עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM070736) ל ח Fölsch. SF אנג נתמכה על ידי בפרס STAR * מלגות לתארים מתקדמים, ו-RS קאנג נתמכה על ידי בסיס תאית ומולקולרית של תכנית אימונים מחלות (GM8061)

1. בידוד של DNA פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רעלן פנימי ללא סיגמא אולדריץ maxiprep ערכה להכנת דנ&quot;א רעלן פנימי חינם על פי פרוטוקול של היצרן. ערכה זו עובדת בשבילנו, כי זה אמין מסירה את כל ההכנות אנדוטוקסינים מ-DNA. אנדוטוקסינים כי מוזרקים עם ה-DNA לתוך גרעין התא יגרום למוות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl פנול / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) ל-DNA מערבולת מבודדים, ספין דקות 1 ב 13,000 סל&quot;ד ב microcentrifuge Eppendorf. מעבירים את השלב העליון מים לתוך צינור חדשה ולהוסיף 100 כלורופורם μl / isoamylalcohol (24:1), מערבולת ספין לעיל. מעבירים את המים בשלב העליון המכיל את ה-DNA כדי צינור חדש. צעד זה נחוץ כדי להסיר כל חלבון ה-DNA, אשר מונע סתימת המחט microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת Acetate Na (pH 6.0) לריכוז סופי של 300 מ&quot;מ ו - 2 X אתנול כרך 100%. דגירה ב -20 ° C במשך הלילה. ספין DNA עבור 20 דקות בסל&quot;ד 13,000 ב microcentrifuge Eppendorf, לשטוף פעם אחת עם 70% אתנול, ו resuspend רעלן פנימי ב-free 300 μl מים (סיגמא אולדריץ &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז ה-DNA. ריכוז ה-DNA טיפוסי טווחי 1-5 מיקרוגרם / μl. </li></ol> 2. התרבות של תאים MDCK <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים MDCK. ספירת תאים וזרעי 4 X 10 5 תאים על 12 מ&quot;מ מסננים ברור Transwell (0.4 מיקרומטר גודל הנקבוביות, קורנינג שחקן המשנה, 3460). עבור ניסוי הכולל הזרקת מדומה מלאה שני חלבונים שונים ראב מוטציה אתה צריך זרע שלושה מסננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים MDCK במדיום ממ עם 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין ו -7% (כרך / כרך) בסרום שור העובר (= התקשורת ממ צמיחה) בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת בתא basolateral מדי יום. זה מסייע בתהליך הקיטוב, כי זה מחקה את המצב של תאים אפיתל בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ימים שלאחר זריעת לבדוק מיקרוסקופ אם התאים צומחים בשכבה סגור. אם לא ניתן לזהות כל החורים monolayer, לבצע את הניסוי ביום 3. אם יש עדיין חורים, לבצע את הניסוי ביום 4. </li></ol> 3. Microinjection נוהל הודעה הזרקת Incubations <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי להכין 5 ממ מ&quot;ל צמיחה מדיה פלוס 50 mM HEPES באחד צלחת 60 מ&quot;מ x 15 עבור כל מסנן ומקום לתוך 39 ° C חממה. בנוסף, הקימו באר אחת של צלחת 12-היטב עם 1 מ&quot;ל התקשורת ממ צמיחה פלוס 50 HEPES מ&quot;מ ו 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​cycloheximide לכל לסנן, מקום לכדי 31 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ microinjection שלך התפאורה מחומם שלה 39 ° C. אנו משתמשים במיקרוסקופ הפוכה (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc) עם במה מחוממת, מטרות 10X ו 32x, ו Femtojet Eppendorf (Injectman NI2). לבסוף, לפתוח את גז חנקן טנק שמספק את שולחן אוויר עם חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל DNA עם מים מסוננים (0.2 מיקרומטר להשתמש במסנן) לריכוז סופי של 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בנפח כולל של 10-100 μl. לאחר מכן, ספין-DNA microcentrifuge Eppendorf בסל&quot;ד 13,000 למשך 30 דקות. הסרת החלק העליון מקום בצינור חדש. צעד זה מבטיח כי בעת טעינת ה-DNA שלך המדולל לתוך המחט microinjection אתה יכול לטעון DNA בצורה מדויקת &quot;נקי&quot;. ה-DNA שלך מוכן כעת microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת התאים על ידי לקיחת לסנן החוצה הראשון של צלחת תרבותה. בעזרת להב כירורגי (Blade נוצה כירורגי, נירוסטה, לא 11), לחתוך את מסנן מבעל המקום לסנן לתוך 5 מ&quot;ל, 39 ° C חם צמיחה התקשורת ממ פלוס 50 HEPES מ&quot;מ (60 x 15 מ&quot;מ צלחת). להכביד את המסנן בצלחת תרבות בלהב כירורגי השתמשת לחיתוך זה. מניחים אותו על כזה מסנן את החור של להב כירורגי המקיף את האמצעי של המסנן. מניחים צלחת התרבות שלך לבמה מחומם של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 2-3 μl של ה-DNA שלך מדולל (בקידוד זה מקרה פלסמידים VSVGts045-GFP = שליטה מדומה הזרקה) לתוך מחט microinjection (Femtotip השנייה, Eppendorf, 930000043), לסובב את מכסה המגן של המחט ולתת לו ליפול על הרצפה . כעת המחט הוא מוכן להיות מוברג לתוך המחזק שלו. לשם כך, לחץ על מקש התפריט של injectman כדי לוודא את השסתום נסגר. בורג את המחט לתוך המחזק שלו, צריך להיזהר לא לדפוק את המחט חזק מדי כמו שעלולות להוביל שבירה. כעת, לחץ על מקש התפריט שוב, P ליישם ג תמנע מדיה נשאב לתוך המחט במהלך ההליך microinjeciton. לבסוף, ברז ג&#39;ויסטיק שלך למחוק ביות מאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוריד את המחט על גבי התאים, להשתמש המטרה 10X ולהביא את המחט לתוך קרן האור מעל הנוזל. עכשיו להתמקד בתאים, להביא את הפוקוס שוב על ידי סיבוב גלגל פוקוס 180 מעלות למעלה, למצוא את המחט. לאחר מכן, לאט להזיז מחט לתוך להתמקד, ואז להביא מתוך התמקדות שוב (עובדים לקראת הבאת את התאים לתוך להתמקד שוב), להפיל מחט לתוך עבורcus שוב. חזור על הפעולה עד שהמחט נוגעת את פני השטח של התקשורת, ובשלב זה כל מה שאתה רואה זה הילה. כאשר אתם מגיעים לנקודה שבה התאים הם בפוקוס, אבל המחט היא עדיין מטושטשת (כלומר מן המטוס מוקד) שינוי המטרה 32x והגדרות גס בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת Z-להגביל ידי נגיעה קרום apical עם קצה המחט ואת הפחתת כ -10 מיקרומטר כמו הגרעינים מניחים כ 10 מיקרומטר מתחת קרום apical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתגדיר את מגבלת-z, למצוא את הלחץ הנכון זריקה. התחלה ב 95 PSI. אם הלחץ גבוה מדי, התאים שלך יתפוצץ. אם הלחץ שלך הוא נמוך מדי, תראו נקודה לבנה שנשאר, אבל שום דבר אחר לא קורה. עם זריקה מוצלחת, תראה שינוי פאזה ללא שינוי גודל התא. עבור הזריקה, להביא את המחט כמה מיקרונים מן המטוס מוקד כמה שיותר מהר. מטרת עם המחט מעל הגרעין (כלומר באמצע תא יחיד), ולחץ על כפתור הזריקה של הג&#39;ויסטיק שלכם, אבל לא לחיצה ארוכה על לחצן למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 100-500 תאים בתוך החור של להב כירורגי שלך שוכב על התאים שלך. כשתסיים, במקום בתאים שלך עם המנה תרבות להב כירורגי לתוך 39 ° C האינקובטור, דגירה של 2 ח במהלך תקופה זו, VSVGts045-GFP מתבטא מופרש לתוך חדר המיון. עם זאת, 39 ° C, VSVGts045-GFP לא יכול להתקפל כראוי ולכן לא יכול לעזוב את חדר המיון. בינתיים, GTPase קטן של הריבית להצטבר cytosol של שיתוף הזרקת ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, במקום התאים שלך לתוך 1 מ&quot;ל התקשורת ממ צמיחה פלוס 50 HEPES מ&quot;מ ו 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​cycloheximide בצלחת 12-באר ו דגירה עבור 2 שעות ב 31 ° C. במהלך תקופה זו מרדף, VSVGts045-GFP יהיה לקפל כראוי, לעזוב את ER ו מועבר פני התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.10 עבור מסנני שני (להזריק פלסמידים קידוד VSVGts045-GFP ו-V5 למשל מתויג Rab13T22N) ושלושה (להזריק פלסמידים קידוד VSVGts045-GFP ו-V5 למשל מתויג Rab13Q67L). כל זריקה ייקח בערך 20-60 דקות. עם זאת, חשוב בהחלט להתייחס בכל דרך לסנן אותו לאורך כל המשמרת incubations טמפרטורה מכתים פני השטח עד שאתה לתקן את התאים. לאחר קיבוע, אתה יכול לבצע את שאר פרוטוקול מכתים שלך כל המסננים באותו זמן. </li></ol> 4. Surface מכתים לניתוח immunofluorescence שים לב, כדי למנוע הלבנת של האות של ה-GFP VSVGts045-GFP, להגן על דגימות מן האור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום במהלך כל ההליכים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ברצונך לבצע מכתים השטח, המקום התאים בצלחת תרבות לצלחת מתכת על הקרח ולשטוף תאים 1X עם קרח קר PBS 2 + (PBS [0.2 גר &#39;/ ליטר KCl, 0.2 גר&#39; / ליטר KH 2 PO 4 שלך, 8 גר &#39;/ ליטר NaCl, ו 2.17 גר&#39; / ליטר Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] בתוספת 0.1 גר &#39;/ ליטר CaCl 2 ו - 0.1 גר&#39; / ליטר MgCl 2 x 6 H 2 O). לאחר מכן, מקום 30 μl של נוגדן זה מזהה את ectodomain של החלבון שלך, במקרה זה את העכבר נוגדן חד שבטי TK1 (IgG 1, המתקבל המנוח תומס קרייס), על parafilm נקי דגש על צלחת המתכת על הקרח. הנח את המסנן עם תאים שלך הפוך על ירידה ולהוסיף כמה טיפות של נוגדן על הישבן של המסנן. דגירה עבור h 1 על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים המקום לתוך צלחת 12-באר, לשטוף 3X עם קרח קר PBS 2 + (או RT חם PBS 2 + ללא מכתים לפני השטח), ולתקן עם paraformaldehyde 3% עבור 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעם עם PBS 2 + ולהשאיר ב PBS 2 + דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים חסימת / חיץ permeabilization (גוש הפרמטרים BPB) (2% [wt / כרך] BSA, 0.4% [wt / כרך] saponin ב PBS 2 +) עם 10% [כרך / כרך] בסרום עז. דגירה 1 ש &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים העיקרית לזהות הביעו ראב GTPase, בדוגמה זו אנטי V5 (עכבר חד שבטיים נוגדנים IgG 2a, Invitrogen), 1:200 של גוש הפרמטרים BPB. ספין נוגדנים מדולל microcentrifuge Eppendorf במשך 10 דקות בסל&quot;ד 13,000. מקום 30 μl של הפתרון נוגדן על parafilm נקי להציב בחדר רטוב. מניחים את התאים על מסנן הפוך על ירידה נוגדנים ואת דגירה של 1 ש &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום התאים בחזרה (עד צד ימין) לתוך צלחת 12-היטב ולשטוף 5X מעל 30 דקות עם גוש הפרמטרים BPB ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל משני נוגדנים מתאימים, עז במקרה זה אנטי עכבר IgG 1 אלכסה 594 שכותרתו (עבור VSVG זיהוי על פני השטח, Invitrogen), ו Cy5 שכותרתו נוגדנים משני להכיר GTPase ראב שלך, עז זה למשל אנטי עכבר IgG 2a Cy5 שכותרתו (ImmunoResearch ג&#39;קסון), 1:200 לתוך גוש הפרמטרים BPB ספין לעיל. מקום 30 μl פתרון נוגדן על parafilm נקי בחדר רטוב ותאי מקום על הפוך מסנן מטה אל טיפת נוגדן. דגירה 1 ש &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים תאים 3X מסנן למים מקום deionized ו rבצד מעלה ight על microslides. הוסף 10-15 הר μl (10% [wt / כרך] DABCO, 50% [wt / כרך] גליצרול במים מזוקקים) על גבי התאים. 18X18 מ&quot;מ מקום לכסות מיקרו זכוכית על גבי ושימוש ברקמות הפנים בעדינות העיתונות זכוכית לכסות מיקרו על התאים. חותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות במיקרוסקופ confocal. השתמשנו LSM Microsystem 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc אשר היה מצויד עדשה 63X טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת דמויות, להתאים ולשלב תמונות באמצעות תוכניות כגון Adobe Photoshop ו - Adobe Illustrator. </li></ol> 5. נציג תוצאות לדוגמאות על אופן שיתוף ביטוי GTPases קטן מפריע VSVG מיון חביב מתייחסים מאמרים שפורסמו עבור missorting או apical 3, 4 או עיכוב משלוח פני 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. בשנת הזרקת מעושה, כלומר זריקה של קידוד רק פלסמיד VSVGts045-GFP, החלבון מועבר אל פני השטח basolateral היטב מקוטב תאים MDCK כמו להישפט על ידי צביעת השטח (באדום, איור 1). שים לב שלא כל VSVGts045-GFP מועברת הממברנה basolateral במהלך מרדף על 31 מעלות צלזיוס כפי שמעידים האות תאיים נרחב החלבון הכולל (בירוק, איורים 1 A ו-B). בתאים שאינם היטב מקוטב VSVGts045-GFP תימסר גם הממברנה apical (איור 1 ב &#39;). אם דגימות השליטה שלך נראים כמו התא B באיור 1, אתה לא יכול לסמוך על הנתונים יש לחזור על הניסוי עם יותר מקוטב תאים. ברים הם סולם 5 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השלבים הקריטיים ביותר עבור ניסוי מוצלח microinjection הם איכות וטוהר של ה-DNA ואת הקוטביות של התאים שלך. ללא תאים מקוטב, שליטה זריקה שלך כבר mistargeted VSVG ואת הניסוי לא ניתן להשתמש. אם ה-DNA הוא באיכות ירודה, ה-DNA עשויה להדביק את מחט הזריקה המוביל עניים או כל ביטוי של החלבון הרצוי כלל. כמו כן, מומלץ להשתמש פלסמידים ביטוי ידועים להוביל רמות ביטוי גבוה כגון pRKV. אם אתם רוצים לבדוק למיון של חלבונים מטען אחר, משמרת את הפרוטוקולים טמפרטורה יכול להיות שונה. לדוגמה, כדי להביע בצפיפות נמוכה קולטני ליפופרוטאין, אנו מבצעים את microinjection ב 37 ° C ואחריו הדגירה h 1 ב 37 ° C, 4 שעות בטמפרטורה של 20 ° C (כדי לעצור את המטען בתוך TGN) ו 2 ב 37 שעות מעלות צלזיוס בנוכחות cycloheximide מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​0.1 לרדוף את החלבון אל פני השטח. במשך כמה חלבונים כגון קולטני FC, זמן הדגירה על 20 ° C עשוי להיות הוריד ל 2 שעות תלוי כמה מהר חלבון המטען שלך הוא מסונתז ונוסע דרך מסלול הפרשה. לקבלת תיאור מפורט של incubations שאנחנו משמשים החלבונים מטען שונה לראות נוקס et al. 2008 7. לבסוף, פרוטוקול זה יכול לא רק לשמש לניתוח GTPases קטן, אך בתיאוריה לכל חלבונים או קטעי חלבונים שאתה חושד עשוי להיות פונקציה של משלוח (מקוטב) על פני השטח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Axiovert 200 מיקרוסקופ עם שלב מחומם </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> סדר מותאם אישית </td></tr><tr><td> Injectman NI2 micromanipulator Femtojet </td><td> Eppendorf </td><td> סדר מותאם אישית </td></tr><tr><td> Femtotips II (מחטים Microinjection) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader טיפים </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> נקה 12 מ&quot;מ transwell לסנן תומך </td><td> קורנינג שחקן המשנה </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> רעלן פנימי ללא ערכת פלסמיד maxiprep </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

תאים אפיתל לקטב הממברנה הפלסמטית שלהם לתוך תחומים apical ו basolateral ביוכימית וברור תפקודית שם תחום apical פניהם &#39;חינם&#39; משטחים את הממברנה basolateral נמצא במגע עם המצע לבין תאים שכנים. שני תחומים מופרדים על ידי קרום צמתים הדוקים, המהווים מחסום דיפוזיה. Apical-basolateral קיטוב ניתן סיכם בהצלחה בתרבות כאשר לתאי האפיתל כגון כליה מדין-דארבי כלב (MDCK) התאים זורעים בצפיפות גבוהה על מסנני פוליקרבונט בתרבית במשך כמה ימים 1 2. הקמה ותחזוקה של הקוטביות בתא מוסדר על ידי מערך של GTPases קטן superfamily ראס כגון RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ו Rab13 3 4 5 6 7. כמו כל החלבונים האלה GTPases מחזור בין המדינה התמ&quot;ג הנכנס פעילים מדינה פעיל GTP הנכנס. מוטציות ספציפיות באזורים מחייב נוקלאוטיד להפריע זה רכיבה על אופניים 8. לדוגמה, Rab13T22N נעול לצמיתות בצורה תוצר ועל כך לכינוי &quot;דומיננטי שלילי&quot;, בעוד Rab13Q67L כבר לא יכול hydrolyze GTP ו נעול ולכן במצב &quot;פעיל דומיננטי&quot; 7. כדי לנתח את תפקידם בתאים אללים דומיננטי פעיל הן שליליות הדומיננטי של GTPases באים לידי ביטוי בדרך כלל ברמות גבוהות להפריע לתפקוד של חלבונים אנדוגניים 9. דרך אלגנטית להשיג רמות גבוהות של overexpression בסכום זמן קצר היא להציג את פלסמידים קידוד החלבונים הרלוונטיים ישירות לתוך הגרעינים של תאים בוגרים מקוטב על מסנן תומך באמצעות טכניקה microinjection. זה לעתים קרובות בשילוב עם הזרקת המשותפת של פלסמידים כתב המקודדים קולטנים הממברנה הפלסמטית כי ממוינות במיוחד לתחום apical או basolateral. המטען משמש לעתים קרובות כדי לנתח מטען מיון לתחום basolateral הוא אלל טמפרטורה רגיש של גליקופרוטאין וירוס שלפוחי stomatitis (VSVGts045) 10. חלבון זה לא יכול להתקפל כראוי על 39 מעלות צלזיוס, ובכך להישמר ב reticulum endoplasmic (ER), ואילו חלבון הרגולציה של הריבית התאספו cytosol. לעבור 31 מעלות צלזיוס לאחר מכן לאפשר VSVGts045 להתקפל כראוי, לעזוב את ER ולנסוע הממברנה פלזמה 11. מרדף זו מבוצעת בדרך כלל בנוכחות cycloheximide למנוע סינתזת חלבון נוספת מובילה לתוצאות הניקוי. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את ההליך של microinjecting פלסמידים לתאים מקוטב incubations העוקבים לרבות משמרות טמפרטורה המאפשרים ניתוח מקיף של חלבונים רגולטוריים המעורבים מיון basolateral.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

מאמר זה מפרט את ההליכים הכרוכים overexpression וניתוח של GTPases קטן בתאי האפיתל מקוטב באמצעות טכניקה microinjection.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

analyzing-function-small-gtpases-microinjection-plasmids-into

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  Northwestern University. מאמר זה מפרט את ההליכים הכרוכים overexpression וניתוח של GTPases קטן בתאי האפיתל מקוטב באמצעות טכניקה microinjection.

Video: Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג'ין

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

Microinjection Intranuclear של דנ"א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

דור של הטרנסגניים