This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

NOTA: Alcune fasi del protocollo di seguito richiedono che lavora in una cappa aspirante pulito. Inoltre, il metodo richiede un microscopio di dissezione lievito tetrad dotato di un obiettivo 10X distanza di funzionamento lunga monitorare spheroplasting. Il microscopio dovrebbe essere istituito nel cofano prima del tempo. Rimuovere il braccio micromanipolatore e portatarga dal campo di applicazione e inserire questi elementi in un luogo sicuro, lontano dalla zona di lavoro. 1. Preparazione di sferoplasti <ol><li> Crescere lievito in condizioni desiderate. Uso circa 2 x 10 8 cellule per ogni campione, ad esempio 4 ml di una coltura a OD600 = 1,4 5 x 10 7 cellule / ml. Sebbene trasformazione immediata di campioni può essere preferibile in alcuni casi, per la maggior parte delle applicazioni, aliquote di cellule possono essere conservate in ghiaccio per 8 ore prima di essere elaborato. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e di spin in una centrifuga clinica a fissare 5 (2345 giri / 857,5 xg) per 3 minuti per far sedimentare le cellule. </li&gt; <li> Decantare il mezzo facendo attenzione a non perdere le cellule dal pellet. Risospendere delicatamente le cellule in tampone ZK 1 ml e aggiungere 40 ml 1 M ditiotreitolo (DTT). Incubare 2 min con miscelazione delicata. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). </li><li> Pellet Risospendere nel buffer ZK 1 ml. Aggiungere 5 ml di una soluzione appena preparata di 100T zymolyase che è stato accuratamente miscelati. Incubare per 20-30 minuti a 30 ° C per rimuovere la parete cellulare e produrre sferoplasti. </li><li> Analizzare una goccia 10 ml di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio per determinare se spheroplasting è completa. Le cellule viste al microscopio dissezione senza un vetrino. Le cellule devono apparire gonfio e rotondo, piuttosto che un po &#39;allungata e dovrebbero lisare seguito all&#39;aggiunta di 20 ml di acqua. Se le cellule non riescono a lisare, restituire il campione a 30 ° C e ri-test ogni 10 minuti fino a quando l&#39;acqua indotta lisi è facilmente osservabili. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). </li><li> Risospendere delicatamente e lavare cellule pellet in 2,5 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Cellule pellet come prima (vedi punto 1.2). Risospendere delicatamente pellet di cellule in 300-400 ml freddo MES / tampone sorbitolo. Le celle possono essere tenuti in ghiaccio in questa fase per diverse ore. </li></ol> 2. Diffondere Cromosoma NOTA: Le superfici di vetro su cui si diffondono, sia cromosomi diapositive o coprioggetto-dovrebbe essere preparata in anticipo. Ogni diapositiva o coprioggetto devono essere immersi in acqua, poi EtOH, poi lasciato asciugare e lucidato con carta per lenti. Se cromosomi saranno distribuite su vetrini, il vetrino deve essere apposto su un vetrino con nastro adesivo o mastice. Se non diversamente indicato, il resto del protocollo descriverà diffusione sia su un vetrino o coprioggetto <ol><li> Usando una pipetta P20, pipetta 20 ml di sospensione cellulare sulla superficie di un vetrino pulito. </li><li> Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 40 ml di PFA / soluzione di saccarosio 3% e mescolare delicatamente la solution da &quot;agitando&quot; il vetrino con la mano fino a quando le linee Schlieren scompaiono. Mettere vetrino sotto il microscopio e confermano che le cellule sono a fuoco. La soluzione PFA deve essere appena preparata nella cappa il giorno di utilizzo. NOTA: Se la proteina di interesse non è stato esaminato con il metodo precedentemente, è consigliabile preparare diapositive utilizzando soluzioni contenenti 2 e 4% PFA per determinare se la ritenzione della proteina è sensibile alle condizioni di fissazione. Una soluzione / di saccarosio 4% PFA viene utilizzato nei casi in cui è auspicabile visualizzare microtubuli di tubulina associati. Lo svantaggio della maggiore concentrazione fissativo è che i cromosomi saranno &quot;underspread,&quot; 2% PFA tende anche a produrre cromosomi &quot;underspread&quot;. </li><li> Usando una pipetta P200, aggiungere 80 ml di 1% Lipsol, agitare come prima per miscelare soluzioni più completamente possibile, avviare un timer. Se Lipsol non è disponibile, 80 microlitri 1% NP40 o 80 ml ​​dH 2 O possono esseresostituito (vedi Rappresentante dei risultati, figura 2). </li><li> Guarda con attenzione e delicatamente le cellule agitare il vetrino ogni 15 secondi. Quando circa l&#39;80% delle cellule ha lisato (scomparsi) fermare il timer, rimuovere immediatamente il vetrino da microscopio, aggiungere 80 ml di PFA / soluzione di saccarosio, e agitare per mescolare. Lysis dovrebbe verificarsi di tra 30 e 90 sec dopo aver avviato il timer. NOTA: Se più diapositive mostrano lisi a circa lo stesso tempo, si può eventualmente omettere monitoraggio microscopico per il resto delle diapositive e semplicemente il tempo accuratamente periodo tra aggiunta di lipsol e l&#39;aggiunta della parte aliquota finale del fissativo. Tuttavia, questa scorciatoia è affidabile soltanto durante la preparazione più diapositive dallo stesso campione. E &#39;meglio monitorare lisi di ciascun campione microscopicamente quando diverse diapositive sono preparati da campioni prelevati in momenti diversi o da culture diverse. </li><li> Posizionare il vetrino su una superficie piana e pulita e diffondere il liquido su tutta la surfac unfrostede della slitta con il lato di un pulito monouso pipetta pascolo tenuto sotto del menisco del &quot;pozza&quot;, ma al di sopra della superficie della slitta stessa, cioè. non &quot;rastrello&quot; la superficie del vetrino con la pipetta. Non riutilizzare pipetta su diapositive diverse per evitare la contaminazione dei campioni. </li><li> Lasciare i vetrini ad asciugare durante la notte nella cappa. Componenti nucleari insolubili si depositerà sulla superficie di scorrimento e si legano ad esso. Per grandi esperimenti, pianificare l&#39;uso dello spazio per la fase di asciugatura è importante. </li><li> Una volta essiccato, i risultati migliori si ottengono procedendo alla fase immunocolorazione lo stesso giorno. Tuttavia, la soluzione di saccarosio essiccato incorpora i cromosomi diffusione in un &quot;miele&quot; che permette congelamento dei campioni: vetrini possono essere trasferiti ad una cassa scorrevole plastica e conservati a -20 ° C per anni. </li></ol> 3. Immunostaining <ol><li> Immergere i vetrini in 0,2% Foto-Flo per 30 sec. per rimuovere il miele. Diapositive Lean Onun bordo, con il bordo di riposo su un tovagliolo di carta per rimuovere residui Photo-Flo. </li><li> Immergere i vetrini in 1x TBS per 5 minuti per lavare. Rimuovere il liquido in eccesso appoggiandosi diapositive su uno spigolo, ma non lasciarli asciugare. </li><li> Posare diapositive glassato lato alto, pipetta 300 ml di TBS / BSA sul vetrino attraverso la porzione unfrosted della diapositiva. </li><li> Incubare in una camera umida a temperatura ambiente per 15 min. (Grande contenitore di plastica rivestito con acqua satura di tovaglioli di carta sotto una lastra di metallo o di plastica scivolo box traforata con tovaglioli di carta saturi). </li><li> Drain diapositive appoggiando una breve bordo del vetrino su un tovagliolo di carta e appoggiato la slitta contro un supporto appropriato (ad esempio un tubo cremagliera test). Non lasciare asciugare la superficie. </li><li> Applicare immediatamente 80 ml di tampone TBS / BSA contenente la diluizione appropriata di anticorpo primario. Se l&#39;anticorpo è limitante, utilizzare 40 ml e un coprioggetto mm 22 x 22. Per siero di coniglio greggio, questo è in genere tra una diluizione 1/50 e 1/500. NOTA:Eseguire titolazioni di nuovi preparati di anticorpi. La preparazione più diluita che produce segnale alto sopra sfondo è scelto. Per controllare il livello di colorazione di fondo, i nuclei devono essere preparati dal ceppo mutante di delezione appropriati e / o diapositive duplicati deve essere macchiato con siero pre-immune. </li><li> Posizionare un lucido 22 x 50 mm coprioggetto sul vetrino evitando bolle. A tale scopo, tenendo il vetrino tra il pollice e l&#39;indice sul lato lungo in posizioni vicino a uno lato corto. Tenendo il vetrino a 30 ° rispetto a scivolare, la breve lontano bordo dalle dita si abbassa fino ad appoggiarlo sul vetrino appena all&#39;interno del bordo della &quot;pozza&quot; vicino alla regione smerigliato della diapositiva. Poi abbassare lentamente il vetrino in un movimento fluido fino a quando le dita che reggono il tocco diapositiva in panchina, e poi rilasciarlo. Non tentare di regolare la posizione del vetrino, una volta che atterra. NOTA: Se spread cromosomiche sono stati preparati sucoprioggetto apposti (anziché direttamente sulla superficie di diapositive), questo campione coprioggetto rimarranno apposta sulla slitta durante la procedura di colorazione e lavaggio. Un vetrino supplementare sarà posto sulla parte superiore del vetrino campione per distribuire uniformemente la soluzione di anticorpi durante la colorazione e quindi scartato. </li><li> Posizionare i vetrini in una camera umida sigillata e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Tenendo il trasferimento bordo smerigliato i vetrini in una colorazione rack di vetrino e immergere in una vaschetta di colorazione contenente TBS. </li><li> Immergere delicatamente il vetrino su e giù per rimuovere il vetrino. Cercate di non usare troppa forza per farlo. Lavare le diapositive 2x 10 min immergendo in TBS. Togliere i vetrini dalla rastrelliera e drenare i liquidi in eccesso toccando bordo di un tovagliolo di carta. Non lasciare che la superficie asciutta. </li><li> Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere immediatamente 80 microlitri TBS / BSA contenente un 1 / 1.000 volte diluizione fluorocromo anticorpo secondario coniugato (o 40 ml con un coprioggetto 22 x 22 mm). Annunciod coprioggetto come prima e incubare a 4 ° C per 2 ore nella camera umida al buio. </li><li> Rimuovere coprioggetto come prima, scolare scivoli, e consentire superficie asciugare per 1 a 2 ore al buio. Diapositive Lean On asciugamani di carta come prima. NOTA: se la diffusione è stata eseguita su un vetrino montato, staccare il vetrino dalla diapositiva prima di asciugare. I vetrini vengono poi essiccati come descritto per diapositive nel passaggio precedente. </li><li> Lavorando sotto la luce soffusa, aggiungere circa 30 ml di mezzo contenente DAPI (tre 10 gocce microlitri) di montaggio e poi con attenzione abbassare un vetrino. Se gli spread sono su vetrini, posizionare le gocce di mezzo di montaggio su un vetrino pulito ed abbassare il vetrino, lato cromosoma verso il basso, sul vetrino. </li><li> Sempre sotto la luce soffusa, attendere 2 minuti per vetrino di stabilirsi e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente. Mettere i vetrini in una scatola di guida piatta. NOTA: Per la microscopia STED, montare con Prolong oro. Utilizzare 30 ml di prolungare Orosenza DAPI e permettono di curare tutta la notte. Tenuta con smalto non è necessaria. </li><li> Lettura dei vetrini di epifluorescenza widefield con 40 o un obiettivo 100X utilizzando un set di filtri appropriati per DAPI per mettere a fuoco. Facoltativamente memorizzare il vetrino al buio a 4 ° C per diverse settimane. Non congelare. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalized for each spheroplast sample by direct observation of lysis with a light microscope. To the trained eye, round spheroplasts darken as they swell before lysis; after lysis cellular remnants appear as floating &#8220;ghosts&#8221;. The combination of experimentally optimized reagent concentrations, and inter-sample standardization of timing, yields consistently well-spread nuclei. 
The choice of fluorophore and microscope used to visualize spread chromosomes depends on the desired structure. In general, spread nuclei are very thin (about 200 nm or less) and soluble protein is removed by the procedure. Thus, the reduction of out-of-focus fluorescence provided by confocal or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy yields little benefit. In fact, if manual focusing reveals staining in multiple focal planes, the nucleus is likely underspread. Although any fluorophore compatible with the microscope can be used for staining, shorter wavelength fluors will improve spatial resolution. For example, spatial resolution progressively decreases as the same structure is stained with a green (Alexa 488), red (Alexa 594), far-red (Alexa 647), or infrared (Alexa 750) fluor. This relationship should be considered in the planning and interpretation of experiments. If an even greater level of structural detail is desired, a super-resolution microscope is required. The details of the staining procedure required for each of these applications differ from those described above and the appropriate staining protocol should be followed9. 
Finally, although direct spreading of nuclei on microscope slides is relatively easy, spreading on slide-mounted coverslips yields significantly improved resolution as it avoids viewing the chromosomes through a layer of mounting medium that contains a high concentration of glycerol. Mounting coverslips on slides requires more dexterity and patience than spreading on slides, but this extra effort can be worthwhile depending on the type of structures being analyzed.

Il lievito Saccharomyces cerevisiae in erba offre numerosi vantaggi per gli studi di meccanismi molecolari di processi biologici, tra cui lo studio delle proteine ​​che controllano la funzione cromosoma. Anche se ci sono vantaggi ben noti di gemmazione di lievito per gli studi genetici, molecolari e biochimici, gli studi citologici della distribuzione delle proteine ​​nel nucleo della cellula è complicata dalla sua piccola dimensione. Il tipico nucleo lievito ha un diametro inferiore a un micron, che è solo circa 5 volte il limite di risoluzione di luce visibile. Pertanto, la quantità di informazioni sulla distribuzione delle proteine ​​nucleari che possono essere ottenuti da immunostaining convenzionale o utilizzando i tag proteine ​​fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP), è limitata. Un approccio utile per caratterizzare la distribuzione subnucleare delle proteine ​​è superficiale cromosoma diffusione. Questo approccio comporta la rimozione della parete cellulare, interrompendo cellule e membrane nucleari, ellowing il contenuto insolubili del nucleo di stabilirsi sulla superficie di un vetrino da microscopio. Questi componenti insolubili includono matrice nucleare e cromosomi. Oltre a consentire la rimozione del contenuto nucleari solubili, che aumenta la capacità di rilevare le proteine ​​legate alla cromatina, il cromosoma diffusione metodo comporta sostanziale decompressione dei cromosomi tale che i nuclei diffusione hanno diametri di circa 3 a 5 micron (per nuclei meiotica diploidi) e 2-3 micron per nuclei mitotico diploidi. Questo permette di individuare la decompressione di sottostruttura nucleare che è relativamente difficile o impossibile da risolvere nei nuclei intatti. Un difetto evidente al cromosoma diffusione è la possibilità che la procedura di diffusione può parzialmente o completamente distruggere la struttura di interesse. Di particolare interesse è che un particolare cromosoma vincolato proteina potrebbe essere perso come conseguenza della procedura diffusione. Questo potenziale shou complicazioneld essere tenuto presente quando si interpretano i dati. Un esempio di una proteina che è sensibile alla procedura di diffusione è la beta-tubulina. In alcune condizioni, il mandrino, che è composto principalmente di tubulina, viene preservata durante lo spandimento 3. Visualizzazione del mandrino è spesso utile per mettere in scena i nuclei di interesse. Tuttavia, visualizzando tubulina richiede un trattamento con un fissatore alta concentrazione; mandrini sono persi nelle condizioni standard descritte di seguito. Questo esempio dimostra che, quando si analizza la distribuzione di una proteina precedenza uncharacterized, è importante variare la concentrazione di fissativo per determinare la sensibilità del proteina è a tale variazione. Nonostante la preoccupazione per l&#39;impatto delle condizioni di diffusione sulla struttura cromosomica, l&#39;utilità e la potenza del metodo di diffusione è stata dimostrata in molti contesti e ha un ampio programma di utilità nella caratterizzazione di mitotico e, in particolare le cellule meiotiche 4-7. Two metodi di diffusione sono stati ampiamente utilizzati. Il primo di questi metodi, sviluppato da Dresser and Giroux 8, evita l&#39;uso di detergenti e può produrre preparati diffusione che sembrano avere relativamente ben conservato morfologia dei cromosomi durante la colorazione per lo specifico DNA colorante DAPI. Tuttavia, questo metodo è relativamente difficile da perfezionare e la qualità dei nuclei spread varia drammaticamente, quando una regione di una diapositiva viene confrontato con altre regioni. Questo problema può complicare approcci quantitativi che coinvolgono l&#39;imaging molti nuclei non selezionati da una diapositiva per evitare distorsioni dei dati di acquisizione. Il secondo cromosoma metodo di diffusione, sviluppato da Loidl e Klein 1, comporta bilanciamento fissazione con paraformaldeide, con lisi e decompressione cromatina promosso da una soluzione detergente. Se correttamente eseguita, questo metodo dà risultati molto riproducibili con meno variazioni da regione a regione, rispetto al metodo Dresser and Giroux. Questa presentazione si concentra su un modified versione del metodo di Loidl e Klein, a causa della sua affidabilità e semplicità. Cromosoma diffusione non è complicato o che richiede tempo; fino a 100 vetrini possono essere preparate per immunocolorazione in un solo giorno. Inoltre, i preparativi di diffusione possono essere conservati in congelatore per gli anni precedenti al immunoistochimica, e quindi i laboratori in grado di sviluppare un archivio degli spread cromosomiche congelati che può essere utilizzato quando nuove questioni biologiche sorgono o nuovi reagenti di colorazione diventano disponibili. Il metodo cromosoma diffusione è più comunemente usato in combinazione con immunocolorazione e microscopia a fluorescenza widefield, ma è anche possibile preparare vetrini per super-risoluzione leggeri metodi microscopici quali l&#39;esaurimento emissione stimolata (STED) microscopia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

La comparsa di nuclei di diffusione dipende in modo critico sul bilanciamento tra cromosomi fissazione e de-compattazione. Anche quando i reagenti sono correttamente bilanciati, variazione del grado del cromosoma de-compattazione può verificarsi in diverse regioni della stessa diapositiva e / o tra diverse diapositive. Pertanto, la qualità di spread in una data regione di un vetrino deve essere valutato prima immagini vengono interpretati. Gli effetti della &quot;invadendo&quot; e &quot;underspreading&quot; possono essere illustrati con anticorpi contro le proteine ​​di ricombinazione meiotica. Nella figura 1, nuclei meiotica sono doppie immunostained per le due proteine ​​eucariotiche cambio filo RAD51 e DMC1 e contatore colorate per DNA con DAPI. Due esempi di nuclei sparsi ottimale sono mostrati nella Figura 1A. Figura 1B mostra un esempio di un nucleo underspread ed esempi Figura 1C di due nuclei overspread. Notache un minor numero di focolai di Rad51 e DMC1 si osservano in entrambi oltre e underspread nuclei rispetto a diffondere correttamente nuclei. Nel caso di nuclei underspread, alcuni foci sono fuori fuoco perché il campione non è sufficientemente piana. Inoltre, epitopo accessibilità può contribuire al fallimento di rilevare tutti i focolai. Inoltre, il diametro più piccolo della diffusione può precludere risoluzione di strutture ravvicinati. Nel caso di nuclei overspread, proteina può essere perso a causa di fissaggio insufficiente e / o il trattamento detergente eccessiva. Variazioni del metodo standard può evitare l&#39;uso di Lipsol. La versione originale del metodo descritto da diffondere Loidl et al. si avvale di Lipsol, un laboratorio di proprietà vetreria detergente 1. Anche se questo detergente è attualmente utilizzato per il cromosoma diffusione in molti laboratori, la formulazione originaria non è più disponibile in commercio e il prodotto attualmente venduti sotto questo nome è stato riformulato. Fnoltre, la formula originale per Lipsol non è disponibile (Franz Klein, comunicazione personale). Nel tentativo di superare questo problema, abbiamo condotto esperimenti in cui il detersivo NP40 disponibili in commercio e chimica definita è stato utilizzato al posto di Lipsol; questa modifica del protocollo standard è stato trovato per dare risultati soddisfacenti per un esperimento in cui diffondono nuclei meiotica sono state colorate per Rad51 e ZIP1, un componente della regione centrale del sinaptonemico complesso (Figura 2A). È interessante notare, sostituendo la soluzione Lipsol con lo stesso volume di dH 2 0 anche dato risultati soddisfacenti (Figura 2B). Sebbene questi risultati indicano che il metodo di diffusione sopra descritto può essere impiegato con successo senza Lipsol, è possibile che alcuni risultati precedentemente descritti dipende dall&#39;utilizzo di Lipsol e non saranno riproducibili se viene usato NP40 o H 2 0 al suo posto. Un individuo imparare le diffusione mi metodoght ragionevolmente decidere di iniziare utilizzando NP40 e / o H 2 O al posto di Lipsol. Nel caso in cui si incontrano difficoltà, l&#39;investigatore può richiedere una aliquota di Lipsol da un laboratorio che ha ottenuto una riserva del reagente prima che fosse interrotto; Lipsol era costoso e l&#39;importo minimo si poteva ordinare era sufficiente per generare milioni di diapositive. Il metodo di diffusione è adatto per l&#39;uso con super-risoluzione metodi microscopia ottica. Il complesso sinaptonemico costituito da due elementi lineari assiali / laterali ciascuna delle quali organizza una coppia di cromatidi fratelli in una serie di matrici di loop, con la base di ogni ciclo legato ad un elemento. Cromosomi pachytene hanno synapsed coppie di elementi laterali tenuti in parallelo ad una distanza di 100 nm da proteine ​​che formano la regione centrale del complesso sinaptonemalico. Questi elementi laterali accoppiati non possono essere risolti da microscopia convenzionale widefield epifluorescenza, ma possono essere risolti da super-risoluMetodi zione. In figura 3, un nucleo pachytene è dimostrato che è colorato con lo stesso anticorpo per la proteina ZIP1, utilizzata per l&#39;esperimento in Figura 2. Il campione è stato anche macchiato per proteine ​​Red1, un componente di elementi laterali assiali /. Il risultato mostra che l&#39;anticorpo ZIP1 riconosce la regione di legame elemento laterale ZIP1, piuttosto che l&#39;alfa elicoidale allungata coiled-coil dominio che si estende tra le regioni di legame dei laterali. Così, il pattern di colorazione osservata con questo anticorpo ZIP1 rivela i percorsi paralleli degli elementi laterali accoppiati. La distribuzione dei Red1 focolai lungo elementi laterali è relativamente scarsa rispetto agli ZIP1 focolai, ma il metodo doppia colorazione indica che Red1 focolai generalmente si trovano in prossimità dei percorsi lineari definiti da ZIP1 focolai. Questi risultati sono coerenti con il lavoro precedente in cui lo stesso metodo di diffusione è stato utilizzato per preparare i campioni per l&#39;analisi al microscopio elettronico; la struttura tripartita del sinaptonemalico complex è conservato durante la procedura di diffusione. L&#39;immagine illustrata nella figura 3 è stato generato da STED microscopio 9. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig1.jpg" /> Figura 1: Esempi di nuclei spread nuclei meiotico colorate per DMC1 (verde), Rad51 (rosso), e il DNA (DAPI, blu).. Bar = 1 micron. (A) 2 esempi di nuclei sparsi ottimale. (B) Un esempio di un nucleo underspread. (C) Due esempi di nuclei si diffuse. L&#39;esempio a sinistra è un nucleo in cui solo la parte superiore è overspread. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig2.jpg" /> Figura 2: nuclei meiotic preparati senza uso di Lipsol Distribuire nuclei meiotiche dalle fasi indicate colorate per Rad51 (rosso),.ZIP1 (verde), e il DNA (DAPI, blu). Si noti che la compattazione cromosoma che si verifica come cellule transizione da Leptonema al pachynema è largamente conservata. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53081/53081fig3.jpg" /> Figura 3: Visualizzazione del complesso sinaptonemico tramite microscopia STED Un nucleo pachitene colorate per ZIP1 (verde) e Rosso1 (rosso).. I dati sono stati elaborati utilizzando il plugin DeconvolutionLab ImageJ 10 per eseguire 100 iterazioni utilizzando il modello di Richardson-Lucy con un STED PSF misurato.

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Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Views.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS fabbricazione del dispositivo e la modifica della superficie

Ricerca

Biologia

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Lievito Colony metodo di inserimento

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.