Este trabajo fue financiado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (GM070736) a H. Fölsch. SF Ang fue apoyado por una beca A * Star de Postgrado, y RS Kang recibió el apoyo de las bases celulares y moleculares de la enfermedad de Programa de Formación (GM8061)

1. Aislamiento de ADN plásmido <ol><li> Use un libre de endotoxinas Sigma-Aldrich kit maxiprep para preparar ADN endotoxinas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Este kit funciona para nosotros, ya que elimina las endotoxinas de forma fiable a partir de preparaciones de ADN. Endotoxinas que se les inyecta el ADN en los núcleos celulares se llevan a la muerte celular. </li><li> Añadir 100 ml de fenol / chlorofom / isoamilalcohol (25:24:1) para el ADN aislado, vórtice y vuelta durante 1 minuto a 13.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf. Transferir la fase superior del agua en un tubo nuevo y añadir 100 ml de cloroformo / isoamilalcohol (24:1), vórtice y el giro que el anterior. Transferir la fase superior del agua que contiene el ADN a un tubo nuevo. Este paso es necesario para eliminar las proteínas del ADN, lo que evita la obstrucción de la aguja de microinyección. </li><li> Precipitar el ADN mediante la adición de acetato de sodio (pH 6,0) a una concentración final de 300 mm y 2 x etanol 100% vol. Se incuba a 20 ° C durante la noche. Giro de ADN durante 20 minutos a 13.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf, lavar una vez con etanol al 70%, y resuspender en 300 libre de endotoxinas l de agua (Sigma-Aldrich). </li><li> Determinar la concentración de ADN. A la concentración de ADN típico varía de 1 a 5 g / l. </li></ol> 2. Cultivo de células MDCK <ol><li> Dividir las células MDCK. Recuento de células y las semillas de 4 X 10 5 células en claro de 12 mm filtros Transwell (0,4 micras de tamaño de poro, Corning Costar, 3460). Para un experimento de control que contiene una inyección simulada y dos diferentes proteínas Rab mutante que necesita para sembrar tres filtros. </li><li> Cultura células MDCK en medio MEM con 2 mM L-glutamina, 0,1 mg / ml de penicilina / estreptomicina y el 7% (vol / vol) de suero fetal bovino (= medios de cultivo MEM) a 37 ° C y CO 2 al 5%. </li><li> Cambiar los medios de comunicación en la cámara basolateral todos los días. Esto ayuda al proceso de polarización, porque se parece a la situación de las células epiteliales de los animales. </li><li> Dos días después de la siembra de verificación en un microscopio si las células están creciendo en una monocapa cerrados. Si usted no puede detectar todos los agujeros en la monocapa, lleve a cabo su experimento en el día 3. Si todavía hay agujeros, realizar su experimento en el día 4. </li></ol> 3. Microinyección Procedimiento y incubaciones de post-inyección <ol><li> En el día del experimento preparar 5 ml de medio de cultivo MEM más HEPES 50 mM en una placa de 60 mm x 15 para cada filtro y coloque en un 39 ° C incubadora. Además, estableció un pocillo de una placa de 12 pocillos con un medio de cultivo MEM ml más 50 mM de HEPES y 0,1 mg / ml de cicloheximida por filtro, y el lugar en una incubadora de 31 ° C. </li><li> Encienda el microscopio de microinyección y establecer su etapa calienta a 39 ° C. Nosotros usamos un microscopio invertido (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) con una etapa de calefacción, los objetivos 10X y 32X, y una FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Por último, abra el tanque de gas nitrógeno, que abastece a la mesa de aire con nitrógeno. </li><li> Diluir el ADN con agua filtrada (0,2 micras uso del filtro) a una concentración final de 0,2 mg / ml en un volumen total de 10 - 100 l. Posteriormente, el giro de ADN en microcentrífuga Eppendorf a 13.000 rpm durante 30 min. Quítele la parte superior y colocar en un tubo nuevo. Este paso asegura que cuando se carga el ADN diluido en la aguja de microinyección con precisión puede cargar &quot;limpia&quot; de ADN. Su ADN está listo para la microinyección. </li><li> Preparar a las células mediante la adopción de el filtro primero de su placa de cultivo. Con una hoja de bisturí (Blade pluma quirúrgica, acero inoxidable, n º 11), corte el filtro del soporte del filtro y el lugar en 5 ml, 39 ° C calentar el medio de crecimiento MEM más 50 mM HEPES (60 x 15 mm plato). Pesar por el filtro de la placa de cultivo de la hoja de bisturí que utilizó para cortarla. Colocarlo en el filtro tal que el agujero de la hoja de bisturí rodea el centro del filtro. Coloque la placa de cultivo en la etapa de calefacción del microscopio. </li><li> Carga 3.2 l de su ADN diluido (en este caso plásmidos codifican VSVGts045-GFP control = inyección simulada) en una aguja de microinyección (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), gire la tapa protectora de la aguja y la dejó caer al suelo . Ahora que la aguja está listo para ser atornillada en su soporte. Para hacerlo, pulse la tecla de menú de su InjectMan y asegúrese de que la válvula se cierra. Enrosque la aguja en su soporte, cuidado con el tornillo de la aguja con demasiada fuerza ya que puede conducir a la rotura. A continuación, pulse la tecla de menú de nuevo, la aplicación de P c evitará que los medios de comunicación de ser succionado por la aguja durante el procedimiento microinjeciton. Por último, pulse el joystick para borrar homing almacenados. </li><li> Para bajar la aguja en la celdas, utilice el objetivo de 10X y poner la aguja en el haz de luz por encima del líquido. Ahora se centran en las células, poner el foco de nuevo girando la rueda de enfoque 180 º, y encontrar la aguja. A continuación, mueva lentamente la aguja en el foco, a continuación, llevar a cabo de nuevo el enfoque (de trabajo para acercar a las células en el foco de nuevo), bajar la aguja en lacus de nuevo. Repita hasta que la aguja toca la superficie de los medios de comunicación, momento en el que todo lo que vemos es un halo. Al llegar a un punto en el que las células están en el foco, pero la aguja es aún difusa (es decir, fuera del plano focal) cambio en el objetivo de 32X y una multa ajustes gruesos. </li><li> Establecer el límite z-al tocar la membrana apical con la punta de la aguja y restando alrededor de 10 micras como los núcleos están despidiendo a unos 10 m debajo de la membrana apical. </li><li> Después de establecer el límite de z, encontrar la presión de inyección derecha. Comenzará a las 95 PSI. Si la presión es demasiado alta, las células va a explotar. Si la presión es demasiado baja, aparecerá un punto blanco que se mantiene, pero no pasa nada. Con una inyección de éxito, usted verá un cambio de fase sin cambiar el tamaño de la celda. Para la inyección, deje la aguja de un par de micrones fuera del plano focal lo más rápido posible. Apunta con la aguja por encima del núcleo (es decir, la mitad de una celda individual) y pulse el botón de inyección de su joystick, pero no mantener el botón presionado. </li><li> Inyectar 100-500 células dentro del agujero de la hoja de bisturí que se encuentra en las células. Cuando haya terminado, ponga sus células con la placa de cultivo y la hoja de bisturí en una incubadora de 39 ° C, y se incuba durante 2 horas Durante este tiempo, VSVGts045-GFP se expresa y secreta en la sala de emergencias. Sin embargo, a los 39 ° C, VSVGts045-GFP no se pliegan correctamente y por lo tanto no puede salir de la sala de emergencias. Mientras tanto, la pequeña GTPasa de interés se acumula en el citosol en los experimentos de co-inyección. </li><li> Después de 2 horas, colocar las células en 1 ml de medio de cultivo MEM más HEPES 50 mM y 0,1 cicloheximida mg / ml en una placa de 12 pocillos y se incuba durante 2 horas a 31 ° C. Durante este período de persecución, VSVGts045-GFP se pliegan correctamente, salga de la sala de emergencia y se entrega a la superficie celular. </li><li> Repita los pasos 3,1 a 3,10 para los filtros de dos (inyectar plásmidos que codifican VSVGts045-GFP y, por ejemplo-V5 etiquetados Rab13T22N) y tres (inyectar plásmidos que codifican VSVGts045-GFP y, por ejemplo-V5 etiquetados Rab13Q67L). Cada inyección de unos 20 - 60 min. Sin embargo, es absolutamente crucial para el tratamiento de todos los filtros de la misma manera a lo largo de la incubación la temperatura de cambio y tinción de la superficie hasta que fijar las células. Después de la fijación, puede realizar el resto de su protocolo de tinción para todos los filtros al mismo tiempo. </li></ol> 4. Tinción de la superficie para el análisis de inmunofluorescencia Tenga en cuenta, con el fin de evitar el blanqueo de la señal de las buenas prácticas agrarias de VSVGts045-GFP, proteger a los ejemplares de la luz cubriendo con papel de aluminio durante todos los procedimientos posteriores. <ol><li> Si desea realizar la tinción de la superficie, el lugar a las células en una placa de cultivo en una placa de metal en el hielo y lavar las células con 1X PBS enfriado con hielo 2 + (PBS [0,2 g / litro KCl, 0,2 g / litro KH 2 PO 4, 8 g / l de NaCl y 2,17 g / l de Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O], más de 0,1 g / l de CaCl 2 y 0,1 g / litro de MgCl 2 x 6 H 2 O). Posteriormente, el lugar 30 l de un anticuerpo que reconoce el ectodominio de la proteína, en este caso el anticuerpo monoclonal de ratón TK1 (IgG 1, obtenidos a partir de finales de los años Kreis Thomas), en parafina limpia colocada sobre la placa de metal en el hielo. Coloque el filtro con las células de su boca abajo sobre la gota y añadir unas gotas de anticuerpos en la parte posterior del filtro. Incubar durante 1 h sobre hielo. </li><li> Células de lugar en una placa de 12 pocillos, lavar 3 veces con PBS enfriado con hielo 2 + (o RT PBS caliente 2 + sin manchar la superficie antes), y fijar con paraformaldehído 3% durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Lave las células una vez con PBS 2 + y dejar en PBS 2 + durante 5 min. </li><li> Se incuban las células en el bloqueo / permeabilización de amortiguación (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] de saponina en PBS 2 +) con un 10% [vol / vol] de suero de cabra. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Diluir anticuerpos primarios para detectar la GTPasa Rab expresado, en este ejemplo anti-V5 (anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, Invitrogen), 1:200 en el BPB. Giro anticuerpos diluido en una microcentrífuga Eppendorf durante 10 minutos a 13.000 rpm. Colocar 30 ul de la solución de anticuerpos en parafina limpia en una cámara húmeda. Lugar de las células en el filtro al revés sobre la caída de anticuerpos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva a colocar las células (lado derecho) en una placa de 12 pocillos y lavar 5 veces durante 30 minutos con BPB a temperatura ambiente. </li><li> Diluir apropiado secundaria de anticuerpos, en este caso de cabra anti-ratón IgG 1 Alexa 594-etiquetado (por VSVG detección en la superficie, Invitrogen), y Cy5-anticuerpos secundarios marcados para reconocer su GTPasa Rab, en este ejemplo de cabra anti-ratón IgG 2a Cy5-etiquetados (Jackson ImmunoResearch), 1:200 a BPB y el giro que el anterior. Lugar 30 l solución de anticuerpos en parafina limpia en una cámara húmeda y las células de lugar en boca del filtro hacia abajo en la caída de anticuerpos. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Repita el paso 4.6. </li><li> Sumerja las células en el filtro 3 veces en agua destilada y el lugar rpor lado DERECHO en portaobjetos. Añadir 10-15 l montaje (10% [wt / vol] DABCO, el 50% [wt / vol] de glicerol en agua destilada) en la parte superior de las células. 18x18 mm lugar de vidrio cubierta de micro en la parte superior y el uso de pañuelos de papel y presione suavemente la tapa de vidrio micro a las células. Sello con esmalte de uñas. </li><li> Analizar las muestras con un microscopio confocal. Se utilizó un Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc., que estaba equipado con un lente de 63X de inmersión en agua. </li><li> Para la preparación de las figuras, ajustar y combinar imágenes con programas como Adobe Photoshop y Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Resultados representante Para ver ejemplos de cómo la co-expresión de proteínas G pequeñas interfiere con VSVG clasificación amablemente se refieren a los artículos publicados, ya sea para missorting apical 3, 4 o la inhibición de la entrega de la superficie de 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. En la inyección simulada, es decir, una inyección de sólo el plásmido que codifica VSVGts045-GFP, la proteína se entrega a la superficie basolateral de bien polarizado células MDCK a juzgar por la tinción de la superficie (en rojo, la Figura 1 A). Tenga en cuenta que no todos los VSVGts045-GFP se entrega a la membrana basolateral durante la persecución a 31 ° C como se evidencia por la señal intracelular amplia para la proteína total (en verde, las figuras 1 A y B). En las células que no están bien polarizadas VSVGts045-GFP se entregará también a la membrana apical (Figura 1 B). Si sus muestras de control de parecerse a la de células B en la Figura 1, no se puede confiar en sus datos y tener que repetir el experimento con células polarizadas mejor. Las barras de escala es de 5 micras.

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

Los pasos más importantes para un experimento de microinyección éxito son la calidad y pureza del ADN y la polaridad de las células. Sin células polarizadas, el control de la inyección ya se han mistargeted VSVG y el experimento no se puede utilizar. Si el ADN es de mala calidad, el ADN puede obstruir la aguja de inyección que lleva a los pobres o no la expresión de la proteína deseada en absoluto. Además, es aconsejable usar plásmidos de expresión que se sabe que conducen a altos niveles de expresión como pRKV. Si usted desea poner a prueba para la clasificación de las proteínas de otras cargas, los protocolos de cambio de temperatura se puede modificar. Por ejemplo, para expresar los receptores de baja densidad de lipoproteínas, se realiza la microinyección a 37 ° C seguido de una incubación de 1 hora a 37 ° C, 4 horas a 20 ° C (para detener la carga en el TGN) y 2 horas a 37 ° C en presencia de 0,1 mg / ml de cicloheximida para perseguir a la proteína de la superficie. Para algunas proteínas como los receptores Fc, el tiempo de incubación a 20 ° C puede reducirse a 2 horas depende de la rapidez de su carga de proteínas se sintetizan y se desplaza a través de la vía secretora. Para una descripción detallada de incubación que se utilizó para las proteínas de carga diferentes ver Nokes et al., 2008 7. Finalmente, este protocolo no sólo puede ser utilizado para el análisis de las GTPasas pequeñas, pero en teoría de todas las proteínas o fragmentos de proteínas que usted sospecha que puede tener una función en la prestación de superficie (polarizado).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscopio con la etapa calienta </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> La orden de encargo </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet micromanipulador </td><td> Eppendorf </td><td> La orden de encargo </td></tr><tr><td> Femtotips II (agujas de microinyección) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader consejos </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Claro de 12 mm Transwell filtro admite </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxinas libres para el plásmido maxiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Las células epiteliales polarizar su membrana plasmática en los dominios apical y basolateral de vista bioquímico y funcionalmente diferentes, donde el dominio apical se enfrenta a la &#39;libre&#39; y las superficies de la membrana basolateral está en contacto con el sustrato y las células vecinas. Ambos dominios de la membrana están separados por uniones estrechas, que forman una barrera de difusión. Apical-basolateral polarización se pueden recapitular con éxito en el cultivo cuando las células epiteliales como el riñón canino Madin-Darby (MDCK) se siembran a alta densidad en los filtros de policarbonato y se cultivan durante varios días 1 2. Establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular está regulado por una serie de pequeñas GTPasas de la superfamilia Ras como Rala, Cdc42, Tab8, Rab10 y Rab13 3 4 5 6 7. Al igual que todas las GTPasas estas proteínas del ciclo entre una inactivos PIB determinada del Estado y un Estado activo GTP. Mutaciones específicas en las regiones de unión de nucleótidos interferir con este ciclo de 8. Por ejemplo, Rab13T22N está permanentemente encerrado en el PIB de forma y por lo tanto llamado &quot;dominante negativo&quot;, mientras que Rab13Q67L ya no pueden hidrolizar GTP y por lo tanto encerrado en una &quot;dominante activo&quot; del Estado 7. Para analizar su función en las células de los dos alelos dominantes negativos activa y dominante de GTPasas se suelen expresar en niveles altos para interferir con la función de las proteínas endógenas 9. Una manera elegante de alcanzar altos niveles de sobre-expresión en un corto período de tiempo es la introducción de los plásmidos que codifican las proteínas relevantes directamente en los núcleos de las células polarizadas crecido en el filtro admite el uso de la técnica de microinyección. Esto se combina a menudo con la co-inyección de reportero plásmidos que codifican los receptores de la membrana plasmática que están específicamente ordenados en el dominio apical o basolateral. Una carga usados ​​para analizar la carga de clasificación para el dominio basolateral es un alelo sensible a la temperatura de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVGts045) 10. Esta proteína no se pueden plegar correctamente a 39 ° C y por lo tanto se mantendrá en el retículo endoplasmático (ER), mientras que la proteína reguladora de interés se monta en el citosol. Un cambio a 31 ° C, entonces permitirá que VSVGts045 a veces bien, salir de la sala de emergencia y los viajes a la membrana plasmática 11. Esta persecución se realiza generalmente en presencia de cicloheximida para prevenir la síntesis de proteínas mayor que conduce a resultados más limpios. A continuación se describe en detalle el procedimiento de la microinyección de plásmidos en células polarizadas y incubaciones posteriores incluyendo los cambios de temperatura que permiten un análisis completo de las proteínas reguladoras implicadas en la clasificación basolateral.

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Este artículo detalla los procedimientos involucrados en la sobreexpresión y el análisis de las pequeñas GTPasas en células epiteliales polarizadas utilizando la técnica de microinyección.

El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K vistas.  Northwestern University. Este artículo detalla los procedimientos involucrados en la sobreexpresión y el análisis de las pequeñas GTPasas en células epiteliales polarizadas utilizando la técnica de microinyección.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Investigación

Biología

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Células epiteliales mamarias de ratón forma Mammospheres durante la diferenciación lactogénica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

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