخة الأصلية من طريقة نشر صفها LOIDL وآخرون. يجعل من استخدام Lipsol، مختبر الأواني الزجاجية اللياقة المنظفات 1. على الرغم من أن يتم استخدام هذه المنظفات حاليا لكروموسوم ينتشر في العديد من المختبرات، الصيغة الأصلية لم تعد متوفرة تجاريا وتم المنتجات التي تباع حاليا تحت هذا الاسم إعادة صياغتها. Furthermore، الصيغة الأصلية لLipsol هي أيضا غير متوفرة (فرانز كلاين، اتصال شخصي). في محاولة للتغلب على هذه المشكلة، أجرينا التجارب التي استخدمت المتاحة تجاريا ومحددة كيميائيا NP40 المنظفات في مكان Lipsol. تم العثور على هذا التعديل للبروتوكول قياسي لتعطي نتائج مرضية للتجربة التي انتشرت كانت ملطخة نوى الانتصافي لRad51 وZip1، وهو مكون من المنطقة الوسطى من المشبكي الخيطي معقدة (الشكل 2A). ومن المثير للاهتمام، ليحل محل الحل Lipsol مع نفس الحجم من درهم 2 0 أسفرت أيضا نتائج مرضية (الشكل 2B). على الرغم من أن هذه النتائج تشير إلى أن طريقة انتشار المذكورة أعلاه يمكن أن تستخدم بنجاح دون Lipsol، فمن الممكن أن بعض النتائج المذكورة سابقا تعتمد على استخدام Lipsol ولن تكون قابلة للتكرار إذا تم استخدام NP40 أو H 2 0 في مكانها. فرد تعلم نشر ميل طريقةGHT اختيار معقول للبدء باستخدام NP40 و / أو H 2 O في مكان Lipsol. في حال أن الصعوبات التي واجهتها، يجوز للمحقق أن يطلبوا قسامة من Lipsol من المختبر أن حصل على مخزون من الكاشف قبل وقفها. كان Lipsol غير مكلفة والحد الأدنى للمبلغ واحد يمكن أن تأمر كان كافيا لتوليد الملايين من الشرائح. طريقة نشر هو مناسب للاستخدام مع فائقة الدقة أساليب المجهر الضوئي. ويتكون المجمع المشبكي الخيطي اثنين محوري / العناصر الجانبية الخطية كل منها ينظم زوج من الصبغيات الشقيقة إلى مجموعة من المصفوفات حلقة، مع قاعدة كل حلقة متجهة إلى عنصر. الكروموسومات طور التثخن وsynapsed أزواج من العناصر الجانبية التي عقدت بالتوازي على مسافة 100 ميل بحري من البروتينات التي تشكل المنطقة الوسطى من مجمع المشبكي الخيطي. لا يمكن حل هذه العناصر الجانبية المقترنة بالرمز التقليدي widefield المجهر epifluorescence، ولكن يمكن حلها فائقة resoluطرق نشوئها. في الشكل 3، يظهر نواة طور التثخن التي اتسخت مع نفس الأجسام المضادة لبروتين Zip1، وتستخدم للتجربة في الشكل 2. كانت ملطخة العينة أيضا للبروتين Red1، وهو مكون من محوري / العناصر الجانبية. نتيجة تكشف أن الأجسام المضادة Zip1 يعترف المنطقة ملزم عنصر الوحشي Zip1، بدلا من حلزونية ألفا ممدود لف لفائف المجال الذي يكمن بين عنصر ملزم المناطق الجانبية. وبالتالي، فإن نمط تلطيخ لوحظ مع هذه الأجسام المضادة Zip1 يكشف عن مسارات متوازية من العناصر الجانبية المقترنة. توزيع Red1 بؤر العناصر على طول الجانبية متناثر نسبيا مقارنة Zip1 البؤر، ولكن يبين طريقة تلوين المزدوج الذي Red1 بؤر الكذب عادة بالقرب من مسارات خطية يحددها Zip1 البؤر. هذه النتائج تتفق مع الأعمال السابقة التي كانت تستخدم نفس الأسلوب نشر لإعداد عينات لتحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني. الهيكل الثلاثي للشركات المشبكي الخيطييتم الاحتفاظ ليكس أثناء إجراء الانتشار. تم إنشاء الصورة هو مبين في الشكل (3) من قبل STED المجهر 9. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig1.jpg" /> الشكل 1: أمثلة من انتشار نوى نوى الانتصافي الملون لDmc1 (الأخضر)، Rad51 (الحمراء)، والحمض النووي (دابي والأزرق). شريط = 1 ميكرون. (A) 2 أمثلة لنشر الأمثل النوى. (B) مثال نواة underspread. (C) مثالان من نوى تتغطى. على سبيل المثال على اليسار هو نواة التي يتم تتغطى فقط الجزء العلوي. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig2.jpg" /> الشكل 2: نوى الانتصافي أعدت دون استخدام Lipsol انتشار نوى الانتصافي من المراحل المشار إليها الملون لRad51 (الحمراء).Zip1 (الأخضر)، والحمض النووي (دابي والأزرق). لاحظ أن الضغط الصبغي الذي يحدث مع الخلايا الانتقال من طور الخيوط النحيلة لpachynema يتم الاحتفاظ بشكل كبير. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig3.jpg" /> الشكل (3): تصور مجمع المشبكي الخيطي عبر STED المجهر نواة طور التثخن الملون لZip1 (الخضراء) وRed1 (الحمراء). تم معالجة البيانات باستخدام البرنامج المساعد DeconvolutionLab يماغيج 10 لتشغيل 100 تكرارات باستخدام نموذج ريتشاردسون-لوسي مع STED PSF قياسه.

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Views.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS تصنيع الأجهزة وتعديل السطح

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.