המחברים רוצים להכיר ג&#39;וליה Hatler ומרטין צוקים (R &amp; D מערכות) לדיון מועיל וביקורת כתב יד.

1. אינדוקציה של EMT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה חמה תרבות ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים. תקשורת והתרבות המשמשת אותו כאמצעי התקשורת המשמשת לתרבות סטנדרטית של תאי עניין שלך. לדוגמא, שורת תאי קרצינומה של ריאה האנושית A549 הוא גדל בF12 של Kaighn תוספת 10% בסרום שור העובר וגלוטמין 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים של עניין באמצעות פתרון דיסוציאציה (למשל TrypLE Express). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים בתקשורת התרבות המחוממת מראש בצינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא XG 400 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant על ידי שפיכה לתוך מיכל פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התא גלולה בתקשורת התרבות המחוממת מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא באמצעות Trypan הכחול. הסר מדגם של ההשעיה התא ולדלל ב0.4% פתרון Trypan הכחול. הנח 10 μl של המדגם בדילול מלא על hemocytometer ולספור תאי קיימא (תאים שלא להפוך לכחול). השתמש בספירת תאים כדי לקבוע את ד התאensity בפתרון שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים על גבי רקמת תרבות מטופלים צלחות או צלוחיות ב0.9-1.0 x 10 4 תאים לכל 2 סנטימטר. לדוגמא, 0.5 x 10 6 תאים מצופים בצלחת 100 מ&quot;מ בתקשורת והתרבות המכילה מוסף 1X EMT התרמת מדיה (6 מיליליטר מדיה לכל 100 צלחת מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מצופה תאים בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות. לפקח על המורפולוגיה של תאים מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לאחר ציפוי, להסיר תקשורת ולהחליף עם תקשורת ותרבות מחוממת מראש טריות המכילה מוסף 1X EMT התרמת מדיה. המשך לתרבות בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמישה ימים לאחר ציפוי, תאים מוכנים לניתוח. מורפולוגיה של תאים היא מדמיין על ידי מיקרוסקופ אור הפוכה. </li></ol> 2. ניתוח של ביטוי חלבון על ידי Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את coverslips מ&quot;מ 12 סטריליים לצלחת 24 גם על ידי הנחת coverslips בצלחת פטרי שמכילה 95% אתנול. בעדינות להסיר coverslips מאתנולing מחט ומלקחיים מעוקלים ולעקר להבה. מניחים coverslip סטרילי לתוך אחד טוב של צלחת 24 גם. חזור עם coverslips הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההשעיה התא כפי שתואר בסעיף 1.1-1.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.6 x 10 4 תאים / צלחת גם ב0.5 מיליליטר תקשורת התרבות המחוממת מראש המכילה תוסף 1X EMT התרמת מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ולהאכיל את התאים כמתואר בסעיפים 1.9-1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמישה ימים לאחר ציפוי, להסיר תקשורת ולתקן את התאים עם 300 μl / טוב של paraformaldehyde 4% בופר פוספט 1X (PBS) עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשטוף תאי 2x עם 1X PBS, 500 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב400 μl / טוב של חיץ חסימה (1X PBS המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 10% בסרום חמור נורמלי, ו0.3% טריטון X-100) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בנוגדן ראשוני ביצרנים מומלצים ריכוז ב400 μl / טובה של חיץ חסימה עבור 3 שעות בחדר temperaturדואר או הלילה ב 4 ° C. בעת שימוש בנוגדן ראשוני ישירות מצומדת לfluorochrome, דגירה דגימות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים ב500 μl / טוב של 1X PBS המכיל BSA 0.1% במשך 5 דקות כל אחד לשטוף. בעת שימוש בנוגדן ראשוני ישירות מצומדת לfluorochrome, להמשיך ישירות לשלב 2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בנוגדנים משני בריכוז המומלץ של היצרן ב400 μl / טוב של 1X PBS המכיל BSA 1% עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים ב500 μl / טוב של 1X PBS המכיל BSA 0.1% במשך 5 דקות כל אחד לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, counterstain גרעינים עם פתרון DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים במי deionized והר coverslips עם הפנים כלפי מטה בשקופית באמצעות תקשורת הרכבה. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression.">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li><li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling.">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li><li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways.">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li><li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin/&#946;-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier.">E-cadherin/&#946;-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li><li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast.">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li><li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition.">TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li><li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition.">TGF-&#946;1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li><li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells:+involvement+of+type+I+receptors.">TGF-&#946; induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li><li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+&#946;1,+&#946;2,+and+&#946;3+during+murine+palate+formation.">Differential expression of genes encoding TGFs &#946;1, &#946;2, and &#946;3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li><li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

מערכות מו&quot;פ, Inc היא חברה למטרת רווח, ציבורית. ההפקה והגישה חופשית למאמר זה היא בחסות מו&quot;פ Systems, Inc

שיטות קודמות לזירוז EMT השתמשו בדרך כלל גירוי TGF-β או הנדסה גנטית. למרות TGF-β לבד הוכח לגרום EMT בכמה סוגי תאים, זה עתה הוכיח כי TGF-β הוא הכרחי לEMT, אבל זה לא מספיק בכל סוגי התאים 6,14. שימוש בהנדסה גנטית לזירוז EMT היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית. השיטה המתוארת כאן משתמשת בשילוב של גורמים, לרבות, E-cadherin אנטי אנושי, sFRP-1 אנטי אנושי, DKK-1 אנטי אנושי, Wnt-5A האנושי רקומביננטי, וTGF-β1 אנושיים רקומביננטי לגרום EMT באופן מהימן. זה שילוב של גורמים נועד לחסום הידבקות E-מבוססת cadherin, שלב קריטי לזירוז EMT 4, ולשפר את האיתות של Wnt על ​​ידי הוספת חלבון Wnt-5A, כמו גם באמצעות נוגדני חסימה למעכבי Wnt, sFRP-1 וDKK -1. Wnt ואיתות TGF-β הוכחו לפעול בלולאת autocrine כדי לגרום ולשמור על Stat תא mesenchymalדואר 6. שיטת אינדוקציה זה תמנע מניפולציה גנטית והוא יעיל יותר מאשר השימוש בTGF-β לבד. חשוב מכך, אנו מסוגלים להתבונן אינדוקציה של EMT בסוגי תאים, כולל MCF7 וPANC-1 תאים, שהוכח בעבר שלא להגיב אך ורק לגירוי TGF-β (איור 5) 14. תאים שטופלו עם מופע מוסף EMT התרמת מדיה מורפולוגיה ציר בצורת פחות קומפקטית ומוגברת (איור 1). בנוסף, יש ירידה במקביל ביטוי E-cadherin משטח עם עלייה בביטוי פיברונקטין, שהם מסימני ההיכר של EMT (איורים 2 ו -3). סמני mesenchymal נוספים כגון vimentin וחילזון גם הוגברו בתאים המושרה EMT בהשוואה לקבוצת ביקורת uninduced (איור 4). יכולות הגירה ופלישה מוגברות הם המאפיינים הפונקציונליים העיקריים של תאי mesenchymal. במבחנה </em&gt; מבחני הגירה ופלישה, תאים שטופלו במוסף EMT התרמת מדיה הפגינו יכולת מוגברת באופן משמעותי להגר ולפלוש (איור 6). זו שיטה פשוטה לזירוז EMT שימושית ללימוד איתות EMT כפי שהודגם באמצעות נתונים ביטוי מערך נוגדנים שמוצגים באיור 7. ניתן להשוות סוגי תאים שונים לפני ואינדוקצית ההודעה EMT-להשיג חתימות נפוצות ביטוי הקשורים EMT, כגון העלייה בCREB פוספורילציה וERK1 / 2 ראו בשני MCF7 ותאים מושרה-EMT A549. זירחון S133 של CREB מגרה DNA המחייב והוכח לפעול במורד הזרם של TGF-מושרה β1 EMT 15. ERK1 / 2 זירחון כן הוכח לפעול במורד הזרם של TGF-מושרה β1 EMT 16. הבדלים במסלולי איתות בין סוגי תאים יכולים גם להיות הובהר כפי שניתן לראות עם העלייה בזירחון GSK-3β בתאי A549 לעומת p70S6זירחון K בMCF7. זירחון GSK-3β בסרין 9 מקטין אותו לתפקד, וGSK-3β הוכח לעכב את גורם השעתוק פרו-EMT, חילזון 17. לעומת זאת, p70S6K גורם פעילות החילזון וזירחון שלו קשור בהפעלתו של חלבון זה 18. בסך הכל, אינדוקציה פשוטה ואמינה של EMT, במיוחד בתאים הראו בעבר שלא להגיב אך ורק לTGF-β, היא שימושית להבנת הביולוגיה של EMT, זיהוי חתימות ביטוי נפוצות לשימוש כסמנים פרוגנוסטיים, ובפיתוח והערכה של תרופות חדשניות לסרטן ומחלה fibrotic.

אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) הוא התהליך שבו תאי אפיתל מקוטבים עוברים מגוון רחב של שינויים וכתוצאה מכך תא mesenchymal ניעתי מאוד, כמו פיברובלסטים. תהליך זה מתרחש, בין שאר, באמצעות שינויי ביטוי גנים והשפלה של צמתים adherens, וכתוצאה מכך יכולת מוגברת להגר ולפלוש. מבחינה פיזיולוגית, EMT משחק תפקידים חשובים במהלך התפתחות עוברית וריפוי פצעים. אובדן השליטה נאותה על EMT יכול להוביל לסיסטיק וגרורות של קרצינומה של 1,2. הירידה של E-cadherin על פני השטח של תאי האפיתל היא שלב קריטי בהתקדמות של תא דרך EMT 3,4. E-cadherin הוא חלבון הטרנסממברני אחת לעבור ישירות אינטראקציה עם חלבוני cadherin על תאים סמוכים. בנוסף לתפקידה בהידבקות תא, תא השפעות E-cadherin איתות באמצעות אינטראקציות בין זנב cytoplasmic של E-cadherinמגוון da של חלבונים רגולטוריים, בעיקר β-catenin. β-catenin משחק תפקיד בייצוב של צמתים adherens. במהלך איתות Wnt הקנונית, β-catenin הוא שוחרר מבית E-cadherin וtranslocated לגרעין שבו היא פועלת כגורם שעתוק במורד הזרם במסלול Wnt 3,4,5. בגרעין, β-catenin הוכח להגדיל את השעתוק של מספר גורמים הקשורים לEMT כולל טוויסט, Slug, פיברונקטין, וכן מגוון של metalloproteases מטריקס 3,6. בנוסף לWnts, איתות TGF-β הוכח לשחק תפקיד משמעותי באינדוקצית EMT הן במהלך התפתחות נורמלית ובמדינות חולות 7,8,9. TGF-β הוא מעורב בEMT המתרחש במהלך היווצרות חיך ובלב פיתוח 10. הוא גם היה מעורב בסיסטיק ובהתקדמות סרטן לגרורות 7. ההליך המתואר כאן יחסי הציבורovides אינדוקציה עקבית של EMT במגוון רחב של סוגי תאים ללא הצורך במניפולציה גנטית. הליך זה משתמש בקוקטייל של E-cadherin, sFRP-1, וDKK-1 נוגדני חסימה וWnt-5A וחלבונים רקומביננטיים TGF-β1. קוקטייל זה נועד לחסום מבוסס-cadherin E הידבקות תוך שיפור Wnt ואיתות TGF-β. היכולת לזירוז EMT חזק היא קריטית להבנת הביולוגיה של תהליך זה וכיצד לתפעל אותו למטרות טיפוליות. סמנים נפוצים הנוכחיים של EMT, E-cadherin (downregulated בEMT) וvimentin (שהוגברו בEMT), ניתן למצוא בשיתוף מתבטא בסוגי סרטן ובכך לא מספקים סמני האבחון הטובים ביותר של תאים גרורתי פוטנציאל 12. חשוב מכך, הניתוח של מגוון רחב של סוגי התאים שעברו EMT שימושי לפתח חתימות ביטוי נפוצות גן שיכול לשמש למטרות אבחון בסרטן וסיסטיק 11. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי EMT עשוי לשחק תפקיד בהיווצרות של תאי גזע סרטניים, מה שמרמז שתאים שעברו EMT עשויים להיות שימושיים עבור הקרנת סמים כדי לזהות תרכובות שיכולות למקד תאים אלה 13.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) הוא חיוני להמורפוגנזה הנאותה במהלך פיתוח. ויסות לא תקין של תהליך זה הייתה מעורב כאירוע מפתח בסיסטיק ואת ההתקדמות של קרצינומות למצב גרורתי. הבנת התהליכים שבבסיס EMT היא הכרחית לאבחון המוקדם ובקרה קלינית של מדינות מחלה אלה. אינדוקציה אמינה של EMT במבחנה היא כלי שימושי לגילוי סמים, כמו גם לזהות חתימות ביטוי גנים משותפות למטרות אבחון. כאן אנו מדגימים שיטה פשוטה לאינדוקציה של EMT במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים לפני ואינדוקצית ההודעה EMT-ידי immunocytochemistry כלולים גם כן. בנוסף, אנחנו מדגימים את האפקטיביות של שיטה זו דרך ניתוח מערך המבוסס על נוגדן ומבחני הגירה / פלישה.

. תנאי תרבות EMT גרימת המתוארים כאן לספק שיטה יציבה לגיוס של EMT במגוון רחב של סוגי תאי איורים 1 ו -2 להדגים את המורפולוגיה של ורמות ביטוי סמן ל4 קווים שונים תא אנושי: תאי גליובלסטומה T98G, HT29 תאי אדנוקרצינומה המעי הגס , קרצינומה של תאי ריאות A549, ותאי אפיתל החלב MCF10A. תאים שטופלו במוסף EMT התרמת מדיה השתנו ממורפולוגיה קלאסית אפיתל (איורים 1 א - 1D) לmesenchymal, מורפולוגיה דמוית כישור (1E דמויות - 1H). תאים מושרה-EMT הופיעו עמוסים פחות צפוף במושבות צפופות בהשוואה לתאי uninduced. דגימות Uninduced MCF10A הכילו אשכולות צפופים מוקפים בתאים עמוסים יותר באופן רופף. אשכולות צפופים אלה היו E-cadherin חיוביים (איור 2 ד) ונעלמו על טיפול עם EMT התרמת מדיה Supplement (איור 2H). EMT הוערך גם על ידי downregulation של סמנים וגברת ביטוי של סמני mesenchymal אפיתל. Downregulation ביטוי E-cadherin הוא ציין בדרך כלל בעקבות האינדוקציה EMT בסוגי תאים שונים 3,4 איור 2 מדגים ביטוי על פני השטח של E-cadherin ברוב המכריע של תאים שלא טופלו (2A דמויות - 2D; אדום). בהשוואה להיעדרותה לאחר האינדוקציה EMT (2E דמויות - 2H; אדום). קו תאים אחד, T98G, נמצא כי רמת בסיס נמוכה מאוד של E-cadherin לפני גיוס EMT, אשר מנע את הניתוח שלה. גברת ביטוי של סמן mesenchymal, פיברונקטין, הייתה גם גלויה לאחר אינדוקציה עם מוסף EMT התרמת מדיה (2A דמויות - 2D לעומת 2E דמויות - 2H; ירוק). רמות הביטוי של E-cadherin ופיברונקטין נתפסו על ידי immunocytochemistryאושרו עוד דרך מערבי סופג בסך הכל lysates תא (איור 3). הכתם המערבי אישר downregulation של E-cadherin וגברת ביטוי ביטוי פיברונקטין נתפס על ידי immunocytochemistry. הלהקות ונרשמת באמצעות צפיפות ומנורמלת לGAPDH כדי לקבוע שינוי קיפול יחסי הבאים אינדוקציה EMT. רמות E-cadherin הופחתו 6.4 ו3.4 לקפל בA549 ותאי MCF10A, בהתאמה. רמות פיברונקטין הוגדלו 4.6 4.1, ו2.3 לקפל בT98G, A549, ותאי MCF10A, בהתאמה. למרות הכתם המערבי לא מראה ירידה משמעותית של רמות חלבון E-cadherin בתאי HT29 אינדוקציה הודעה-EMT, תוצאות immunocytochemistry להפגין ירידה בביטוי על פני השטח של E-cadherin (איור 2 לעומת 2F), שאינו מסוגל להבחין ב מערבי סופג בסך הכל lysates תא. כדי להעריך את מצב EMT, סמן ידוע נוסף נוסףs עבור EMT נותחו לפני ואינדוקצית ההודעה EMT-. עולים בקנה אחד עם תוצאות קודמות, E-cadherin היה downregulated בכל שורות התאים שנבדקו, מצביעה על כך שEMT היה מושרה. בנוסף, סמני mesenchymal, vimentin והחילזון, היו שהוגברו בA549, T98G, ותאי MCF10A לאחר טיפול עם מוסף EMT התרמת מדיה (איור 4). שורת תאי HT29 לא הראתה ביטוי של סמנים אלה mesenchymal עם או בלי האינדוקציה EMT (מידע לא מוצג), אשר עשוי להצביע על כך תאים אלה לנצל מסלולים חלופיים לזירוז EMT. למרות TGF-β הוא מספיק כדי לגרום EMT בתאים מסוימים הקשרי 7,8,9, סוגי תאים אחרים לא מגיבים אך ורק לתוספת של TGF-β 14. MCF7 תאי שד אנושי הסרטן וPANC-1 קרצינומה של תאי לבלב אנושיים שניהם דיווחו שלא להגיב לTGF-β איתות לבד 14. כדי לקבוע אם שני הקווים יכולים לעבור EMT בvitro, תאים היו בתרבית בנוכחות מוסף EMT התרמת מדיה. תאים היו מגורה עם TGF-β1 רקומביננטי לבד, בריכוז במוסף EMT התרמת מדיה. תאים אלה נשמרים מורפולוגיה האפיתל שלהם, בהיקף של מושבות צפופות של תאים (מידע לא מוצג) ורמות E-cadherin פני השטח היו דומים לאלה שראו בתאי ביקורת (5 ג דמויות ו5D לעומת 5A דמויות ו5 ב). לעומת זאת, תאי מגורה עם מוסף EMT התרמת מדיה הראו ירידה דרסטית ברמות E-cadherin פני השטח (5E דמויות ו5F). תאים אלה גם השיגו מורפולוגיה mesenchymal יותר, כמו תאים הפכו פחות קומפקטיים ויותר כמו ציר (מידע לא מוצג). תוצאות אלו מראות כי שיטת EMT גרימת המתוארת כאן היא מסוגלת לקדם מורפולוגיה EMT וסמן שינויי ביטוי בתאים בדרך כלל עמידים בפני TGF-β-iEMT nduced. בנוסף לשינויים בביטוי סמן, סימן היכר נוסף של תאי mesenchymal הוא היכולת שלהם להגר ולפלוש. הגירה ופלישה של תאים בתרבית עם או בלי תוספת EMT התרמת מדיה נותחו באמצעות 96 גם נייד BME פלישת Assay על פי הוראות היצרן. בקצרה, תאים היו זורעים על צלחות 96 היטב (50,000 תאים / טוב) המכילים מסנן מוסיף עם 8.0 מיקרומטר נקבוביות. לאחר 48 שעה, הגירה הוערכה על ידי calcein מכתים AM של תאים שנדדו דרך המסנן. כל דגימה נבדקה בשלושה עותקים פעמיים עם תוצאות דומות. נציג תוצאות מניסוי אחד מוצגות באיור 6 א. עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית (P-value &lt;0.003) בנדידת תאים נראו עם שני A549 וPANC-1 התאים הבאים אינדוקציה EMT. כדי להעריך את יכולתם של תאים לפלוש (כלומר להעביר באמצעות מטריצה ​​תאית), אותו assay היההופיע עם מסנן מצופה תמצית קרום במרתף. תאים מושרה-EMT הראו (P-value &lt;0.001) עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית ביכולות פלישה בהשוואה לתאים שלא טופלו כפי שניתן לראות באיור 6. האינדוקציה החזקה של EMT שימושית לניתוח של שינויים גנטיים ביטוי ואיתות המתרחשים בתאים אלה. ניתוח מערך המבוסס על נוגדן באמצעות lysates מתאי שני מטופלים ואינם מטופלים הוא אחת שיטות לנתח את רמות הביטוי של מגוון רחב של מולקולות בדגימה אחת. כדוגמא, נתחנו את הרמות של בני משפחת MAPK פוספורילציה בlysates מבלתי מושרה וEMT-induced MCF7 ותאי A549 באמצעות ערכת מערך Proteome Profiler האדם phospho-MAPK. המערך נדרס פעמיים מטיפולים עצמאיים EMT-אינדוקציה עם תוצאות דומות. איור 7 מציג נתונים נציג ממערך אחד. שני סוגי התאים הציגו זרחון המוגבר של CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204), וERK2 (T185/Y187) בתאים מושרה-EMT השוואה לקבוצת ביקורת. הבדלים באירועי איתות נצפו בין שני סוגי התאים, כמו גם. תאי A549 הראו עלייה בGSK-3 β זרחון (S9), ואילו תאי MCF7 הראו זירחון p70S6K המוגבר (T421/S424). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> איור 1. Mesenchymal אינדוקציה מורפולוגיה לאחר גירוי עם מוסף EMT התרמת מדיה (- ד &#39;). מורפולוגיה אפיתל בארבעת סוגי התאים שצוינה הבאה תרבות במשך 5 ימים בתקשורת התרבות סטנדרטית ללא תוספת EMT התרמת מדיה (ה - ח). מורפולוגיה mesenchymal ב ארבעה סוגי תאים שצוינו תרבותיים עם מוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים. NT &quot;עבור: together.within-לשמור על עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> איור 2. Downregulation של ביטוי סמן אפיתל וגברת ביטוי של ביטוי סמן mesenchymal בתאים מושרה-EMT. תאים הוכתמו על ידי immunofluorescence כדי לזהות את הביטוי של סמן אפיתל, E-cadherin (אדום), וסמן mesenchymal, פיברונקטין (ירוק). ( - ד) תאי בקרה בתרבית, ללא תוספת EMT התרמת מדיה במשך 5 ימים (ה -. H) תאים בתרבית עם מוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים. כל תאי counterstained עם DAPI (כחול). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. אישור על ביטוי סמן אפיתל mesenchymal עם כתם מערבי<html> . Alysis כתם המערבי של lysates תא הכולל של ארבעה סוגי התאים שצוין, שטופלו ב( EMT) או בלי (-) מוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים. להקות עבור E-cadherin, פיברונקטין, וטעינה מלאה GAPDH הן כפי שצוינו בצד השמאל. סמן הגודל הוא כפי שצוין בצד הימין. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. גברת ביטוי של סמני mesenchymal, vimentin וחילזון בתאים מושרה-EMT. תאים הוכתמו על ידי immunofluorescence ססגוניות לזהות ביטוי של סמן אפיתל, E-cadherin (האפור), וסמני mesenchymal, vimentin (ירוק) וחילזון (אדום) תאי בקרה בתרבית, ללא תוספת EMT התרמת מדיה עבור 5 ימים. - (C). (ד - ו) תאים בתרבית עם מוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים. lways &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="איור 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> איור 5. תאי תאי אינדוקציה של EMT בתאים שאינם מגיב TGF-β1. (A ו-B) בתרבית עם תקשורת לבד במשך 5 ימים. (C ו-D) בתרבית בתקשורת המכילה 10 / מיליליטר ng של TGF-β1 במשך 5 ימים. (E ותאי F) בתרבית במוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים. כל התאים הם מוכתמים לביטוי E-cadherin (אדום) וcounterstained עם DAPI (כחול). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. תאים מושרה-EMT הגדילו יכולות הגירה ופלישה. מספר א הממוצע של תאים שנדדו דרך מסנן נקבובית 8 מיקרומטר לאחר הדגירה של 48 שעות. מספר ב &#39;הממוצע שלתאים שהיו מסוגל לפלוש דרך מסנן נקבובית 8 מיקרומטר מצופה בתמצית קרום במרתף לאחר הדגירה של 48 שעות. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן מעל 3 בארות. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="איור 7"/> ניתוח המבוסס על נוגדן איור 7. מערך ביטוי של האינדוקציה EMT. Lysates מA549 (A ו-C) וMCF7 תאים (B ו-D) בתרבית עם או בלי תוספת EMT התרמת מדיה שימשו לניתוח מערך באמצעות ערכת מערך Proteome Profiler האדם phospho-MAPK. נקודות מודגשות בA ו-B אז היו נרשמת באמצעות צפיפות. השוואות של lysates לEMT-induced בלתי מושרה מוצגות בגרף העמודות המתאימות בהמשך (C ו-D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה &lt;</a>/&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition at JoVE.com

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

שיטה פשוטה מתוארת לאינדוקציה של אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים במדינות EMT ידי immunocytochemistry כלולים.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

induction-and-analysis-of-epithelial-to-mesenchymal-transition

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

35.6K Views.  R&D Systems, Inc..  שיטה פשוטה מתוארת לאינדוקציה של אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים במדינות EMT ידי immunocytochemistry כלולים. 

Video: Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.