עבודה זו נתמכה על הרולד ויילה י Mathers פרס G. לHL ומענק NIH (R24 GM080527) לRESCEJ ידי היה דוקטורים עמית NRSA (NIH F32GM9037222) והוא נתמך כיום מדען פיתוח פרס מחקר מודרך מהלאומי על ידי מכון להזדקנות (K01AG04435). ברצוננו להודות לביקורות על הערותיו מועילות.

.1 הכנת פלסמיד דנ&quot;א, מחטים, וכלי הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פלסמיד דנ&quot;א באמצעות ערכת High Speed ​​מקסי או מידי ולהתרכז DNA ל2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באמצעות משקעים אתנול. גלולה DNA צריכה להיות מומסת במים ללא יוני nuclease חינם. אחסן את הדנ&quot;א ב10-20 aliquots μl ב -20 מעלות צלזיוס. (ראה טבלת משלים 1 לרשימה של וקטורים זמינים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן מנה הזרקה באמצעות agarose לבנות שוקת להחזקת עוברים בצלחת פטרי 100 x 15 מ&quot;מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית מיקרוסקופ 75 x 50 זכוכית לתוך 100 x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי בזווית. יוצקים כ 50 מ&quot;ל של 2% מומס agarose במדיום הידרה 24 לתוך צלחת פטרי. , לחלופין לשפוך agarose לתוך הצלחת הראשונה ולצוף &quot;עובש Microinjection דגים&quot; על גבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את שקופית הזכוכית או העובש. אם שקופיות זכוכית שימשה, לחתוך agarose העודף עם bla גילוחדה ליצירת קיר. יוצקים בינוני הידרה לתוך הצלחת ולהשתמש בו באופן מיידי או לשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. ניתן לעשות שימוש חוזר מנות הזרקה אם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בין שימושים: הערה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטים מנימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה על חולץ micropipette באמצעות התנאים הבאים: לחמם 525, למשוך 75, מהירות 100, זמן 50. חנות המחטים על ידי לחיצה על אותם לתוך רצועה צרה של חימר בצלחת פטרי באופן שהם במקביל מוחזק לתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את פתרון ההזרקה, לשלב 3 μl של 2.5 מ&quot;ג / פתרון פלסמיד דנ&quot;א מ&quot;ל עם 2 μl של 10% פנול אדומים. מערבולת הפתרון לזמן קצר ולאחר מכן לסובב אותו עבור 10 דקות במהירות המרבית בmicrocentrifuge כדי להסיר כל חלקיקים שעלולות לסתום את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, קליפ המחט כמה מילימטרים מהקצה עם מלקחיים כדי ליצור פתח קטן. הערה: יש גמישות מסוימת בגודל המתאים של פתוחing כי הלחץ יכול להיות מותאם בשלב 3.3 ליתאים למגוון הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי, כך שהוא מחזיק את המחט במצב אנכי עם את הקצה. טען את המחט עם כ 0.5 μl של פתרון הזרקה ידי pipetting את הנוזל לתוך הקצה האחורי של המחט. לאפשר פעולת נימים למשוך את הפתרון לקצה המחט. </li></ol> 2 הכנת עוברים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על בסיס יומי לסרוק תרבות זן הידרה AEP לפוליפים בייצור ביצים. לאסוף פוליפים אלה ולהגדיר אותם בצד בצלחת תרבות נפרדת. שים לב פוליפים אלה כל כמה שעות במהלך היום כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות ביצה. כאשר ביצים לפרוץ את האאקטודרם ולשבת על טבעת של תאי ectodermal חזרו בו הם מוכנים להזרקה 25. הנח פוליפים אלה בצלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים במשך שעה לפחות 1 לפני ההזרקה כדי לאפשר הפריה. הידרה &lt;/ Em&gt; זכרים ישחררו זרע ללא כל מניפולציה מיוחדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נשים נמצאות במושבה AEP עם ביצים בנויות באופן מלא, שהם כ 400 מיקרומטר בקוטר 25, או 1 לעוברי שלב 8 תאים, גם לאסוף אלה להזרקה. מייד להזריק עוברים שנכתבו על דבקות. הערה: לא ניתן להבחין בהבדל בין ביצים בנויות באופן מלא וzygotes חד תאי, ובכך אלה צריכים להיות מודגרות עם זכרים לפני ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההזרקה, להסיר את רוב רקמת ההורים מעל ומתחת לעובר באמצעות אזמל עם להב # 15. השאר רק את העובר עם חתיכה קטנה של טור גוף המצורף, כדי לשמש כדי לתפעל את העובר עם מלקחיים במידת צורך. הערה: הרקמה שגזורה מאת העובר יהיה להתחדש וצריך להישמר כדי להבטיח שנשים יישארו במושבה הידרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, להעביר עוברים למנת ההזרקה, סידר אותם במקביל לקיר שלשוקת agarose. </li></ol> .3 Microinjection של פלסמיד דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר microinjector על דוכן מגנטי שיושב על צלחת ברזל. הר בעל ההזרקה, המהווה את החלק של microinjector שמחזיק את המחט, על micromanipulator ג&#39;ויסטיק. הר מניפולטור ג&#39;ויסטיק לצלחת הברזל, עם דוכן מגנטי. מניחים כל המכלול הזה בצד ימין של מיקרוסקופ לנתח ומקם את בעל ההזרקה כך שזה נראה לעין בתחום התצפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת ההזרקה עם עוברים מתחת למיקרוסקופ לנתח, אוריינטציה כך שהקיר האנכי של שוקת agarose הוא בצד השמאל. הכנס את המחט לתוך מחזיק ההזרקה ולהוריד את קצה המחט לתוך מדיום הידרה בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לסובב את הידית של המזרק בכיוון השעון עד ששמן מינרלים ממלא את החלק העליון של המחט וזרם קבוע של פתרון הזרקה הוא ציין יציאת המחט לתוך hydrבינוני. אם הזרם חזק מדי, צריך להוריד את הלחץ על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון. לתרגל את הצעד הזה כדי להשיג לחץ מתאים, אשר תלוי בגודל של פתיחת המחט (כלומר, איך המחט הייתה מוצמדת בשלב 1.5) באופן שיגרתי. הערה: אם הזרם חזק מדי, העובר לא ישרוד את הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הצפייה באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להעביר את צלחת ההזרקה כך שהעובר הראשון הוא במרכז השדה. להזיז את המחט כך שהוא נוגע בעובר ש. השתמש micromanipulator כדי לחדור את העובר עם המחט. הערה: הקיר האנכי של שוקת agarose ישמור את העובר מהדחיפה הצידה על ידי המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון ההזרקה לזרום אל תוך שניות 1 או 2 עובר ולאחר מכן הסר את המחט במהירות. אם העובר יש תא אחד או יותר, להזריק כל תא בנפרד. שימוש במלקחיים לארגון מחדש של העובר כדי ליישר את התא הבא עם קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אמברי הראשוןo מוזרקת, להזיז את הצלחת כדי שהעובר הבא הוא בעמדת הזריקה ולחזור על התהליך; תמשיך עד שכל העוברים כבר הזריק. </li></ol> .4 Culturing ובקיעה של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל העוברים הוחדרו לתוך צלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים (זה הוא להבטיח כי כל העוברים הם מופרה). דגירה עובר בחממת C ° 18 בעוד הם ממשיכים עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא הגיע לשלב שהציפורן, לעבור כל עובר מוזרק ולבודד של צלחת 24 גם מלאה בינוני הידרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר המוזרקת ל2 שבועות בחושך ב18 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 2 בשבוע, לבדוק כל עובר מוזרק מתחת למיקרוסקופ לנתח. שים לב כל המקרים שבהם עובר ציפורן בשלב ניתק מהפיסה הקטנה של רקמת הורים ורקמת ההורים כבר התאחתה. הסר פוליפ מחדש זה מייד, כך שהוא לא מילstaken לגוזל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת של עוברים מוזרקים תחת אור אקווריום ב RT. בדוק את הצלחות בכל יום ולאסוף גוזלים. גוזלים חדשים יהיו לבנים כי הצבע הוורוד האופייני לפוליף הידרה מגיע מהארטמיה שהם אוכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לגוזלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות ביטוי transgene. </li></ol>

<ol>
	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra.">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li><li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation.">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li><li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells.">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li><li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning.">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li><li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+genome+of+Hydra.">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li><li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra.">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li><li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra.">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li><li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation.">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li><li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals:+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra.">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li><li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity.">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li><li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

הידרה מתרבה באופן שגרתי לא מינית, אבל דורשת גירויים סביבתיים כדי להתחיל תאי מין הפקה. גירויים אלה אינם מוגדרים היטב עבור רוב מיני הידרה ועשויים להיות שונה מזן לזן. המשוכה משמעותית לייצור של הידרה המהונדס היא קבלת עוברים על בסיס קבוע, כי זה יכול להיות קשה בסביבת מעבדה כדי לגרום להידרה להפוך מיני. זן AEP 25, לעומת זאת, מייצר תאי מין בקלות במעבדה וזה המתח היחיד שהיה בשימוש עד כה לביצוע קווים מהונדסים. השיטה הנפוצה ביותר לגרימת ייצור תא מין היא על ידי מניפולציה דיאטה. כפי שתואר לעיל, צריכים להיות מוזנים בעלי החיים מדי יום במשך שלושה שבועות, מורעב במשך 5 ימים, והאכילו אז פעמיים בשבוע, שבמהלכו תאי מין זמן יופק 1. גם זה היה הניסיון שלנו שculturing AEP הידרה על צלחות אנכיות באקווריום 26, אולי לדמות מורסביבה טבעית דואר, מוביל לייצור ביצים, גם כאשר בעלי חיים ניזונים במרווחי זמן קבועים. בנוסף, קווים המתקבלים מצלבים עצמיים AEP לפעמים לייצר תאי מין יותר באופן קבוע ממתח ההורה. כך הקמת קו F1 של AEP היא עוד שיטה אפשרית להשגת מקור אמין יותר של עוברים. אחוז העוברים ששורדים הזרקה ולפתח לבמה לציפורן תלויה בבריאותם של העוברים, הסכום של פתרון מוזרק, ואת כמות הנזק שנגרמה על ידי ההזרקה. עם הגדרת זרימת הזרקה הקבועה שתוארה בפרוטוקול זה, שקשה לשלוט בכמות הפתרון שמוזרקת לתוך העובר. בידיים שלנו, כמחצית מהעוברים מוזרקת כפי שמתואר כאן עובר שלם בהצלחה ויוצר לציפורן. מתוכם, 50-75 צוהר% ושל אלה צוהר ש, 50 כ% יהיו לפחות כמה רקמות מהונדסים. לכן, 10-20% מהעוברים בתחילה הזריקו להניבהידרה F1 עם רקמה מהונדס. הסכום של פתרון המוזרק ניתן לשלוט במדויק עם ציוד יקר יותר כגון microinjector IM-300. הקווים מהונדסים המקוריים נעשו עם ציוד מאפנדורף, המאפשר מידה רבה של דיוק במניפולציה והזרקת העובר. בעוד רמה זו של דיוק עשויה לתת שיעור הישרדות גבוה יותר של עוברים מוזרקים, הוצאה זו אינה הכרחית להקמת שגרה של קווים מהונדסים. השילוב של transgene הוא אקראי ועלול להתרחש במקומות רבים בגנום או במערך מקביל במקום אחד. בהתבסס על ניתוח כתם דרום, מספר האינטגרציות נאמד בחמש בשורה אחת אפיתל מהונדס שנוצרה בעבר 1. בקו מהונדס שושלת ביניים שבו את הגן עובר שידור בתאי מין, זה הודגם על ידי רצף הגנום שרק עותק יחיד של transgene היה integrated (CE דנה ורי סטיל, תצפית לא פורסם). עם זאת, מלבד שתי דוגמאות אלה, יש אתרים אין מידע זמין לגבי transgene אינטגרציה ולהעתיק מספר. כיוון שניתן שtransgene עלול להפריע תפקוד גן על ידי mutagenesis insertional, יותר משורה אחת מהונדס צריך להיעשות בעת ניתוח פנוטיפים מ, למשל, מבני RNAi או ביטוי יתר. כמו כן, חשוב לציין כי ביטוי transgene מכונן הוא כאשר מונעים על ידי האמרגן הגן אקטין הנפוץ, ובכך transgenes שתוביל לפנוטיפים חמורים או קטלניים כאשר הביע constitutively לא יישמר. לעתיד, זה יהיה חשוב לפתח מערכת מושרה של ביטוי transgene לעקוף בעיה זו.

הידרה נעשתה שימוש כדי ללמוד התחדשות, היווצרות דפוס, ותאי גזע עבור כ 250 שנים 2 יש הידרה תכנית גוף פשוטה המורכבת של שושלות שלושה תאים:. אפיתל ectodermal, אפיתל endodermal, וביניים. הגוף צינורי נוצר על ידי ectodermal ושושלות אפיתל endodermal, כל אחד מהם הוא שכבת תא בודדת. כל תאי האפיתל בעמודת הגוף הם mitotic. כאשר תאי האפיתל הם עקורים לגפיים 3, הראש (פה וזרועות) בסוף הפה או ברגל (הדיסק הבסיסי) בסוף aboral, הם יעצרו בשלב G2 של מחזור התא ולשנות תא גורל 4. התאים של שושלת ביניים מתגוררים בתוך החללים שבין תאי האפיתל. שושלת זו נתמכת על ידי תאי גזע multipotent הנמצאים בשכבת האפיתל ectodermal של העמודה גוף 5. תאי גזע ביניים מעוררים שלושה cel סומטייםסוגי l (עצבים, תאי בלוטה, וnematocytes) ותאי הנבט 6,7. כחבר המיון הצמחי Cnidaria, קבוצת האחות לכל bilaterians, הידרה יכולה לשפוך אור על תהליכים ביולוגיים בסיסיים המשותפים בין בעלי חיים רב תאיים. עד לאחרונה, מאמצים אלה הקשו על ידי החוסר של שיטות אמינות להפרעות של תפקוד גן. עם זאת, עם התפתחותה של המתודולוגיה מהונדס 1, אנו יכולים לנצל את מלוא יתרונות של הידרה כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים המשותפים לבעלי חיים רב תאיים, כגון תפקוד תאי גזע, התחדשות, ודפוסים עכשיו. קווים המהונדס הידרה נקבעים על ידי הזרקה של DNA פלסמיד לעוברי, מה שגורם אינטגרציה אקראית וביטוי chimeric בתדירות משמעותית של גוזלים. קו עם ביטוי אחיד בשושלת מסוימת יכול להיות שהוקם על ידי התפשטות מינית. היכולת להפיץ transg clonallyenic הידרה קווים היא יתרון על רוב המודלים של בעלי חיים, אשר יכול להיות מופץ רק על ידי רבייה מינית. בנוסף, ניתן לעקוב אחר תאים מהונדסים בקלות in vivo בשל השקיפות של בעלי החיים והעדר חלבוני ניאון אנדוגני 8. בשבע השנים שחלפה מאז קווי הידרה מהונדסים הראשונים נעשו 1, קווים כאלה היו בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים. ביטוי של חלבוני ניאון בתאים מסוגים שונים, הפך אותו ניתן לעקוב אחר תנועת תא, לצפות בשינויים בצורת תא, ולעקוב אחר גורל תא הן בתנאים מסוג בר ולאחר ההפרעות כימיות 1,5,9-12. בנוסף, ביטוי של חלבוני ניאון שונים בשושלות השונות מאפשר לבידוד FACS של אוכלוסיות תאים ספציפיות. טכניקה זו הייתה בשימוש כבר הרצף של mRNAs הספציפי בתאי הגזע וRNA הקטן השושלת הספציפית 13,14. בעוד האמרגן שלאחד משני הגנים אקטין הידרה כבר בשימוש נרחב ביותר, יזמים מסוימים כמה תאים מסוג זוהו ולהשתמש בכונן ביטוי של GFP בהידרה המהונדס 9,11,15,16. בעתיד, יזמים ספציפיים תא מהסוג יאפשר לתצפית והאיסוף של כל סוג תא מסוים. בנוסף, גישה מהונדס הייתה בהצלחה המשמשת להגדרת האלמנטים רגולטוריים cis-בפועל של אמרגן Wnt3 17. פיתוח שיטות מהונדסים בהידרה מספק גישה חזקה לבדיקת תפקודם של גנים על ידי ביטוי מחוץ לרחם, ביטוי יתר, ומציאה. בעלי חיים מהונדסים נעשו שמבטאים חלבוני fluorescently- מתוייגים על מנת לבחון שתי פונקציה ולוקליזציה סלולרית 18-20. בנוסף, הביטוי של סיכות ראש RNA ב3&#39;UTR של transgene GFP מוביל למציאה של גני המטרה 21,22. בגישות אלה נדרש GFP לזהותולעקוב אחר הרקמות מהונדסים במהלך היצירה של הקו המהונדס. עם זאת, סביר להניח כי במקרים מסוימים מולקולת GFP הייתה מפריעה לתפקוד של החלבון מתויג. מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי ניתן לארגן גני הידרה בתצורת אופרון, כלומר, תעתיקי polycistronic נעשים, אשר לאחר מכן הם מופרדים על ידי בנוסף, מנהיג שחבור טרנס ותורגמו בנפרד 23. על ידי הצבת גן קידוד חלבון או סיכת ראש RNA במצב במעלה הזרם של אופרון וגן חלבון פלואורסצנטי בעמדה במורד הזרם, אחד יכול לעקוב אחר רקמות מהונדסים מבלי לתייג את הגן המקודד את חלבון סיכת הראש או RNA. שיטה זו נעשתה שימוש כדי להביע את סיכת ראש RNA בתצורת אופרון עם DsRed2 על מנת להשיג גן מציאה 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AEP Hydra Strain</td>
			<td style="width:112px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:576px;">Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Speed Maxi Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:112px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection Fish Mold</td>
			<td style="width:112px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FM-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Borosilicate Glass with Filament</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-50-10</td>
			<td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers Forceps, Durmont #5</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Blade #15</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-822-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IM-9B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron Plate</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

הקמת קווי הידרה מהונדסים להאכיל את הגוזלים מהונדסים כל 2-3 ימים עם Nauplii הארטמיה. גוזלים לפעמים לא אוכלים ליום או ימים לאחר הבקיעה. כמה גוזלים חדשים לעולם לא לאכול, ולכן לא ישרדו. אם הגוזל הוא מהונדס באו ectodermal (איור 1 א) או רקמת האפיתל endodermal, לאפשר את בעל החיים לניצן ולאסוף את הניצנים שיש לי הרקמה המהונדס ביותר (איור 1 ב, ג). תמשיך לעשות את זה עם הניצנים החדשים עד קו מהונדס הוא הקים עם ביטוי אחיד של transgene באו ectodermal (1D איור) או שושלת אפיתל endodermal. במקביל, שורה שנייה ניתן לקבוע כי אינו מכילה את הגן, אבל הוא בדרך אחרת זהה מבחינה גנטית (איור 1). קו זה משמש כביקורת שלילית לניסויים עתידיים. אם הרקמה המהונדס לא זזה אניn כדי ניצן, זה לפעמים ניתן לחתוך את בעלי החיים ולאפשר לו להתחדש באופן שהרקמה המהונדס תהיה באזור הניצנים החדש. עם זאת, אם הרקמה המהונדס היא קרובה מדי לגפיים סביר להניח שיאבדו כפי שהוא נעקר במהלך הצמיחה הנורמלית של בעלי החיים. לעתים קרובות אין שום דבר שניתן לעשות במקרה זה. בידיים שלנו, אם את הגן הוא ניטראלית (כלומר, אין השפעה על תפקוד ביולוגי) אנו מסוגלים להקים קו אפיתל אחיד מכ 30% מהידרה שפתח עם רקמה מהונדס אפיתל. 70% הנותרים או למות או הרקמה המהונדס הולכת לאיבוד. שורת endodermal היא כ 2-3 פעמים נפוצות כמו שורת ectodermal. אם נעשה שימוש בtransgene שמשבשת את הפונקציה ביולוגית, עשוי להיות לכך השפעה על ההיתכנות של הקמת קו אחיד. במקרים כאלה, יזמים מושרה יהיו תוספות חיוניות לארגז הכלים. אם הגוזל הוא מהונדסבשושלת ביניים, לאפשר את בעל החיים לניצן ולאסוף את הגוזלים עם מספר גדל והולך של תאים מהונדסים בשושלת ביניים. להיות מודע לכך שלפעמים זה לא ברור מייד שבעלי חיים הוא מהונדסים בשושלת ביניים, במיוחד אם הוא גם מהונדס בשושלת אפיתל. זה מאוד לא סביר כי קו לחלוטין מהונדס בשושלת ביניים יוקם פשוט על ידי ניצנים. אם יש צורך שבשושלת ביניים להיות מהונדס באופן מלא, זה יכול להתבצע על ידי שיבוט באגרגטים מבעלי חיים מדולדלי תאי גזע ביניים כך שכל השושלת הוקמה מתאי גזע מהונדסים יחידים 7. במקרים בהם יזם ברקמה או סוג התא ספציפי משמש לנהוג ביטוי של חלבון פלואורסצנטי, בעלי חיים מהונדסים לא יכולים להיות ברורים בהתחלה. לדוגמא, אם אמרגן שפעיל רק בזרועות משמש והתיקון הראשוני של מהונדסרקמה בעמודת הגוף, לא תאי ניאון יהיה לראות בגוזל. אז כל הגוזלים צריכים להיות מופצים כדי לאפשר לרקמות מהונדסים שנעקרו לזרועות ולהיות ברורים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51888/51888fig1highres.jpg" width="500" /> איור .1 קביעת קו מהונדס עם ביטוי אפיתל ectodermal האחיד של DsRed2. () גוזל עם ביטוי chimeric של transgene DsRed2 תחת שליטה של אמרגן אקטין בתיקון של תאי האפיתל ectodermal. ניצן דור ראשון מהגוזל בפנל כעת בייצור שני ניצנים חדשים (B). יש הניצן שכותרתו עם כוכבית לא רקמות מהונדסים ושמש כבעלי החיים המייסדים לקו שליטה שהוא זהה מבחינה גנטית לקו המהונדס, פרט לנוכחות של transgene. (C) ניצן דור שניהמופק מהידרה בB. פנל (ד &#39;) דוגמא של פוליפ מהקו המהונדס שהוקם עם ביטוי DsRed2 ברחבי האאקטודרם. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51888/51888fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection at JoVE.com

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

דור של הטרנסגניים<em&gt; הידרה</em&gt; על ידי Microinjection העובר

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

13.9K Views.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

Video: Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...