הקמת אורגנואידים ופיברובלסטים מגידולים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה

אורגנואידים סרטניים חוללו מהפכה בחקר הסרטן ובגישה לרפואה מותאמת אישית. הם מייצגים מודל גידול רלוונטי מבחינה קלינית המאפשר לחוקרים להישאר צעד אחד לפני הגידול במרפאה. פרוטוקול זה מבסס אורגנואידים סרטניים מדגימות טריות של רקמת גידול בלבלב וקסנוגרפטים שמקורם באדנוקרצינומה של הלבלב.

אורגנואידים של הגידול הם מודלים תלת-ממדיים (3D) של גידולי ex vivo המשחזרים את תכונות המפתח הביולוגיות של רקמות הגידול הראשוניות המקוריות. אורגנואידים סרטניים שמקורם במטופל שימשו במחקר סרטן תרגומי וניתן ליישם אותם כדי להעריך רגישות ועמידות לטיפול, אינטראקציות תא-תא ואינטראקציות תאי גידול עם מיקרו-סביבה של הגידול. אורגנואידים סרטניים הם מערכות תרבית מורכבות הדורשות טכניקות מתקדמות של תרביות תאים ומדיה תרבית עם קוקטיילים ספציפיים של גורמי גדילה וקרום מרתף ביולוגי המחקה את הסביבה החוץ תאית. היכולת לקבוע תרביות גידול ראשוניות תלויה מאוד ברקמת המוצא, התא והמאפיינים הקליניים של הגידול, כגון דרגת הגידול. יתר על כן, איסוף דגימות רקמות, איכות החומר וכמותו, כמו גם ביו-בנקאות נכונה ואחסון הם מרכיבים חיוניים בהליך זה. היכולות הטכניות של המעבדה הן גם גורמים מכריעים שיש לקחת בחשבון. כאן, אנו מדווחים על SOP/פרוטוקול מאומת שהוא אפשרי מבחינה טכנית וכלכלית לתרבית של אורגנואידים מגידול ex vivo מדגימות רקמה טריות ממקור אדנוקרצינומה של הלבלב, בין אם מרקמת תורם ראשונית ראשונית טרייה או מקסנוגרפטים שמקורם במטופל (PDX). הטכניקה המתוארת כאן יכולה להתבצע במעבדות עם תרבית רקמה בסיסית ומתקני עכבר והיא מותאמת ליישום רחב בתחום האונקולוגיה התרגומית.

אורגנואידים סרטניים הם תרביות מאורגנות תלת ממדיות (3D) Ex vivo הנגזרות מרקמת גידול טרייה ומספקות מודלים לסרטן. אורגנואידים סרטניים משחזרים את תכונות המפתח הביולוגיות של הגידול הראשוני המקורי 1,2,3,4 וניתן להרחיבם עד מספר חודשים ולשמר אותם בהקפאה^, בדומה לקווי תאים אימורטליים קונבנציונליים. אורגנואידים גידוליים מספקים ביובנק של מודלים גידוליים שמקורם במטופל עבור רפואה תרגומית/מותאמת אישית⁵ ומייצגים התקדמות חשובה במערכות/מודלים של ביולוגיה של תאים סרטניים. אורגנואידים סרטניים שמקורם במטופל יכולים לשמש כמודלים ex vivo כדי לחזות את יעילותם של טיפולים אונקולוגיים/פרמקולוגיים (ניאו)אדג'ובנטיים, שעבורם נקבעות תרביות מרקמת גידול טרייה ומבחני רגישות לתרופות או פרמקוטיפ מבוצעים על בסיס ספציפי למטופל כדי לזהות סוכנים יעילים לקווי הטיפול הבאים ^1,4. יתר על כן, אורגנואידים סרטניים מתגברים על מגבלת הזמינות של רקמת גידול ראשונית, וחשוב מכך, מספקים חלופה מצוינת או מערכת משלימה למודלים של עכברי in vivo, כגון xenografts שמקורם במטופל (PDX)². המורכבות של אורגנואידים סרטניים גדלה אם תאי הגידול הראשוניים משולבים עם תאי סטרומה הנמצאים במיקרו-סביבה של הגידול (TME), כגון פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), תאי אנדותל ותאי מערכת החיסון, המחקים את התפקוד והמורכבות של הגידול הראשוני. אורגנואידים גידוליים נקבעו עבור סוגי גידולים רבים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 6,7,8,9,10. התפשטות אורגנואידים מגידולים מוצקים שונים, כולל רקמת סרטן המעי הגס וסרטן השד, מבוססת היטב ובמחיר סביר מבחינה טכנית 11,12,13,14,15.

כריתות גידול כירורגיות או ביופסיות גידול מספקות דגימות ראשוניות של רקמת גידול. באופן אידיאלי, דגימות רקמת הגידול צריכות להגיע ממרכז מסת הגידול או מהקצה הפולש של הגידול, כמו גם רקמה רגילה למראה הסמוכה לגידול. בהשוואה לתרביות דו-ממדיות קונבנציונליות, אורגנואידים סרטניים דורשים מספר "תוספות", כולל קרום מרתף ביולוגי (כגון מטריג'ל, הידרוג'ל או פיגום מבוסס קולגן), המחקה את ה-TME החוץ-תאי, ומדיום גידול נוזלי המספק חומרי מזון וגורמי גדילה ספציפיים ותומך בשגשוג תאים וביכולת הקיום שלהם בתרבית¹⁶.

השלבים הבסיסיים ביותר בתרבית תאים ראשונית הם שטיפת הרקמה בתמיסת מלח למניעת זיהום, חיתוך מכני / עיכול הגידול לחתיכות קטנות של 1-3 מ"מ³, וטיפול בקולגנאז לעיכול אנזימטי של הרקמה. לאחר מכן מסוננים את התערובת המעוכלת כדי להסיר שברי רקמה גדולים, מרחפים מחדש בקרום מרתף ביולוגי כמו מטריג'ל, ומצופים ככיפות בלוחות תרבית בעלי חיבור נמוך כדי להגביר את הצמיחה שאינה מחוברת. כיפות מטריצת קרום המרתף מכוסות בתווך תרבית נוזלית ומשלימות גלוטמין ואנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום, כמו גם עם גורמי גדילה ספציפיים בהתאם לסוג הרקמה 7,8,9,16,17. תאים רלוונטיים אחרים הנמצאים בתוך הגידול בתפזורת וב- TME עשויים גם הם להיות מבודדים, כגון פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) ותאים חיסוניים. טכניקה זו, אשר נסקרה לאחרונה¹⁸, מאפשרת הקמת תרביות משותפות עם סוגי תאים שונים כדי לחקור את התגובה לטיפול בסביבת גידול "מציאותית" יותר. יתר על כן, ניתן לחקור אינטראקציות תא-תא ואת האינטראקציה בין תאי הגידול לבין רכיבי המטריצה הביולוגית הסובבת.

שיעור ההצלחה המדווח של התבססות אורגנואידים של הגידול באמצעות רקמה טרייה מביופסיות או רקמת גידול במערכת העיכול שנכרתה הוא סביב 50%¹¹, ושיעור ההצלחה של האחרונה תלוי במידה רבה בסוג הרקמה ובמקור⁴, במיוחד בדרגת הגידול ובתאיות הגידול הכללית. מודלים תלת-ממדיים של גידולים הם בעלי מורכבות משתנה, החל מאגרגטים חד-תאיים פשוטים ועד מודלים מהונדסים מורכבים ביותר המורכבים מסוגי תאים שונים. המינוח המשמש לתיאור תרבויות תלת-ממדיות בספרות הוא מאוד לא עקבי 19,20,21, שכן משתמשים במונחים שונים כגון ספרואידים, גידולים ואורגנואידים^, אם כי ההבדל ביניהם אינו ברור. מכיוון שעדיין לא הושגה הסכמה ברורה על ההגדרה, במאמר זה, אורגנואיד גידולי מתואר כתרבית תאי גידול מאורגנת המשובצת בקרום מרתף ביולוגי.

כאן, פרוטוקול מאומת מדווח להקמת אורגנואידים גידוליים מדגימות רקמה טריות שמקורן באדנוקרצינומה טרייה ראשונית או PDX שמקורה באדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), וניתן לבצע פרוטוקול זה ברוב המעבדות עם מתקני תרבית רקמה בסיסיים. פרוטוקול זה הותאם ממספר פרוטוקולים מדווחים עדכניים המשמשים כיום לקביעת אורגנואידים גידוליים או גידולים מרקמת גידול העיכול מהקבוצות של David Tuveson⁹, Hans Clevers⁸ ו- Aurel Perren⁷.

פרוטוקול זה אינו דן באופן קצירת הרקמה הטרייה. כדי להשיג רקמת גידול אנושית טרייה באיכות גבוהה, חשוב שיהיה תיאום יעיל בין המנתחים שקוצרים את הרקמה לבין המחלקה הפתולוגית שמחלצת את דגימת הרקמה לתרבית אורגנואידים. כמו כן, בעת שימוש ב- PDX כמקור רקמה טרי, חשוב גם תיאום יעיל עם האדם שקוצר את דגימת הרקמה. חשוב מאוד לקבל את דגימת הרקמה מהר ככל האפשר (תוך 30-60 דקות מזמן הקציר) על מנת לשמור על איכות גבוהה.

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לרווחת חיות ניסוי שאושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה האוטונומית של מדריד (CEI 103-1958-A337) ולה קומונידד דה מדריד (PROEX 294/19) ובהתאם להנחיות להתנהגות אתית בטיפול ובשימוש בבעלי חיים כאמור בעקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי המערבים בעלי חיים, פותח על ידי המועצה לארגונים בינלאומיים של מדעי הרפואה (CIOMS). הפרוטוקול פעל על פי העקרונות האתיים למחקר ביו-רפואי בהסכמה מדעת בכתב. התקבל אישור אתי מוקדם לשימוש ברקמה טרייה להקמת תרביות אורגנואידים גידוליים. הדגימות סופקו על ידי בית החולים BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (הרישום הלאומי של Biobanks B.0000678), שולבו בפלטפורמת Biobanks and Biomodels של ISCIII (PT20/00045), ועובדו בהתאם לנוהלי הפעלה סטנדרטיים עם אישור אתי מתאים. הגידולים הושתלו תת עורית, כפי שתואר קודם לכן²², בנקבות NU-Foxn1nu עירומות מדוכאות חיסון בנות 6 שבועות (ראו טבלת חומרים) ועברו in vivo כדי לבסס PDAC PDXs.

1. הכנה ניסיונית

1. טפל בדגימות אנושיות בארון בטיחות ביולוגית Class II.
2. יש ללבוש מעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים לאורך כל ההליך כדי למנוע זיהום על ידי פתוגנים הנישאים ברקמות.
   הערה: נדרש מינימום של 3 שעות כדי לעבד את דגימת הרקמה הטרייה ולצלחת את האורגנואידים והפיברובלסטים.
3. יש לעבד את דגימות הרקמה הטרייה^{22 תוך 24} שעות לכל היותר מהקטיף, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C במדיום תרבית רקמה (DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין) עד לעיבוד.
4. שמור את כל הדגימות והריאגנטים על הקרח במהלך כל ההליך, והקפד להגדיר מראש צנטריפוגה בקירור ל -4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בה במהירות נמוכה כדי למנוע נזק להכנת התא.
5. אחסנו קצוות פיפטה P1,000 ו-P200 במקפיא בטמפרטורה של -20°C לשימוש במהלך הפרוטוקול.
6. יש להשתמש במטריצת קרום המרתף (ראו טבלת חומרים) לפני השימוש. עבור פרוטוקול זה, מומלץ 250 מ"ל aliquots.

2. עיבוד רקמת גידול ראשונית טרייה לביסוס אורגנואידים סרטניים ופיברובלסטים ראשוניים

הערה: נדרש מינימום של 3 שעות כדי לעבד את דגימת הרקמה הטרייה (גידולים אנושיים ראשוניים הניתנים לניתוח או PDX) וכדי לצלחת את אורגנואידים הגידול ופיברובלסטים. מתאר של תהליך הכנת האורגנואידים מוצג באיור 1, מעיכול רקמות ועד ציפוי האורגנואידים של הגידול. לפני תחילת הפרוטוקול, הוציאו אליקוט של מטריצת קרום המרתף מהמקפיא בטמפרטורה של 20°C, והשאירו אותו על קרח למשך כ-30-60 דקות לפני השימוש.

1. שים צלחת תרבית 6 בארות באינקובטור תרבית תאים 37 מעלות צלזיוס 3 שעות לפני ציפוי האורגנואידים.
2. מדדו, צלמו ושטפו את הרקמה (שלב 1.3) עם 3 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Blend Blend F-12 Ham (F12), בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS), 15 mM Hepes, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 125 ng/mL Amphotericin B, 0.1 מ"ג/מ"ל Normocin) (ראה טבלת חומרים) על ידי פיפטציה למעלה ולמטה ולאחר מכן לשטוף עם 3 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה.
3. הסר את המדיה על ידי שאיפה מצלחת תרבית הרקמה וחתך את הרקמה ל 1 מ"מ³ חתיכות בצלחת תרבית רקמה סטרילית באמצעות שני להבים סטריליים ו 2 מ"ל של מדיום עיכול (מתקדם DMEM-F12 + 10 מ"ג Collagenase IV / מ"ל, 0.000625% טריפסין-EDTA, ו 10 מיקרוגרם / מ"ל DNase). לאסוף את הרקמה בצינור 50 מ"ל עם 5 מ"ל סה"כ של מדיה העיכול ולדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C עם עיכול מכני עם ציוד זמין מסחרית (ראה טבלה של חומרים) או עם ערבוב תקופתי של הדגימה, על ידי pipeting הדגימה למעלה ולמטה.
4. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם כדי להשבית את הטריפסין, וסנן את הדגימה דרך מסננת נקבוביות של 70 מיקרומטר כדי להסיר פסולת גדולה.
5. הוסף 2 מ"ל DMEM עם 10% FBS לחלק העליון של המסנן, ואסוף את הפסולת ושאריות הרקמה כדי ליצור תרביות של פיברובלסטים (ראה שלב 5).
6. צנטריפוגו את התסנין ב 200-300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ושאפו את supernatant, משאיר רק את גלולת התא. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
7. להשהות מחדש את הגלולה ב 4 מ"ל של אשלגן אמוניום-כלוריד (ACK, ראה טבלה של חומרים) חיץ ליזיס. מעבירים את התערובת לצינור של 15 מ"ל, ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות כדי לשכך את תאי הדם האדומים.
   הערה: ניתן להסיר שלב זה של ליזה של תאי דם אדומים כאשר אין עדות נראית לעין לזיהום.
8. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולשאוף את supernatant. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
9. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה תאי זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) בתוספת DNase (1 מיקרוגרם / מ"ל) לכדורית התא, ודגרה במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר.
10. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם, והשהה מחדש את גלולת התא.
11. פיפטה למעלה ולמטה 30 פעמים עם פיפטה P1,000 כדי לנתק את התאים, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם, ולהסיר את supernatant.
12. קחו קצוות פיפטה P1,000 ו-P200 מהמקפיא בטמפרטורה של 20°C-, והשהו מחדש את כדורית התא במטריצת הממברנה באמצעות פיפטה P1,000 וקצוות קרים (50 מיקרוליטר לטיפה, תוך התחשבות בנפח הכדור, שש עד שבע כיפות לבאר). מוציאים את הצלחת שחוממה בעבר מהאינקובטור. הגדר פיפטה P200 ל 48 μL, והשתמש בקצוות קרים כדי ליצור כיפות של מטריצת קרום המרתף בצלחת 6 בארות שחוממה מראש.
13. הכנס את הצלחת עם כיפות תאי המטריקס של קרום המרתף לתוך אינקובטור 37 ° C 5% CO₂ למשך 15 דקות כדי למצק את מטריצת קרום המרתף.
14. הוסף 2-2.5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם, בתוספת 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמיס אנושי רקומביננטי (EGF), 100 ng/mL גורם גדילה שליה אנושית (PlGF), 10 ng/mL גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF), 769 ng/mL גורם גדילה דמוי אינסולין-1 (IGF-1), ומעכב ROCK 10.5 μM (DMEM-F12 מתקדם + גורמי גדילה) (ראה טבלת חומרים).

3. ניטור האורגנואידים

1. עקוב אחר תרבית האורגנואידים של הגידול באופן חזותי במשך 7 הימים הראשונים ולאחר מכן שלוש פעמים בשבוע לאחר מכן.
2. שנה את המדיום פעמיים בשבוע עם DMEM-F12 מתקדם המכיל 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמיס אנושי רקומביננטי (EGF), 100 ng/mL גורם גדילה שליה אנושית (PlGF), 10 ng/mL גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF), 769 ng/mL גורם גדילה דמוי אינסולין-1 (IGF-1), ומעכב ROCK 10.5 μM (DMEM-F12 מתקדם + גורמי גדילה).
3. צלם תמונות של תרבית אורגנואיד הגידול מעת לעת ביום 1, יום 3, יום 7, יום 10 ויום 15 לאחר עיבוד הדגימה וציפוי התרבית במטריצה כדי לבחון את הצמיחה ואת הכדאיות.

4. מעבר והקפאה של האורגנואידים

1. מוציאים את מדיום התרבית מצלחת 6 הבארות.
2. הוסף 1 מ"ל של מגיב שחזור תאים מתאים (ראה טבלת חומרים) כדי לנתק את מטריצת קרום המרתף ולקבל תרחיף תא, ולשחזר את supernatant בצינור 15 מ"ל. אם המטריצה אינה מתנתקת מיד, יש לדגור על הדגימה בטמפרטורה של 4°C למשך 15-20 דקות עד להמסה מלאה.
3. הוסף 1 מ"ל של אותו מגיב שחזור תאים המשמש בשלב 4.2 לבאר הצלחת כדי לשחזר תאים מנותקים נוספים, והוסף את supernatant לאותו צינור 15 מ"ל כמו בשלב 4.2.
4. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 מתקדם קר, וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
5. הסר את supernatant, ולייבש את הגלולה בזהירות על ידי הסרת כל נוזל שנותר עם פיפטה 5 מ"ל; הימנעו ככל האפשר מהזזת הצינור. השהה מחדש את גלולת התא בנפח כפול מהנפח המקורי של מטריצת קרום המרתף על מנת לקבל מעבר של 1:2.
6. עבור cryostorage של תרביות אורגנואידים, להשעות מחדש את הגלולה המתקבלת בשלב 4.5 ב 1 מ"ל של מדיום הקפאה (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10.5 μM מעכב רוק), ולאחסן ב -80 ° C.
   הערה: ניתן לכוונן את נפח מטריצת קרום המרתף לביצוע מעברים שונים, כגון 1:1 (תוך שימוש באותו נפח של מטריצת קרום מרתף כמו המקור) או 1:3 (הוספת פי שלושה מהנפח המקורי של מטריצת קרום המרתף).

5. הקמת פיברובלסטים

1. לאחר שחזור פסולת ושאריות רקמות ב 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, להוסיף את זה צלחת 6 באר, לדגור ב 37 ° C עם 5% CO₂.
2. הסר את שאריות הרקמה מתרביות הפיברובלסטים משלב 2.5 בשאיפה של המדיום יומיים או 3 ימים לאחר הציפוי, והחלף ב- DMEM טרי ב- 10% FBS.
3. עקוב אחר תרבית הפיברובלסטים באופן חזותי שלוש פעמים בשבוע, ושנה את מדיום התרבית לפחות פעמיים בשבוע באמצעות DMEM בתוספת FBS של 10%.

חשוב לתעד כיצד תרבית האורגנואידים של הגידול מתקדמת לאורך זמן, במיוחד בשבועות הראשונים, על מנת להעריך כיצד התרבית תתנהג בבדיקות במורד הזרם. איור 2 מראה דוגמה לבידוד אופטימלי של תאי הגידול והתבססות אורגנואידים של הגידול מרקמה טרייה במשך תקופה של 15 יום. לפעמים יש כמות גדולה של פסולת תאים בדגימה, וקשה לראות את אורגנואידי הגידול המתפתחים, כפי שמוצג באיור 3. יתר על כן, הפנוטיפ של האורגנואידים המתפתחים יכול להשתנות מאורגנואידים מבודדים ומעוגלים (איור 4A) לתרביות ספרואידים/דמויי אגרגטים (איור 4B-D), וזה תלוי במקור הגידול. פיברובלסטים הם תוצר לוואי נפוץ של התבססות ראשונית של תרבית תאי גידול מגידולים מוצקים, במיוחד אלה עם תכולת סטרומה גבוהה, ולעתים קרובות יכולים לזהם את תרבית האורגנואידים. איור 5 מראה כיצד התאים האלה נדדו מכיפות המטריקס של קרום המרתף ונצמדו ללוחות התרבית לאחר כ-7 ימים. תאים אלה צורכים את החומרים המזינים ממדיום התרבית, ובכך פוגעים בגדילה אופטימלית של אורגנואידים.

פיברובלסטים ראשוניים יכולים להתקבל כתרבית מבודדת כאשר הם נודדים החוצה מחלקי הרקמה, נצמדים ללוחות התרבית וגדלים כתרבית חד-שכבתית, כפי שמוצג באיור 6. פרוטוקול זה ממליץ להשתמש בתווך DMEM סטנדרטי עם 10% FBS לתרבית הפיברובלסטים. עם זאת, מדיום מיוחד עבור פיברובלסטים יכול לשמש גם. פיברובלסטים נצמדים נראים כ-7 ימים לאחר הציפוי (איור 6).

איור 1: עיבוד דגימות רקמה טריות כדי לבסס אורגנואידים סרטניים. מוצג מתאר של תהליך הכנת האורגנואידים של הגידול, מעיכול רקמות ועד ציפוי האורגנואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תרבית אורגנואידים של גידול שנוצר מ-PDX שמקורו בגידול PDAC טרי. ההתקדמות של תרבית האורגנואידים של הגידול במשך מספר ימים מוצגת, עם תמונות של האורגנואידים במישור מיקרוסקופי אחד ביום 1, יום 3, יום 7, יום 10 ויום 15. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דוגמאות לתרבית אורגנואיד גידולית לא אופטימלית ביום השני עם עודף פסולת תאים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אורגנואידים גידוליים מבוססים מרקמות PDAC PDX שונות המראים הבדלים בגודל ובמורפולוגיה. אורגנואידים סרטניים יכולים להיות בעלי (A) פנוטיפ מעוגל קלאסי או (B-D) מראה יותר ספרואידי / מצטבר. הגודל הממוצע של האורגנואידים נע בין 80 uM ל 100 uM, אם כי כמה אורגנואידים עשויים להיות גדולים כמו 200 uM. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: דוגמאות לתרבית אורגנואידים גידולית לא אופטימלית (A-C) שזוהמה ב-CAFs/פיברובלסטים לאחר 30 יום בתרבית. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דוגמאות לתרביות פיברובלסטים ראשוניות שנוצרו משרידי רקמת הגידול הראשונית המעוכלת . (A) תרבית קונפלואנטית. (ב) תרבות לא מתמזגת. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: פתרון בעיות של הקמת תרבית אורגנואידים גידולית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

ההתקדמות הגדולה בטיפולים פרמקולוגיים לסרטן מאתגרת, שכן הסיכוי לאישור תרופות בשלב I של הניסויים האונקולוגיים הקליניים הוא 5.1%, שהוא הנמוך ביותר מבין כל סוגי המחלה²³. הסיבה העיקרית היא שהסרטן הוא הטרוגני מאוד, ולכן קבוצות החולים אינן מגיבות באופן אחיד כמצופה לטיפול הנתון, מה שמדגיש כי יש צורך בגישה מותאמת אישית יותר. תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) שימשו בחקר סרטן תרגומי במשך שנים רבות, אך חסרות את הארגון התלת-ממדי המבני שנמצא בגידולים ראשוניים. לפיכך, הם אינם משקפים במדויק את תגובות הטיפול של המטופל ואת התקשורת של תאי הגידול זה עם זה או עם המיקרו-סביבה שלהם ^3,23. עקרון הליבה של כל מערכות התרביות התלת-ממדיות הוא לקדם אינטראקציה תאית עם הסביבה ולארגן תאים באופן רלוונטי מרחבית, בדומה לגידול הראשוני (באתרו). המורפולוגיה של אורגנואידים סרטניים משתנה מעגולה, מסה ודמוית ענבים לסטלטים כתלות בטבע הפנימי של תאים בתרבית ובתנאי התרבית שבהם נעשה שימוש, כפי שמוצג באיור 4. תרביות אורגנואידים גידוליים מבוססים שמקורם במטופל יכולות להיות מטופלות באותו טיפול קו ראשון המשמש את המטופל על מנת לאשר כי אורגנואיד הגידול משחזר את המצב הקליני (כלומר, התגובה הטיפולית הקלינית)1,13,24,25.

ניתן לטפל באורגנואידים של הגידול גם באמצעות חומרים פרמקולוגיים חדשניים, המספקים גישה גישושית לזיהוי טיפולים חדשניים שניתן להשתמש בהם בקווי הטיפול הבאים במרפאה כאשר מוצו אפשרויות הטיפול הסטנדרטיות. התרבית מנוטרת ברציפות כדי להעריך את התגובה של תרביות אורגנואידים הגידול לסוכן בזמן אמת. בדיקת היתכנות של אפיון מולקולרי ואימונוהיסטוכימי של גידולי קסנוגרפט (PDX) ואורגנואידים שמקורם ב-PDX הראתה כי המורפולוגיה, ביטוי החלבונים והשינויים הגנומיים היו דומים בין שני המודלים. יתר על כן, מחקר הוכחת היתכנות פרמקוטיפינג הראה כי תחזיות in vivo ו- ex vivo היו גם דומות, ולפיכך, הגיע למסקנה כי שימוש באורגנואידים סרטניים כמודל סרטן/מחלה הוא גישה ישימה וחזקה שניתן ליישם במסגרת הקלינית².

מגוון אתגרים הקשורים להקמת תרביות אורגנואידים גידוליים שמקורם בסוגי גידולים שונים הודגשו כאן ונסקרו לאחרונה^26,27,28. נושאים מרכזיים כוללים "זיהום/צמיחת יתר" על ידי תאים בריאים, היוצרים אורגנואידים בעלי קצב גדילה גבוה יותר מאשר תאים סרטניים, העלות הגבוהה של תחזוקת תרבית בהשוואה לתרביות דו-ממדיות, שיעור ההקמה הנמוך, חוסר עקביות בפרופיל המוטציה הסומטית והיסטולוגיה בין תרבית האקס ויו לגידול המוצא, הטרוגניות הגידול הראשונית, שימוש במטריצה חוץ-תאית מבוססת מורין, אשר עשוי להיות לא אופטימלי עבור תאים אנושיים ועלול לעכב מתן תרופות, היעדר TME ותאים קשורים, התערבות של גורמי גדילה או מעכבים מולקולריים עם התגובה לתרופה, והיעדר פרוטוקולים סטנדרטיים ומתוקפים להקמה ותחזוקה של אורגנואידים סרטניים. עם זאת, עם השנים גדל השימוש במודלים ראשוניים של גידולים בחקר הסרטן, והשתפרו הטכניקות לתרבית ולשימור תרבויות ראשוניות. תרביות אקס ויו עדינות אלה מבוססות ומתוחזקות על ידי הוספת תוספים לקידום צמיחת תאים ויציבות. מעכב Rho קינאז (ROCK) מתווסף כעת באופן שגרתי לתרביות ראשוניות כדי למנוע אפופטוזיס ולשפר את הידבקות התא, ובכך לקדם את ההתרחבות ארוכת הטווח של תרביות ראשוניות במבחנה יציבות²⁹. יתר על כן, זה גם מגביר את ההישרדות של תאי גזע מופשרים cryopreserve, אשר חשוב בעת יצירת מלאי קפוא של תרביות אורגנואידים²⁹. תוספת עם הפרין עשויה לשמש גם כדי לשפר את ההתרחבות של תאי גזע על ידי הגברת איתות WNT ו- FGF, ובכך התפשטות תאים³⁰. ריאגנטים חשובים אחרים המשמשים בפרוטוקול מאומת זה כדי לייעל את התבססות אורגנואיד הגידול כוללים Accutase ו- DNase. Accutase הוא מגיב עיכול עדין מומלץ להפריד תאי גזע בודדים או לנתק אותם משטחי התרבית, והוא מסייע לשמור על קיום התא טוב יותר מאשר באמצעות ריאגנטים אחרים המיועדים למטרה זו, כגון טריפסין³¹. עם זאת, ניתן להשתמש בcollagenases גם כדי להתמקד ספציפית בסוג הקולגן המשולב בקרום המרתף הביולוגי. DNase משמש בשיטות בידוד תאים במשך שנים רבות³² כדי לחסל שאריות DNA מתאים מתים ונמק במהלך פרוטוקול המיצוי, ובכך למנוע גושים/צבירה של תאים עקב צמיגות מוגברת של הכנת הדגימה. כדורי תאים מטופלים לעתים קרובות עם חיץ ליזיס, אך ניתן לשלול שלב זה כאשר אין עדות נראית לעין לזיהום תאי דם אדומים בדגימת הרקמה⁸ (קובץ משלים 1).

ההקמה המוצלחת של אורגנואידים סרטניים אינה מגיעה ללא סיבוכים ביולוגיים אינהרנטיים. באופן אידיאלי, רקמות עבור תרביות אורגנואידים סרטניים צריכות להיות מעובדות באותו יום של הקציר כדי לייעל את כדאיות התא. הקפאת רקמות לא תמיד מומלצת מכיוון שהיא עשויה להפחית באופן משמעותי את כדאיות התא. עם זאת, ניתן לקבוע אורגנואידים סרטניים באמצעות דגימות שהוקפאו במהירות הבזק או נשמרו בהקפאה איטית בתווך הקפאה המכיל DMSO^33,34, המאפשר משלוח דגימות וביו-בנקאות. במקרים מסוימים, ניתן לקבל תרביות דו-ממדיות מתרביות אורגנואידים גידוליים שעברו מספר פעמים על ידי התאוששות תאי הגידול המחוברים ללוחות לאחר הסרת כיפות מטריצת קרום המרתף. מניסיוננו, שיעור ההצלחה של התבססות אורגנואידים סרטניים גבוה בהרבה ברקמת PDX PDAC מאשר ברקמת PDAC טרייה שמקורה בדגימה 4. זאת בשל העובדה כי חתיכות גדולות יותר של רקמת PDX PDAC טרי זמינים בדרך כלל, ורקמה זו יש תאים גבוהים יותר, ככל הנראה בשל הסביבה מסבירת פנים יותר in vivo המסופקת על ידי מודל PDX בהשוואה לגישות מבוססות ex vivo. ניתן להוסיף חומרים לא רעילים למדיום התרבית כדי לפקח על כדאיות התא והתפשטות התרבית. יתר על כן, יש להימנע מצמיחת יתר של אורגנואידים שאינם ניאופלסטיים באמצעות תנאים סלקטיביים^35,36. רקמת הלבלב עשויה להכיל אנזימי עיכול שעלולים להשפיע על יכולת הקיום של תאי הגידול המבודדים; לכן, טריפסין ניתן להוסיף לשלב העיכול כדי להתגבר על בעיה זו⁴. גורמים רבים נוספים, כגון מצב החולה/הרקמה (כלומר, מטופלים או לא מטופלים בטיפול אונקולוגי), סוג הגידול, זיהום הדגימה מחדר הניתוח והציון המקורי של הגידול, יכולים אף הם להשפיע באופן משמעותי על היכולת לבסס אורגנואיד גידולי. כמו כן, לא בכל רקמה יש מספיק תאי גידול ברי קיימא כדי לבסס תרביות ראשוניות. הדבר נכון במיוחד לגבי גידולי PDAC, הידועים לשמצה כעשירים בסטרומה (כ-90%-95%) ומכילים אחוז קטן של תאי גידול אפיתל. בנוסף, רקמות עם תכולת סטרומה גבוהה עשויות להיות קשות לחיתוך ולניתוק כדי להשיג תאי גידול בודדים לתרבית. ניתן להוסיף אמצעי עיכול מיוחדים וזמינים מסחרית, או להשתמש גם בציוד דיסוציאציה מכני אם הרקמה אינה מתעכלת במלואה. לחלופין, ניתן להשיג דיסוציאציה יסודית של הרקמה על ידי חיתוך רציף באמצעות שני להבי אזמל עד למראה נוזלי למחצה של הרקמה (ראה הדגמת וידאו).

ישנן מלכודות טכניות רבות במהלך ההליך כי יש גם להיות מודגש. לדוגמה, שאריות רקמה עשויות לחסום את המסנן, ואז יש לשנות את המסנן, מכיוון שהשאריות מעכבות את המעבר של הסופרנטנט הנוזלי. ניתן לחזור על שלב הסינון מספר פעמים כדי לשחזר את הכמות המקסימלית של תאי גידול מנותקים. יתר על כן, חשוב לבדוק את גלולת התא לאחר כל שלב בצנטריפוגה מכיוון שלעיתים קשה לראות מתי יש מספר תאים נמוך. הפיפטינג של כדורי התא צריך להתבצע בעדינות ובאיטיות, שכן פיפטינג אגרסיבי עלול לגרום לאובדן תאים או לירידה בכדאיות התא. יתר על כן, בעת הכנת תערובת תאי המטריצה, יש להשתמש במדיה מקוררת מראש ל -4 מעלות צלזיוס ובקצוות קירור המאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס, מכיוון שהמטריצה מתמצקת במהירות. לבסוף, וכאמור, DNase מסייע במניעת התגבשות תאים במהלך הכנת הדגימה. מומלץ גם לצטט את הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול ולהכין תערובות גורמי גדילה כדי למנוע הפשרה חוזרת ונשנית של הריאגנטים.

הבידוד של פיברובלסטים ראשוניים הוא מעניין, שכן הם סוג תא חשוב ב- PDAC וניתן להשתמש בהם לניסויים הבאים בתרבית משותפת כדי לקבוע את ההשפעות של TME על צמיחת תאי גידול. לאחר כשבוע, הפיברובלסטים נדדו אל מחוץ לחלקי הרקמה ובדרך כלל ניתן לראות אותם מחוברים לצלחות התרבית וגדלים כתרבית חד-שכבתית. עם זאת, נוכחות של פיברובלסטים בתרבות יש גם חסרונות, כפי שהם צורכים את החומרים המזינים מן המדיום התרבות, ובכך לסכן את הצמיחה האופטימלית של אורגנואידים הגידול. צלחות חיבור אולטרה-נמוכות (ULA) מומלצות לעתים קרובות לגידול אורגנואידים סרטניים כדי להגביל את צמיחת הפיברובלסטים, מכיוון שהם מתחברים בקלות לצלחות סטנדרטיות המטופלות בתרבית תאים. פרוטוקול מאומת זה ממליץ על שימוש במדיית DMEM סטנדרטית עם 10% FBS לתרבית של פיברובלסטים ראשוניים, אם כי ניתן להשתמש גם במדיה מיוחדת לפיברובלסטים.

חשוב לתעד את מצב תרבית האורגנואידים של הגידול לאורך זמן, במיוחד בשבוע הראשון, שכן התרבית מתנהגת באופן שונה בהתאם לאיכות הרקמה, כמותה ומקורה (גידולים ראשוניים הניתנים לכריתה בבני אדם לעומת PDXs). ניתן להוסיף חומרים לא רעילים למדיום התרבית כדי לפקח על כדאיות התא והתפשטות התרבית. התרביות חייבות להיות מנוטרות חזותית מדי יום במהלך 7 הימים הראשונים ולאחר מכן פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע. כמו כן, יש להחליף את המדיום כל 4-5 ימים או כאשר הוא נראה חומצי (נראה צהוב), תוך הקפדה שלא לפגוע בכיפות מטריצת קרום המרתף. בהתחלה, גושים חומים גדולים עשויים להופיע עקב צפיפות תאים גבוהה. עם זאת, זה צריך להיעלם לאחר המעבר הראשון, ובכך לאפשר אורגנואידים הגידול מוגדר בבירור להתקבל על רקע ברור של מטריצת קרום המרתף. מומלץ לצלם את אורגנואידי הגידול, במיוחד במהלך 3 השבועות הראשונים, על מנת לקבוע את הפנוטיפ החזותי ואת קצב הצמיחה של אורגנואידי הגידול. המעבר של תרבית אורגנואיד הגידול הוא גם אתגר טכני. בדרך כלל, מדיום התרבית מוסר, וכיפות המטריקס אינן משויכות לריאגנטים מבוססי טריפסין או מיוחדים ב -4 מעלות צלזיוס עד שמטריצת קרום המרתף מתמוססת לחלוטין. לאחר מכן משהה את גלולת התא מחדש במטריצה טרייה, והנפח מותאם לביצוע המעבר הרצוי, כגון 1:1 (תוך שימוש באותו נפח מטריצה כמו המקור) או 1:3 (הוספת פי שלושה מהנפח המקורי של הגישה). קבוצתו של דייוויד טובסון, המורכבת ממומחים לאורגנואידים של הלבלב, מספקת משאבים מקוונים עם פרוטוקולים להקמה, תחזוקה והכתמה של אורגנואידים בלבלב³⁷.

אורגנואידים לגידול ex vivo שמקורם במטופל מספקים מודל פרה-קליני רב ערך להערכת רגישות הטיפול הספציפי למטופל ליישום ברפואה מותאמת אישית. יתר על כן, מודלים אלה הם מודלים סרטניים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית בהשוואה לחד-שכבות מסורתיות של תאים דבקים דו-ממדיים. יש צורך במינוח ברור ועקבי של מודלים תלת-ממדיים של גידולים עם מעקב צילומי ותיאורי תקופתי של התרבית בתחום מודל הגידול. יתר על כן, עבודה עם פרוטוקולים סטנדרטיים היא בעלת חשיבות עליונה להצלחת טכנולוגיה זו במרפאה בקביעת רגישות לתרופה על בסיס ספציפי למטופל. חוקרים המשתמשים בטכנולוגיה זו צריכים להיות מודעים למכשולים ולמלכודות של מודלים רגישים ומורכבים אלה. עם זאת, עבודה עם פרוטוקול מאומת ותנאים מוגדרים בבירור ואפשרויות פתרון בעיות תסייע להימנע מבעיות טכניות ולייעל את ההקמה והתחזוקה של התרבות. כאן, פרוטוקול מאומת מסופק להקמת אורגנואידים סרטניים ובידוד פיברובלסטים שניתן ליישם בקלות במעבדות אונקולוגיות תרגומיות רבות עם ציוד סטנדרטי וניסיון בתרביות רקמה.

ללא.

מחקר זה נתמך על ידי מימון של Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי תחת הסכם מענק מס '857381, פרויקט VISION (אסטרטגיות לחיזוק מצוינות מדעית ויכולת חדשנות לאבחון מוקדם של סרטן מערכת העיכול), קול קורא לפרויקטים מחקריים חדשים עבור חוקרים קליניים וקבוצות מחקר מתפתחות IRYCIS (2021/0446), פרויקט אורגנואידים נגזרים ממטופל 2.0 (CIBERONC) ופרויקט TRANSCAN II JTC 2017 קוראים "הקמת אלגוריתם לאבחון מוקדם ומעקב אחר חולים עם גידולים נוירואנדוקריניים בלבלב (NExT)", מענק מספר 1.1.1.5/ERANET/20/03. הדגימות הביולוגיות המשמשות בפרוטוקול זה סופקו על ידי בית החולים BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) ושולבו בפלטפורמת Biobanks and Biomodels של ISCIII (PT20/00045). ברצוננו גם להודות לאיבון קוהל, אגאפי קטאקי ויטה רוביטה ותורסטן קנול על תמיכתם שלא תסולא בפז בפיתוח פרוטוקול זה כחלק מהפרויקטים של NExT ו-VISION.