This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

NOTE: Certaines étapes du protocole ci-dessous ont besoin de travailler dans une hotte propre. En outre, la méthode nécessite une dissection microscope levure tétrade équipé d&#39;un objectif à distance 10X long travail chargé de suivre sphéroplastes. Le microscope devrait être mis en place dans la hotte à l&#39;avance. Retirez le bras de micromanipulateur et support de plaque de la portée et de placer ces éléments dans un endroit sûr, loin de la zone de travail. 1. Préparation des sphéroplastes <ol><li> Cultiver la levure dans des conditions souhaitées. Utilisez environ 2 x 10 8 cellules pour chaque échantillon, par exemple 4 ml d&#39;une culture à DO600 = 1,4 x 10 5 7 cellules / ml. Bien que le traitement immédiat d&#39;échantillons peut être préférable dans certains cas, pour la plupart des applications, des aliquotes de cellules peuvent être stockés sur de la glace pendant jusqu&#39;à 8 heures avant d&#39;être traité. </li><li> Transfert suspension de cellules dans un tube de 15 ml centrifugeuse et de spin dans une centrifugeuse clinique à mettre en 5 (2345 tr / 857,5 x g) pendant 3 min pour sédimenter les cellules. </li&gt; <li> Décanter la prise moyenne soin de ne pas perdre des cellules du culot. Resuspendre doucement les cellules dans un tampon de ZK 1 ml, puis ajouter 40 pi 1 M dithiothréitol (DTT). Incuber 2 min en mélangeant doucement. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). </li><li> granulés de remettre en suspension dans un tampon de ZK 1 ml. Ajouter 5 ul d&#39;une solution fraîchement préparée de zymolyase 100T qui a été bien mélangé. Incuber pendant 20-30 min à 30 ° C pour éliminer la paroi cellulaire et produire des sphéroplastes. </li><li> Doser une goutte de 10 pi de suspension de cellules sur une lame de microscope pour déterminer si sphéroplastes est terminée. Cellules vues sous le microscope de dissection sans une lamelle. Les cellules doivent apparaître pléthorique et rond plutôt que légèrement oblongue et devraient lyser après l&#39;addition de 20 pi d&#39;eau. Si les cellules ne parviennent pas à lyser, retourner l&#39;échantillon à 30 ° C et re-test toutes les 10 min jusqu&#39;à ce que l&#39;eau induite par la lyse est facilement observé. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). </li><li> Resuspendre doucement et laver culot cellulaire in 2,5 ml MES / tampon de sorbitol froid. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). Resuspendre doucement culot cellulaire dans 300-400 MES / tampon de sorbitol ul froid. Les cellules peuvent être conservés dans la glace à ce stade pendant plusieurs heures. </li></ol> 2. Chromosome épandage REMARQUE: Les surfaces de verre sur laquelle les chromosomes seront répartis soit-diapositives ou lamelles couvre-devrait être préparée à l&#39;avance. Chaque diapositive ou lamelle devraient être immergés dans l&#39;eau, puis EtOH, puis on le laisse sécher, et poli avec du papier de verre. Si chromosomes seront répartis sur des lamelles, la lamelle doit être apposée sur une diapositive avec du scotch ou du ciment en caoutchouc. Sauf mention contraire, le reste du protocole décrira propagation soit sur une diapositive ou lamelle <ol><li> Aide d&#39;une pipette P20, pipette 20 ul de suspension cellulaire sur la surface d&#39;une lame propre. </li><li> Aide d&#39;une pipette P200, ajouter 40 pi de la PFA / solution de saccharose à 3% et mélanger délicatement la solution par &quot;tourbillonnant&quot; la lame avec la main jusqu&#39;à ce que les lignes disparaissent Schlieren. Placez glisser sous microscope et confirment que les cellules sont en discussion. La solution PFA devrait être fraîchement préparé dans la hotte sur le jour d&#39;utilisation. REMARQUE: si la protéine d&#39;intérêt n&#39;a pas été examiné par la méthode précédemment, il est souhaitable de préparer des diapositives supplémentaires à l&#39;aide de solutions contenant 2 et 4% de PFA afin de déterminer si la rétention de la protéine est sensible aux conditions de fixation. Une solution à 4% PFA / saccharose est utilisé dans les cas où il est souhaitable de visualiser les microtubules de tubuline associés. L&#39;inconvénient de la concentration ultérieure fixateur est que les chromosomes seront &quot;underspread,&quot; 2% de PFA a également tendance à donner chromosomes &quot;underspread&quot;. </li><li> Aide d&#39;une pipette P200, ajouter 80 pi de 1% Lipsol, tourbillonner comme avant de mélanger des solutions aussi complètement que possible, commencer une minuterie. Si Lipsol ne sont pas disponibles, 80 ul de 1% de NP40 ou 80 ul dH 2 O peuvent êtresubstitué (voir résultats représentatifs, Figure 2). </li><li> Regardez les cellules soigneusement et agiter doucement la lame toutes les 15 secondes. Lorsque environ 80% des cellules ont lysées (disparu) arrêter la minuterie, retirer immédiatement la lame du microscope, ajouter 80 pi de PFA / solution de saccharose, et agiter pour mélanger. Lysis devrait se produire à partir de entre 30 et 90 secondes après le démarrage de la minuterie. NOTE: Si plusieurs diapositives montrent lyse à peu près le même temps, on peut éventuellement omettre surveillance microscopique pour le reste des diapositives et simplement du temps soigneusement la période entre l&#39;addition de lipsol et l&#39;ajout de l&#39;aliquote finale de fixateur. Cependant, ce raccourci est fiable que lors de la préparation de plusieurs diapositives à partir du même échantillon. Il est préférable de contrôler la lyse de chaque échantillon au microscope lorsque différentes lames sont préparés à partir d&#39;échantillons prélevés à des moments différents ou de différentes cultures. </li><li> Placez la lame sur une surface plane et propre et répandre le liquide sur toute la surfac non glacése de la diapositive à l&#39;aide du côté d&#39;un propre, des pâturages pipette jetable est tenue au-dessous de la surface du bain de la &quot;flaque&quot;, mais au-dessus de la surface de la glissière elle-même, à savoir. ne pas &quot;ratisser&quot; la surface de la lame avec la pipette. Ne pas réutiliser pipette sur différentes diapositives pour éviter la contamination des échantillons. </li><li> Laisser les lames sécher pendant la nuit dans la hotte. Composants nucléaires insolubles se déposent sur la surface de glissement et de se lier à lui. Pour les grandes expériences, la planification de l&#39;utilisation de l&#39;espace pour l&#39;étape de séchage est important. </li><li> Une fois séchées, des résultats optimaux sont obtenus en progressant à l&#39;étape de immunocoloration le même jour. Cependant, la solution de saccharose séché incorpore les chromosomes d&#39;étalement dans un &quot;miel&quot; qui permet la congélation des échantillons: diapositives peuvent être transférées à une boîte de glissement en matière plastique et stockées à -20 ° C pendant des années. </li></ol> 3. Immunocoloration <ol><li> Tremper les lames à 0,2% Photo-Flo pour 30 sec. pour enlever le miel. Diapositives sur Leanun bord, avec le bord reposant sur une serviette en papier, pour supprimer résiduelle Photo-Flo. </li><li> Tremper les lames en 1x TBS pendant 5 minutes pour se laver. Retirer l&#39;excès de liquide en se penchant diapositives sur un bord, mais ne les laissez pas sécher. </li><li> Lay diapositives givrées vers le haut, pipette 300 ul TBS / BSA sur la lame à travers la partie non glacés de la diapositive. </li><li> Incuber dans une chambre humide à température ambiante pendant 15 min. (Récipient en plastique grande avec des serviettes en papier de l&#39;eau saturée sous une boîte de glissement de plaque de métal ou de plastique perforé avec des serviettes en papier saturées). </li><li> Égoutter diapositives en se reposant un bord court de la lame sur une serviette en papier et appuyé la lame contre un support approprié (comme un porte-tube à essai). Ne pas laisser sécher la surface. </li><li> Appliquer immédiatement 80 pi de tampon TBS / BSA contenant la dilution appropriée de l&#39;anticorps primaire. Si l&#39;anticorps est de limiter, utiliser 40 pi et une lamelle mm 22 x 22. Pour sérum de lapin brut, cela est généralement entre une dilution 1/50 et 1/500. NOTE:Effectuer des titrages pour les nouvelles préparations d&#39;anticorps. La préparation la plus diluée que des rendements élevés signal au-dessus de fond est choisie. Pour contrôler le niveau de la coloration de fond, les noyaux doivent être préparés à partir de la souche mutante de suppression approprié et / ou reproduire des diapositives doivent être colorés avec du sérum pré-immun. </li><li> Placez un poli 22 x 50 mm lamelle sur la lame en évitant les bulles. Pour ce faire, en tenant la lamelle entre le pouce et l&#39;index sur le bord long à des positions proches d&#39;un bord court. Tenir la lamelle à un angle de 30 ° par rapport à glisser, le court le plus éloigné du bord des doigts est abaissée jusqu&#39;à ce qu&#39;il repose sur la diapositive juste à l&#39;intérieur du bord de la &quot;flaque&quot; plus proche de la région dépoli de la lame. Ensuite, abaissez lentement la lamelle dans un mouvement lisse jusqu&#39;à ce que les doigts qui tiennent la lame touche le banc, puis relâchez. Ne pas tenter de régler la position de la lamelle une fois qu&#39;il atterrit. NOTE: Si des étalements de chromosomes ont été préparés surapposés lamelles (plutôt que directement sur la surface des lames), cette lamelle échantillon restera fixée à la glissière au cours des étapes de lavage et de coloration. Une lamelle supplémentaire sera placé sur le dessus de l&#39;échantillon lamelle afin de répartir uniformément la solution d&#39;anticorps pendant la coloration, puis jetés. </li><li> Placer les lames dans une chambre humide scellé et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Tenir le transfert de bord dépoli les diapositives à un support de coloration de lame de verre et plonger dans un bocal contenant de coloration SCT. </li><li> Plonger doucement la lame de haut en bas pour enlever la lamelle. Essayez de ne pas utiliser trop de force pour ce faire. Laver les lames 2x 10 min en immergeant dans du TBS. Sortir les lames de rack et drainer l&#39;excès de liquide en touchant bord à serviette en papier. Ne pas laisser sécher la surface. </li><li> Travaillant sous une lumière tamisée, ajouter immédiatement 80 pi TBS / BSA contenant un 1 / 1.000 dilution d&#39;anticorps secondaire conjugué fluorochrome (ou 40 pi avec un 22 x 22 mm lamelle). Annonced lamelle comme avant et incuber à 4 ° C pendant 2 heures dans la chambre humide dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer lamelles comme avant, les égoutter diapositives, et permettre à la surface sécher à l&#39;air de 1 à 2 h dans l&#39;obscurité. Lean diapositives sur des serviettes en papier comme avant. NOTE: Si la diffusion a été effectuée sur une lamelle montée, détachez la lamelle de la lame avant de sécher. Lamelles sont ensuite séchées de la manière décrite pour les diapositives dans l&#39;étape précédente. </li><li> Travaillant sous lumière tamisée, ajouter environ 30 pi de milieu contenant DAPI (trois 10 Les gouttelettes pi) de montage, puis abaissez délicatement une lamelle. Si les écarts sont sur des lamelles, placer les gouttelettes de milieu de montage sur une lame propre et abaisser la lamelle, côté chromosome bas, sur la diapositive. </li><li> Toujours sous lumière tamisée, attendre 2 min pour lamelle de régler et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placez les diapositives dans une boîte de tiroir plat. NOTE: Pour la microscopie STED, monter avec ProLong Or. Utilisez 30 pi de ProLong Orsans DAPI et laisser sécher durant la nuit. Étanchéité avec le vernis à ongles est inutile. </li><li> Voir les diapositives par microscopie à épifluorescence grand champ avec un 40 ou un objectif 100X en utilisant un filtre approprié pour définir DAPI se concentrer. Éventuellement stocker la lame dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Ne pas congeler. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalized for each spheroplast sample by direct observation of lysis with a light microscope. To the trained eye, round spheroplasts darken as they swell before lysis; after lysis cellular remnants appear as floating &#8220;ghosts&#8221;. The combination of experimentally optimized reagent concentrations, and inter-sample standardization of timing, yields consistently well-spread nuclei. 
The choice of fluorophore and microscope used to visualize spread chromosomes depends on the desired structure. In general, spread nuclei are very thin (about 200 nm or less) and soluble protein is removed by the procedure. Thus, the reduction of out-of-focus fluorescence provided by confocal or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy yields little benefit. In fact, if manual focusing reveals staining in multiple focal planes, the nucleus is likely underspread. Although any fluorophore compatible with the microscope can be used for staining, shorter wavelength fluors will improve spatial resolution. For example, spatial resolution progressively decreases as the same structure is stained with a green (Alexa 488), red (Alexa 594), far-red (Alexa 647), or infrared (Alexa 750) fluor. This relationship should be considered in the planning and interpretation of experiments. If an even greater level of structural detail is desired, a super-resolution microscope is required. The details of the staining procedure required for each of these applications differ from those described above and the appropriate staining protocol should be followed9. 
Finally, although direct spreading of nuclei on microscope slides is relatively easy, spreading on slide-mounted coverslips yields significantly improved resolution as it avoids viewing the chromosomes through a layer of mounting medium that contains a high concentration of glycerol. Mounting coverslips on slides requires more dexterity and patience than spreading on slides, but this extra effort can be worthwhile depending on the type of structures being analyzed.

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae présente de nombreux avantages pour les études des mécanismes moléculaires des processus biologiques, y compris l&#39;étude des protéines qui contrôlent la fonction de chromosome. Bien qu&#39;il existe des avantages bien connus de la levure bourgeonnante pour les études génétiques, moléculaires et biochimiques, les études cytologiques de la distribution des protéines dans le noyau de la cellule est compliquée par sa petite taille. Le noyau de la levure typique a un diamètre de moins d&#39;un micron, ce qui est seulement d&#39;environ 5 fois la limite de résolution de la lumière visible. Ainsi, la quantité d&#39;informations à propos de la distribution des protéines nucléaires qui peuvent être obtenus à partir de immunocoloration classique ou en utilisant les mots-clés de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP), est limitée. Une approche utile pour caractériser la répartition des protéines est subnucléaire surface de chromosome se propager. Cette approche consiste à enlever la paroi cellulaire, perturbant les membranes cellulaires et nucléaires, et unllowing le contenu insolubles du noyau de se déposer sur la surface d&#39;une lame de microscope. Ces composants insolubles comprennent la matrice nucléaire et les chromosomes. En plus de permettre l&#39;enlèvement des matières nucléaires solubles, ce qui améliore la capacité de détecter les protéines liées de la chromatine, le chromosome d&#39;étalement méthode conduit à une décompression importante des chromosomes tels que les noyaux de propagation ont des diamètres de l&#39;ordre de 3 à 5 um (pour les noyaux méiotiques diploïdes) et 2 à 3 um pour les noyaux mitotiques diploïdes. Cette décompression permet la détection de sous-structure nucléaire qui est relativement difficile, voire impossible à résoudre dans les noyaux intacts. Un inconvénient évident de chromosome d&#39;étalement est la possibilité que la procédure d&#39;étalement peut partiellement ou complètement perturber la structure d&#39;intérêt. Il est particulièrement préoccupant que un chromosome lié protéine particulière pourrait être perdu à la suite de la procédure se propager. Cette shou de complication potentielleld être gardé à l&#39;esprit lors de l&#39;interprétation des données. Un exemple d&#39;une protéine qui est sensible à la procédure d&#39;étalement est la bêta-tubuline. Dans certaines conditions, la broche, qui est constitué principalement de la tubuline, est conservée lors de l&#39;épandage 3. Visualisation de la broche est souvent utile de mettre en scène des noyaux d&#39;intérêt. Cependant, la visualisation de la tubuline nécessite un traitement avec un fixateur haute concentration; les broches sont perdus dans les conditions standards décrites ci-dessous. Cet exemple illustre le fait que, lors de l&#39;analyse de la répartition d&#39;une protéine non caractérisée précédemment, il est important de faire varier la concentration de fixateur afin de déterminer la sensibilité de la protéine est d&#39;une telle variation. En dépit de l&#39;inquiétude quant à l&#39;impact des conditions d&#39;épandage sur la structure des chromosomes, l&#39;utilité et la puissance de la méthode de propagation ont été mis en évidence dans de nombreux contextes et a une large utilité dans la caractérisation des mitotique et, en particulier les cellules méiotiques 4-7. Two méthodes d&#39;épandage ont été largement utilisés. La première de ces méthodes, développées par Dresser et Giroux 8, évite l&#39;utilisation de détergent et peut produire des préparations propagation qui semblent avoir relativement bien conservé la morphologie des chromosomes lors teinté pour le colorant DAPI spécifique d&#39;ADN. Cependant, ce procédé est relativement difficile de mettre au point et à la qualité des noyaux de propagation varie considérablement, quand une zone d&#39;une diapositive est comparée à d&#39;autres régions. Ce problème peut compliquer approches quantitatives qui impliquent l&#39;imagerie de nombreux noyaux non sélectionnés d&#39;une diapositive à éviter que des données biais d&#39;acquisition. La deuxième méthode d&#39;étalement chromosome, développé par Klein et Loidl 1, implique la fixation d&#39;équilibrage par le paraformaldéhyde, avec lyse et la décompression de la chromatine promu par une solution de détergent. Lorsqu&#39;il est correctement effectuée, cette méthode donne des résultats très reproductibles avec moins de variation de région à région par rapport à la méthode Dresser et Giroux. Cette présentation se concentre sur un modifiela version d de la méthode de Loidl et Klein, en raison de sa fiabilité et sa simplicité. Chromosome propagation est pas compliqué ou de temps; jusqu&#39;à 100 diapositives peuvent être préparés par immunocoloration en une seule journée. En outre, les préparations de propagation peuvent être stockés dans le congélateur pendant des années avant immunocoloration, et donc les laboratoires peuvent développer un référentiel des étalements de chromosomes congelés qui peut être utilisé lorsque de nouvelles questions se posent ou biologiques nouveaux réactifs de coloration deviennent disponibles. Le procédé d&#39;étalement de chromosomes est le plus couramment utilisé en combinaison avec une immunocoloration et la microscopie à fluorescence à grand champ, mais il est également possible de préparer des lames pour les méthodes microscopiques super-résolution légers tels que l&#39;épuisement de l&#39;émission stimulée (STED) microscopie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

L&#39;apparition de germes de propagation dépend de façon critique de l&#39;équilibre entre la fixation du chromosome et de compactage. Même lorsque les réactifs sont correctement équilibrées, la variation dans le degré de compactage de chromosome peut se produire dans différentes régions de la même lame et / ou entre les différentes lames. Ainsi, la qualité des spreads dans une région donnée d&#39;une diapositive devrait être évaluée avant que les images sont interprétées. Les effets de &quot;, étalée&quot; et &quot;underspreading&quot; peuvent être illustrés en utilisant des anticorps contre les protéines de recombinaison méiotique. Dans la figure 1, les noyaux méiotiques sont à double immunocolorées pour les deux protéines eucaryotes de change brin Rad51 et DMC1 et contre-colorées avec du DAPI pour l&#39;ADN. Deux exemples de noyaux de manière optimale répartis sont présentés dans la figure 1A. Figure 1B montre un exemple d&#39;un noyau underspread et des exemples figure 1C de deux noyaux disséminée. Noteque moins de foyers de Rad51 et DMC1 sont observées dans les deux plus et underspread noyaux par rapport à propager correctement noyaux. Dans le cas des noyaux underspread, certains foyers sont floues parce que l&#39;échantillon est pas suffisamment plat. De plus, l&#39;accessibilité epitope peut contribuer à l&#39;incapacité de détecter tous les foyers. En outre, le plus petit diamètre de la propagation peut empêcher la résolution de structures rapprochées. Dans le cas des noyaux qui peupla, protéine peut être perdu à cause de la fixation insuffisante et / ou le traitement de détergent excessive. Variations de la méthode standard peuvent éviter l&#39;utilisation de Lipsol. La version originale de la méthode décrite par étalement Loidl et al. fait usage de Lipsol, un laboratoire de bienséance verrerie détergent 1. Bien que ce détergent est actuellement utilisé pour le chromosome d&#39;étalement dans de nombreux laboratoires, la formulation d&#39;origine est plus disponible dans le commerce et le produit actuellement commercialisé sous ce nom a été reformulé. Far ailleurs, la formule originale pour Lipsol est également pas disponible (Franz Klein, communication personnelle). Dans un effort pour remédier à ce problème, nous avons réalisé des expériences dans lesquelles le détergent NP40 disponible dans le commerce et de constitution chimique définie a été utilisé à la place de Lipsol; cette modification du protocole standard a été trouvé pour obtenir des résultats satisfaisants pour une expérience dans laquelle se propagent les noyaux méiotiques ont été colorées pour Rad51 et Zip1, un composant de la région centrale de la synaptonémal complexe (figure 2A). Fait intéressant, le remplacement de la solution Lipsol avec le même volume de dH 2 0 également donné des résultats satisfaisants (figure 2B). Bien que ces résultats indiquent que la méthode d&#39;étalement décrit ci-dessus peut être utilisé avec succès sans Lipsol, il est possible que certains résultats décrits précédemment dépendent de l&#39;utilisation de Lipsol et ne seront reproductibles que si NP40 ou H 2 0 est utilisé à sa place. Un individu apprendre la méthode d&#39;épandage might choisir raisonnablement commencer par utiliser NP40 et / ou H 2 O à la place de Lipsol. Dans le cas où des difficultés sont rencontrées, l&#39;enquêteur peut demander à une aliquote de Lipsol d&#39;un laboratoire qui a obtenu un stock de réactif avant qu&#39;il a été arrêté; Lipsol était bon marché et le montant minimum on pouvait commander était suffisante pour générer des millions de diapositives. Procédé d&#39;étalement est adapté à une utilisation avec des procédés de microscopie de lumière super-résolution. Le complexe synaptonémal se compose de deux éléments latéraux linéaires axiales / chacun qui organise une paire de chromatides sœurs dans un ensemble de tableaux de boucle, avec la base de chaque boucle lié à un élément. Pachytène chromosomes ont synapsed paires d&#39;éléments latéraux tenues en parallèle à une distance de 100 nm par les protéines qui forment la zone centrale du complexe synaptonémal. Ces éléments latéraux appariés ne peuvent être résolus par microscopie à champ large à épifluorescence classique, mais peuvent être résolus par super-resolutionméthodes de tion. Sur la figure 3, un noyau pachytene est représenté qui est souillé avec le même anticorps pour la protéine Zip1, utilisé pour l&#39;expérience de la figure 2. L&#39;échantillon a été également colorées pour les protéines Red1, un composant d&#39;éléments latéraux axiaux /. Le résultat révèle que l&#39;anticorps reconnaît Zip1 la région de liaison de l&#39;élément latéral de Zip1, plutôt que l&#39;alpha-hélicoïdal allongé enroulé bobine domaine qui se trouve entre les régions de liaison à l&#39;élément latéral. Ainsi, le motif de coloration observé avec cet anticorps Zip1 révèle les voies parallèles des éléments latéraux appariés. La distribution des foyers Red1 le long des éléments latéraux est relativement peu par rapport à Zip1 foyers, mais la méthode de coloration à double Red1 montre que les foyers se situent en général à proximité des trajectoires linéaires définies par Zip1 foyers. Ces résultats sont en accord avec des travaux antérieurs, dans lequel le même procédé d&#39;étalement a été utilisé pour préparer des échantillons pour l&#39;analyse par microscopie électronique; la structure tripartite de l&#39;échantillon synaptonémallex est préservé lors de la procédure d&#39;étalement. L&#39;image représentée sur la figure 3 a été généré par microscopie STED 9. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig1.jpg" /> Figure 1: Exemples de noyaux de propagation noyaux méiotiques colorées pour DMC1 (vert), Rad51 (rouge), et de l&#39;ADN (DAPI, bleu).. Bar = 1 um. (A) 2 exemples de noyaux de manière optimale répartis. (B) Un exemple d&#39;un noyau underspread. (C) Deux exemples de noyaux disséminée. L&#39;exemple sur la gauche est un noyau dans lequel seule la partie supérieure est couvrit. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig2.jpg" /> Figure 2: noyaux méiotiques préparés sans utilisation de Lipsol Diffuser noyaux méiotiques des étapes indiquées colorées pour Rad51 (rouge),.Zip1 (vert), et de l&#39;ADN (DAPI, bleu). Notez que le compactage des chromosomes qui se produit en tant que cellules de transition de Leptonema pachytène est largement préservée. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig3.jpg" /> Figure 3: Visualisation du complexe synaptonémal par microscopie STED Un noyau pachytene colorées pour Zip1 (vert) et Red1 (rouge).. Les données ont été traitées en utilisant le plugin DeconvolutionLab ImageJ 10 à courir 100 itérations en utilisant le modèle Richardson-Lucy avec un PSF STED mesurée.

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K vues.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Vidéo: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

Fabrication de dispositifs en PDMS et modification de surface

Recherche

Biologie

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purification des mitochondries de cellules de levure

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Méthode d&#39;insertion de levure Colony

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunocoloration des Disséqué coeur embryonnaire Zebrafish

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

L&#39;avidité d&#39;un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.