עבודה זו נתמכה על ידי NIH כדי להעניק NS042197 MD. AJK נתמך על ידי מענקים T32GM008719 ו F30NS068006.

1. הפקה של מחטים Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מפוברק מחטים microinjection זמינים מסחרית (לדוגמה. Femtotips מ Eppendorf) ו שימושיים אם לא מבצע מספר רב של microinjections. עם זאת, עבור אלה שרוצים להקים לטווח ארוך יכולות microinjecting, אלטרנטיבה היא לייצר מחטים microinjection במעבדה באמצעות קיר דק בורוסיליקט זכוכית נימים חולץ מחט מסחרי. זה גם מאפשר את הצורה של מחטים להיות מגוונות, אשר יכול להיות שימושי עבור תאים מסוגים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פולר Narishige PC-10 Microinjection מחט, לצרף את כל ארבעת משקולות להשתמש בתוכנית צעד אחד מושך (1 הגדרה שלב) עם הגדרת החום היחסי ב 58.0 (דוד מס &#39;2). הקפידו למקם את גוף החימום במרכזו של כל נימי כך שתי מחטים וכתוצאה מכך הם באורך דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כמה נימים (כ 2 נימים עבור כל חלבון של עניין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים חנות במיכל בעת היותו בטוח לא לפגוע קצה המחט. חומרים כגון קצף או Blu-Tack ניתן להשתמש במיכלים להחזיק מחטים microinjection. </li></ol> 2. הכנת תערובות חלבון עבור הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ microinjection 10x המכיל 1 M אשלגן כלוריד 0.1 M אשלגן זרחתי (KPI) חוצץ (תערובת equimolar של K 2 HPO 4 ו - KH 2 PO 4) ב-pH של 7.4. מאגר זה יכול להיות מאוחסן לטווח ארוך בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הזריקה, צבע פלואורסצנטי כמו rhodamine-dextran צריך להיות הוסיף. מדולל חיץ microinjection the10x במים לפזר rhodamine-dextran אבקת לעשות microinjection 5x חיץ תמיסה המכילה 20-40 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​rhodamine dextran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחנות זו פתרון בחושך ב 4 ° C. זה צריך להספיק עד 100 ההכנות פתרון יחיד חלבון. צבעים אחרים, כמו והעמסת isothiocyanate-dextran יכול להחליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ציטוכרום מניות ג ידי המסת מטוהרים ציטוכרום C במים בריכוז של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. חנות ציטוכרום C ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך ולהימנע להקפיא להפשיר מחזורים ידי אחסון של ציטוכרום C (~ 10 μL) aliquots קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת חלבון 10 μL להזרקה על ידי שילוב של 2 microinjection μL חיץ 5x המכיל rhodamine-dextran עם מים μL 3 ו 5 ג ציטוכרום μL ריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ציטוכרום C במאגר 1x (100 מ&quot;מ KCl, 10 mM KP אני, 4-8 מ&quot;ג / מ&quot;ל rhodamine dextran). </li></ol> 3. Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום C <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני microinjection, בצנטריפוגה תערובת של ציטוכרום C ו חיץ microinjection ב g 16,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד כל חומר חלקיקי אשר עשויים לסתום מחטים microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, להפעיל את microinjector לאפשר לחץ האוויר לבנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת של תאים במרכז הבמה מיקרוסקופ ולהגדיר את הפוקוס על התאים. כדי למזער את כמות הזמן כי התאים נשמרים מחוץ לחממה, התאים מוחזרים בדרך כלל החממה בתוך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 0.5-1 μL מפני השטח העליון של התערובת לתוך החלבונים בקצה הקהה של נימי. היזהר שלא פיפטה כל החלקיקים אשר היו centrifuged לחלק התחתון של הצינור. תוך דקה, את תערובת חלבון תפיץ אל קצה המחט דרך פעולה נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את המחט היטב לבעל נימי של micromanipulator ואת המיקום את המחט כך קצהו עובר האור המועבר של המיקרוסקופ בכ זווית של ° 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מיקום קצה המחט, כך שהוא ממוקם ישירות במרכז של שדה הראייה. כדי למרכז את המחט, השתמש micromanipulator להזיז את המחט תוך מבט מבעד לעינית המיקרוסקופ. הצל מחט צריך להיות גלוי. כוון את המחט כך הצל שלה נראה רק חצי אחד של שדה הראייה, המציין את קצה המחט ממורכזת מעל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את microinjector למצב זרימה רציפה ולהגדיר את הלחץ הפועלים 20-100 hPa. כל מחט עשויה לדרוש לחץ עבודה שונים, לחץ עבודה סביר להניח שאתה צריך התאמה במהלך ההליך microinjection לשמור על זרימה קבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את מחט באמצעות כפתור גס למיקום מעל התאים. כדי לעשות זאת, להעלות את מישור המוקד של המיקרוסקופ למיקום מעל התאים. ואז להוריד את המחט לכיוון התאים באמצעות כפתור גס עד קצה המחט בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-מרכז את קצה מחט בתוך שדה הראייה ולהגדיל את ההגדלה על ידי שינוי אובייקטיבי מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוריד את המחט באמצעות unti בסדר ידית מניפולטוראני המחט הוא רק מעט מעל מישור המוקד של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את זרימת התערובת חלבון מלהסתכל הקרינה האדום של rhodamine. תערובת חלבון צריך להיות היציאה מחט כמו זרם דק מתמיד. מחטים צריך להיות מוחלף מחדש טעון אם המחט נפגעת או אם הזרימה היא חזקה מדי. לפעמים, להטות את הכוס נימי סגור ולא ניתן לראות זרימה של המחט. במקרה זה, להחליף את המחט או להוריד אותו בזהירות לתחתית צלחת תרבות קרע בעדינות את קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה המחט כך שהיא מצביעה לעבר תא בכ בזווית של ° 45. ואז בתנועה אחת חלקה, להנמיך את המחט תוך הזזת אותו לכיוון התא. בתנועה חלקה השני, מיד להפוך את הכיוון של המחט להסיר אותו מהתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מוזרק בהצלחה לעיתים קרובות מעט להתנפח והוא יכול להיות מאושרת על ידי לדמיין את rhodamine ניאון אדום בתוך התא. לעיתים, התא יהיה להזריק בטעות בגרעין, אשר יהיה גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להזריק תאים על ידי התאמת הבמה מיקרוסקופ עד כ 50-100 התאים מוזרקים. כאשר נע על הבמה מיקרוסקופ, כדי להיות בטוח להעלות את המחט microinjection כך שהוא מנקה את החלק העליון של התאים. </li></ol> 4. נציג תוצאות: Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום C מחקה השקתו של המיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס. לכן, כצפוי, fibroblasts במהירות לעבור אפופטוזיס על microinjection cytosolic של שור ציטוכרום C (איור 1A). כדי להבטיח את ההליך הזרקה לבד אינה אחראית מוות של תאים, הזרקה של שמרים ציטוכרום C משמש לשלוט חשובה, שכן שמרים ציטוכרום C אינו מסוגל להפעיל caspases 12. מעניין, שלאחר mitotic נוירונים אוהד עמידים להפליא cytosolic ציטוכרום C (איור 1B) 8,13. המעבדה שלנו זיהתה כי XIAP מעכב אנדוגני caspase הוא מעכב המפתח של הפעלת caspase בנוירונים 14. כך, נוירונים למות בעקבות הזרקת ציטוכרום c, XIAP חייב קודם כל להיות מובטל. לדוגמה, microinjection של ציטוכרום C לתוך xiap - / - נוירונים אוהדת מספיק כדי לאפשר הפעלת אפופטוזיס caspase ו בתאים אלה (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2773/2773fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום C גורם למוות מהיר fibroblasts, אך לא נוירונים. א) wild-type MEFs או (ב) יום הלידה 5 wild-type נוירונים אוהד היו microinjected עם שור ציטוכרום C (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) יחד עם rhodamine-dextran לסמן תאים מוזרקים. תמונות להראות את אותו שדה של הזרקת תאים מיד לאחר (0 שעות), או במועדים המצוין. החצים מצביעים על התאים מוזרקים. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2773/2773fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. XIAP מחסר נוירונים רגישים microinjection cytoplasmic ג ציטוכרום. אחרי לידה 5 יום נוירונים אוהד מעכברים בנוקאאוט XIAP היו microinjected עם שור ציטוכרום C (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) יחד עם rhodamine-dextran לסמן תאים מוזרקים. תמונות להראות את אותו שדה של הזרקת תאים מיד לאחר (0 שעות), או 5 שעות לאחר microinjection ציטוכרום C (5 שעות). סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116, 205-219 (2004).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mitochondria+in+apoptosis.">The expanding role of mitochondria in apoptosis.</a> Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).</li><li>Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+apoptosis.">The biochemistry of apoptosis.</a> Nature. 407, 770-776 (2000).</li><li>Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+structures+that+shape+caspase+activity,+specificity,+activation+and+inhibition.">The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition.</a> Biochem. J. 384, 201-232 (2004).</li><li>Tait, S. W., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cell+death:+outer+membrane+permeabilization+and+beyond.">Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).</li><li>Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+microinjection+of+cytochrome+c+is+caspase-dependent+and+is+inhibited+by+Bcl-2.">Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2.</a> Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).</li><li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+induction+of+apoptosis+by+microinjection+of+cytochrome+c.+Bcl-XL+has+activity+independent+of+cytochrome+c+release.">Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release.</a> J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).</li><li>Deshmukh, M., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+novel+event+during+neuronal+death:+development+of+competence-to-die+in+response+to+cytoplasmic+cytochrome+c.">Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c.</a> Neuron. 21, 695-705 (1998).</li><li>Vaughn, A. E., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+inhibits+apoptosis+in+neurons+and+cancer+cells+by+redox+inactivation+of+cytochrome+c.">Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).</li><li>Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+apoptosis+by+Bcl-2:+release+of+cytochrome+c+from+mitochondria+blocked.">Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.</a> Science. 275, 1129-1132 (1997).</li><li>Gonzales, D. H., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+mitochondrial+c-type+cytochromes.">Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes.</a> J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).</li><li>Ellerby, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+cell-free+system+of+neuronal+apoptosis+-+comparison+of+premitochondrial,+mitochondrial,+and+postmitochondrial+phases.">Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases.</a> J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).</li><li>Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+cytochrome+c+activity+within+intact+neurons+inhibits+apoptosis.">Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis.</a> J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).</li><li>Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+function+of+endogenous+XIAP+in+regulating+caspase+activation+during+sympathetic+neuronal+apoptosis.">Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).</li><li>Estus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+neurons+during+programmed+cell+death:+identification+of+c-jun+as+necessary+for+neuronal+apoptosis.">Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).</li></ol>

כל הליכי הניסוי על בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש באוניברסיטת צפון קרוליינה.

Microinjection של ציטוכרום C ישירות לתוך הציטופלסמה של תאים הוא כלי ייחודי ורב עוצמה המאפשר ללימודי תקנה שלאחר המיטוכונדרי של אפופטוזיס. חשוב לציין, טכניקה זו מאפשרת הפעלה ישירה של הזרם אפופטוזיס של המיטוכונדריה ללא שימוש בחומרים אשר גורמים נזק הסלולר או המיטוכונדריה. בעוד פרוטוקול זה התמקדה microinjection של ג ציטוכרום ללימודים על אפופטוזיס, העקרונות הכלליים של microinjection חלבון המוצגת כאן יכול לשמש גם עבור חלבונים אחרים בעלי עניין. לדוגמה, חוקרים מסוימים השתמשו microinjection של נוגדנים היעד חלבונים ספציפיים, כגון ציטוכרום C או C-יוני במחקרים של אפופטוזיס 13,15. הקושי הנפוץ ביותר במהלך microinjection היא סתימת מחטי microinjection במהלך ההליך. אם המחט הופך סמיך, אפשר להשתמש בפונקציה &quot;נקי&quot; על microinjector ששולחת דופק לחץ חזק דרך המחט לגרש חלקיקים לחסימת הפתיחה מחט. לעתים קרובות, מנקה את המחט די unclog את המחט. עם זאת, אם נראה צבע היציאה מחט במהלך &quot;נקי&quot;, אך מיד עוצר שוב, הדבר מצביע על כך שהלחץ עובד על microinjector עלול להיות נמוך מדי. במקרה זה, להגביר את הלחץ בעבודה עד זרימה רציפה של המחט נראה שוב. ניקוי מחט לא תמיד לשחזר את הזרימה, ובמקרה כזה צריך מחט הסיכוי הטוב ביותר להיות מוחלף. אחת הטכניקות אשר יכול לשמש כחלופה, במיוחד אם את החומר הזריקה עצמה יקר, כרוך בעדינות לשבור את קצה המחט microinjection נגד התחתון של המנה בתרבית רקמה. אם נעשה בזהירות, זה יכול להגדיל את הפתיחה של המחט, תשחזר לזרום. עם זאת, סדק גדול בפתיחת מחט יגרום לשחרור מסיבי של צבע מאכל לתוך התרבות, טשטשו את הנוף של תאים. למרבה הצער, לא כל סוגי התאים מסוגלים להיות microinjected. כמה תאים (למשל נוירונים גרגיר cerebellar) הם קטנים מדי עבור microinjection. תאים אחרים (למשל cardiomyocytes מבוגרים), בעוד מספיק גדול, לא יכול לעמוד בפני הליך ההזרקה ולמות גם עם זריקות שליטה. כפי שתואר לעיל, microinjection של שמרים ציטוכרום C משמש שליטה שימושי מאז שמרים ציטוכרום C אינו מסוגל להפעיל caspases. תאים microinjected עם שמרים ציטוכרום C לא תפעיל אפופטוזיס אלא אם כן הוא בשל ההליך microinjection עצמו. לבסוף, כמה תאים (פיברובלסטיים למשל) יכול לעמוד microinjection אבל יכול להיות קשה להזריק בגלל מורפולוגיה שטוח שלהם. כתוצאה מכך, קיים סיכון כי את המחט microinjection ישבור נגד התחתון של המנה בתרבית רקמה עם תאים כל מוזרק. Micromanipulators אוטומטי או ידני יכול לשמש microinjection חלבון, עם כל מערכת שיש יתרונות וחסרונות. Micromanipulators אוטומטי נוח כי אפשר להגדיר רמה Z-ציר שאליו מחט microinjection הוא הוריד באופן אוטומטי עבור הזרקת תאים. תכונה זו שימושית במיוחד כאשר הזרקת תאים אשר גובה דומה ברחבי monolayer תרבות התא. עם זאת, עבור תאים אשר בתרבית על מנות מצופה, (נוירונים למשל מצופה על קולגן מצופה מנות), אופי תלת ממדי של תרבויות אלה עושה הגדרת רמה מסוימת Z-ציר מייגע. עבור תרבויות אלה, micromanipulators ידנית הם יתרון מאז את המחט במהירות יכול להיות מותאם לגובה מסוים של כל תא. Microinjection ניתן טכניקה קשה אב ידרוש בפועל. בנוסף, את הטכניקה של microinjection יש מספר מגבלות. לדוגמה, רק חלק קטן של תאים בצלחת תרבית רקמה ניתן להזריק. כך, ההכנות ביוכימי שבו התרבות כולה נאסף (lysates תא למשל עבור המערב כתם) אינם ייצוג מדויק של התאים מוזרקים לבד. במקום זאת, רוב הניסויים צריך להסתיים בדרג מתא בודד. עם זאת, פעם אחת הטכניקות הבסיסיות המוצגים כאן הם שולטים, ניתן לבצע סדרה ייחודית של ניסויים כדי לבחון את ההשערות כי לא ניתן לענות באמצעות שיטות אחרות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> DM IRE2 מיקרוסקופ הפוך </td><td> לייקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-10 מחט Microinjection פולר </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MWO-202 Micromanipulator </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet Microinjector </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קיר דק Boroscilicate נימי זכוכית עם Microfilament </td><td> AM מערכות </td><td> 615000 </td><td> 4 סנטימטר אורך, 1.00 מ&quot;מ קוטר חיצוני, קוטר פנימי 0.75 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Rhodamine isothiocyanate B-dextran </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> R9379 </td><td> משקל מולקולרי ממוצע ~ 70,000 Da </td></tr><tr><td> שור ציטוכרום חלבון ג </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3131 </td><td></td></tr></tbody></table>

activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c

אפופטוזיס או מות תאים מתוכנת, הוא מסלול שימור פיקוח הדוק שבאמצעותם תאים מתים 1. אפופטוזיס יכול להיות מופעלות כאשר תאים המפגש מגוון רחב של מדגיש ציטוטוקסיות. עלבונות אלה ליזום מפלי איתות כי בסופו של דבר לגרום לשחרור ציטוכרום C מהחלל intermembrane המיטוכונדרי אל הציטופלסמה 2. שחרורו של ציטוכרום C מתוך המיטוכונדריה היא אירוע שמפעיל את מפתח ההפעלה המהירה של caspases, פרוטאזות הסלולר המפתח אשר בסופו של דבר לפועל מוות של תאים 3-4. מסלול של אפופטוזיס מוסדר בנקודות במורד הזרם של שחרור ציטוכרום C מתוך המיטוכונדריה 5. על מנת ללמוד את תקנה שלאחר המיטוכונדרי של הפעלת caspase, חוקרים רבים פנו microinjection cytoplasmic ישירה של holocytochrome ג (heme המצורפת) חלבונים לתוך התאים 6-9. ציטוכרום C הוא מקומי בדרך כלל המיטוכונדריה שם הקובץ המצורף של קבוצת heme הוא הכרחי כדי לאפשר לה להפעיל אפופטוזיס 10-11. לכן, כדי להפעיל ישירות caspases, יש צורך להזריק את החלבון holocytochrome ג במקום cDNA שלו, כי בעוד ביטוי של ציטוכרום C מתוך בונה cDNA תגרום המיקוד ואת המיטוכונדריה מצורף heme, זה יהיה מוחרם מ caspases cytosolic. לפיכך, microinjection cytosolic ישירה של חלבון מטוהרים heme המצורפת ג ציטוכרום הוא כלי שימושי לחקות לשחרר המיטוכונדריאלי ציטוכרום C ו אפופטוזיס ללא שימוש עלבונות רעילים אשר גורמים נזק הסלולר המיטוכונדריה. במאמר זה, אנו מתארים שיטה microinjection של החלבון ציטוכרום C לתוך התאים, באמצעות העכבר fibroblasts עובריים (MEFs) ו נוירונים אוהד העיקרי כדוגמאות. בעוד פרוטוקול זה מתמקד הזרקה של ג ציטוכרום לחקירות של אפופטוזיס, טכניקות המוצג כאן ניתן להתאים בקלות עבור microinjection של חלבונים אחרים בעלי עניין.

Watch this Scientific Journal Video about Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c at JoVE.com

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את microinjection cytoplasmic ישירה של ציטוכרום<em&gt; ג</em&gt; החלבונים לתוך fibroblasts ונוירונים אוהד העיקרי. טכניקה זו מאפשרת המבוא של ציטוכרום<em&gt; ג</em&gt; החלבונים לתוך הציטופלסמה של תאים מחקה את שחרורו של ציטוכרום<em&gt; ג</em&gt; מן המיטוכונדריה, אשר מתרחשת במהלך אפופטוזיס.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

activation-of-apoptosis-by-cytoplasmic-microinjection-of-cytochrome-c

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

17.3K Views.  University of North Carolina. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את microinjection cytoplasmic ישירה של ציטוכרום ג החלבונים לתוך fibroblasts ונוירונים אוהד העיקרי. טכניקה זו מאפשרת המבוא של ציטוכרום ג החלבונים לתוך הציטופלסמה של תאים מחקה את שחרורו של ציטוכרום ג מן המיטוכונדריה, אשר מתרחשת במה?...

Video: Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious agents, and the development of artheriosclerotic plaques.   In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.  Central to these studies is CD1d - the antigen presenting molecule that presents glycolipids to NKT cells.  The advent of CD1d tetramer technology, a technique developed by the Kronenberg lab, is critical for the sorting and identification of subsets of specific glycolipid-reactive T cells.  Mitch explains how glycolipid agonists are being used as therapeutic agents to activate NKT cells in cancer patients and how CD1d tetramers can be used to assess the state of the NKT cell population in vivo following glycolipid agonist therapy.  Current status of ongoing clinical trials using these agonists are discussed as well as Mitch's prediction for areas in the field of immunology that will have emerging importance in the near future.

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmunity, clearance of infection, and the development of artheriosclerotic plaques. In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.

ראיון: Antigen Presentation Glycolipid ידי CD1d ואת הפוטנציאל הטיפולי של הפעלת התא NKT

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

סינתזה של<em&gt; ב-vivo</em&gt;-MRI לגילוי אפופטוזיס בדיקה

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...