ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות

כאן, מתוארת שיטה להפיכת רקמות הצמח לשקופות תוך שמירה על יציבות חלבונים פלואורסצנטיים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה עמוקה של רקמות צמחים מנוקות ללא חתך פיזי.

זה מאתגר להתבונן ישירות במבנה הפנימי של דגימות צמחים רב שכבתיות ואטומות, ללא ניתוח, תחת מיקרוסקופ. בנוסף, autofluorescence המיוחס כלורופיל מעכב את התצפית של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים. במשך זמן רב, ריאגנטים ניקוי שונים שימשו כדי להפוך את הצמחים שקופים. עם זאת, ריאגנטים ניקוי קונבנציונאלי להפחית אותות פלואורסצנטיים; לכן, לא ניתן היה לצפות במבנים התאיים והתאיים עם חלבונים פלואורסצנטיים. ריאגנטים פותחו שיכולים לנקות רקמות צמחיות על ידי הסרת כלורופיל תוך שמירה על יציבות חלבון פלואורסצנטי. פרוטוקול מפורט מסופק כאן עבור ניקוי אופטי של רקמות צמח באמצעות ריאגנטים ניקוי, ClearSee (CS) או ClearSeeAlpha (CSA). הכנת רקמות צמחיות מנוקות כרוכה בשלושה שלבים: קיבעון, כביסה ופינוי. קיבעון הוא צעד מכריע בשמירה על המבנים התאיים והיציבות התאית של חלבונים פלואורסצנטיים. זמן הדגירה לניקוי תלוי בסוג הרקמה ובמינים. ב - Arabidopsis thaliana, הזמן הנדרש לפינוי עם CS היה 4 ימים עבור עלים ושורשים, 7 ימים עבור שתילים, ו 1 חודש עבור pistils. CS גם נדרש זמן קצר יחסית של 4 ימים כדי להפוך את העלים gametophytic של Physcomitrium patens שקוף. לעומת זאת, pistils בטבק וטורניה מיוצר פיגמנט חום עקב חמצון במהלך טיפול במדעי המחשב. CSA הפחית את הפיגמנט החום על ידי מניעת חמצון ויכול להפוך את הטבק וטורניה pistils שקוף, אם כי זה לקח זמן רב יחסית (1 או 2 חודשים). CS ו- CSA היו תואמים גם עם כתמים באמצעות צבעים כימיים, כגון DAPI (4 ',6-diamidino-2-פנילינדולה) ו Hoechst 33342 עבור DNA ו Calcofluor לבן, SR2200, ואדום ישיר 23 עבור דופן התא. שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור הדמיה של צמח שלם כדי לחשוף מורפולוגיה שלמה, תהליכים התפתחותיים, אינטראקציות צמח-חיידקים, וזיהומים נמטודים.

הדמיה של מבנים תאיים ולוקליזציה של חלבונים באורגניזמים חיים חשובה להבהרת תפקידיהם ב- vivo. עם זאת, מכיוון שהגוף החי אינו שקוף, מאתגר להתבונן במבנה הפנימי של אורגניזמים חיים ללא ניתוח. במיוחד, במקרה של רקמות צמחיות, אשר מרובות שכבות עם תאים בצורות שונות, אי התאמה אינדקס הנגרמת על ידי המבנה שלהם ואת נוכחות של פיגמנטים סופגים אור הוא בעייתי. לדוגמה, לעלים צמחיים יש מבנה מורכב המאפשר להם לנצל ביעילות את האור שנכנס לגופם לפוטוסינתזה1, ואילו המבנה גורם גם לחוסר התאמה של מדד שבירה, מה שהופך אותם לקשים לצפייה. עם זאת, עלים יש פיגמנטים סופגים אור רבים, כגון כלורופיל, אשר פולטים פלואורסצנטיות אדומה חזקה פיגמנטים חומים מיוצרים על ידי ^{חמצון2,3}. פיגמנטים אלה גם מעכבים תצפיות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות בהר שלם בצמחים. לכן, עבור התבוננות במבנה הפנימי של צמחים, decolorization וקיבעון על ידי אלכוהול וניקוי באמצעות הידרציה כלורל שימשו במשך זמן רב כדי לחסל את אי התאמה אינדקס שבירה autofluorescence4,5. שיטות קונבנציונליות אלה אומצו במשך שנים רבות, אך יש להן את החיסרון של ביטול הפלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים בו זמנית ^6,7. זה בעייתי מאז חלבונים פלואורסצנטיים הפכו חיוניים בהדמיה פלואורסצנטית הנוכחית.

לכן, ClearSee (CS) ו ClearSeeAlpha (CSA) פותחו כריאגנטים ניקוי אופטי עבור רקמות צמחיות. שני ריאגנטים להפחית כלורופיל autofluorescence תוך שמירה על היציבות של חלבונים פלואורסצנטיים7,8. CSA שימושי במיוחד כאשר פיגמנטים חומים מיוצרים בשל חמצון רקמות. באמצעות ריאגנטים ניקוי אלה, ניתן לבחון את המבנה התאי ואת לוקליזציה חלבון בתוך הגוף הצמחי ללא חתך פיזי.

1. הכנת פתרונות סליקה

1. להכנת פתרון CS, להמיס 10% (w / v) קסיליטול, 15% (w / v) נתרן deoxycholate, ו 25% (w / v) אוריאה במים מזוקקים על מערבל מגנטי.
   הערה: אבקת נתרן deoxycholate צריך להיות נשקל בתא טיוטה כפי שהוא צף בקלות באוויר. ניתן לאחסן במדעי המחשב בטמפרטורת החדר בחושך במשך יותר משנה אחת.
2. כדי להכין פתרון CSA, להוסיף נתרן סולפיט (ריכוז סופי 50 mM) לפתרון CS המתקבל לעיל.
   הערה: הוסף נתרן סולפיט לפתרון הפקולטה למדעי המחשב ממש לפני השימוש כאשר הסוכן המפחית מתבטל בקלות.

2. הכנת הפתרון הקבוע

1. מעבירים 40 מ"ל של מים מעוקרים לתוך צינור חרוטי ומוסיפים 2 גרם של paraformaldehyde. הוסף 200 μL של 2 N NaOH כדי להגדיל את ה- pH של הפתרון. לאחר סגירה ואיטום הצינור עם parafilm, דגירה ב 60 °C (60 °F) עם היפוכים מדי פעם עד שהכל מתמוסס.
2. לאחר קירור הפתרון לטמפרטורת החדר, הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת מלח עם חוצץ פוספט 10x (PBS) כדי להתאים את ה-pH ל-7.4. מוסיפים מים מעוקרים כדי להפוך את הנפח ל 50 מ"ל.
   הערה: פתרון קבוע שהוכן טרי הוא מועדף. הפתרון יכול גם להיות מאוחסן ב -30 °C (50 °F) במשך מספר חודשים.

3. קיבוע של דגימות

1. טבול דגימות צמחים בתמיסה הקיבוצית במיקרו-טיוב (איור 1A), והבטיח שהנפח של הפתרון הקיבוצי הוא יותר מפי חמישה מנפח הדגימה.
2. לאטום את microtube עם parafilm ולעשות חורים באמצעות מחט. אין להשאיר את הצינור פתוח בשל סיכון של שפיכת מדגם במהלך הפחתת לחץ ואקום.
3. הניחו את המיקרו-צינור במייבש והתאמו לאט לאט את מידת הוואקום (~690 מ"מ כספית) כך שהבועות יופיעו בהדרגה מהדגימות (איור 1B-C). כבה את משאבת הוואקום לאחר פינוי המייבש. השאר את המיקרו-צינור ללא הפרעה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
4. לפרוק את המייבש בזהירות כדי למנוע הפרעה הדגימות. הפעל שוב את משאבת הוואקום וכבה אותה לאחר פינוי המייבש. השאר את המיקרו-צינור ללא הפרעה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: יש להקפיד על מניעת נזק לדגימות בעת אוורור התייבשות. החדירה של הפתרון הקיבוצי לדגימות משופרת על ידי שני טיפולי ואקום. טיפול ואקום נוסף מסייע לחדור את הפתרון הקיבוצי לדגימות עבות יותר.
5. פתח את התייבשות בזהירות מבלי להקפיץ את הפתרון הקיבוצי במיקרו-tube. באמצעות micropipette, להסיר את הפתרון הקיבוצי ולהוסיף 1x PBS. לאחר אחסון למשך דקה אחת, החליפו את ה-PBS הישן ב-PBS 1x חדש (איור 1D).

4. סליקה

1. לאחר הסרת PBS, הוסף פי חמישה מאמצעי האחסון לדוגמה של פתרון הסליקה.
2. לאטום את microtube עם parafilm ולעשות חורים באמצעות מחט. מניחים את הדגימות במייבש, להתפנות כמו בשלב 3.3, ולכבות את משאבת ואקום. השאר את המיקרו-צינור ללא הפרעה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
3. פתח את המייבש בעדינות. סגור את המיקרו-צינור עם parafilm ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר בחושך, כדי למנוע צילום הלבנה של חלבונים פלואורסצנטיים. הפוך את המיקרו-צינור כל 1-2 ימים כדי להאיץ את תהליך הסליקה.
4. כאשר פתרון הסליקה הופך לירוק, החלף אותו בפתרונות סליקה חדשים עד שהפתרון יישאר חסר צבע (איור 1E-H).

איור 1: הליך לטיפול במדעי המחשב. (א) שתיל Arabidopsis בפתרון PFA (Paraformaldehyde) של 4%. (B) המדגם ממוקם במייבש. (ג) השתיל קבוע תחת ואקום. (ד) השתיל ספוג בתמיסת PFA לאחר טיפול בוואקום. (ה) וכתוצאה מכך 3 ימים ניקוי פתרון טיפול שתיל. שים לב לצבע הירוק של פתרון הסליקה. (ו) פתרון הסליקה מוחלף 3 ימים לאחר הטיפול. (ז) וכתוצאה מכך 5 ימים ניקוי פתרון טיפול שתיל. (ח) פתרון הסליקה מוחלף 5 ימים לאחר הטיפול. סרגלי קנה מידה: 1 ס"מ (A, C-H) ו 5 ס"מ (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

5. כתמי צבע כימיים

1. למיקרו-צינור, הוסיפו את Hoechst 33342 (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל) להכתמה גרעינית או לבן קלקופלואור (ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל) להכתמת דופן התא והמתינו שעה אחת. לאחר הסרת תמיסת הצבע, לשטוף את הדגימה עם פתרון ניקוי טרי במשך 1 שעות.
   הערה: כתמים ושטיפה במהלך הלילה יכולים לשפר את חדירת הצבע הפלואורסצנטי לרקמות ולהפחית את פלואורסצנטיות הרקע. צבעים פלואורסצנטיים שונים תואמים לפתרון CS כגון Fuchsin9 בסיסי (ליגנין), אוראמין ^O9 (ליגנין, suberin, ו cutin), הנילוס ^Red9 (suberin), צהוב ישיר ⁹⁶⁹, אדום ישיר ²³⁹, ו SR220010,11 (קירות תא).

6. תצפית

1. חותכים יריעת גומי מסיליקון עם סכין גילוח כדי להכין מסגרת למרווח (איור 2A).
   הערה: התאם את עובי גיליון גומי הסיליקון בהתאם לעובי המדגם. כמו דגימות שטופלו עם פתרון ניקוי הם רכים, הם ייפגעו אם הם מכוסים ישירות עם זכוכית הכיסוי.
2. הניחו את מסגרת הסיליקון על זכוכית כיסוי (לדוגמה, 25 x 60 מ"מ) (איור 2B). מקם את הדגימות שטופלו בתוך המסגרת ולהוסיף ~ 100 μL של פתרון ניקוי כדי להסיר את כל הבועות במסגרת. מכסים בכוס כיסוי נוספת (18 x 18 מ"מ או 24 x 24 מ"מ) כדי למנוע אידוי של פתרון הסליקה (איור 2C).
3. שימו לב לדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר התצפית, החזירו את הדגימות לפתרון הסליקה שנלקח במיקרו-צינור ואחסנו בטמפרטורת החדר בחושך.

איור 2: הכנה מדגמית לתצפית מיקרוסקופית. (A) חותכים יריעת סיליקון בעובי 0.2 מ"מ למסגרת. (B) שים את מסגרת גיליון הסיליקון על זכוכית הכיסוי. (ג) מקם את הדגימה המטופלת בתמיסת ניקוי (המסומנת בגבול מנוקד) בתוך המסגרת וכסה אותה בכוס כיסוי. סרגלי קנה מידה: 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מדעי המחשב יכולים לנקות עלים של מינים שונים (איור 3A-H). קשה לפתרון הפקולטה למדעי המחשב לחדור עלה אורז מכיוון שמשטח העלה מכוסה בשעווה חותכת בצמח זה. עם זאת, לאחר חילוץ שעוות הציפורניים על ידי טבילה בכלורופורם במשך 10 שניות, CS יכול לנקות את עלי האורז (איור 3H). עם זאת, למדעי המחשב לא יכלו לחדור את עלי האאוטוזה של Chamaecyparis שהם פחות חדירים למדעי המחשב (איור 3I, J). בעלי החרצית נצפתה פיגמנטציה חומה הנגרמת על ידי חמצון פוליפנול בעלים שטופלו במדעי המחשב (איור 3K, L). באופן דומה, טבק וטורניה pistils הראו פיגמנטציה חומה במהלך הטיפול במדעי המחשב (איור 3M, O). מכיוון שרכיב הנתרן גופרתי ב-CSA מונע חמצון פוליפנול בשל ההשפעה המפחיתה, CSA יכול לנקות את הטבק ואת פיסטילים של טורניה ללא כל פיגמנטציה חומה (איור 3N, P).

איורים 4B מראים כי הטיפול במדעי המחשב הפחית את הצבע הירוק החיוור של עלה הארבידופסיס H2B-mClover (שדה בהיר) ושיפר את עוצמת הפלואורסצנטיות של H2B-mClover בהשוואה לדגירה PBS (איור 4A). בנוסף לצמחים פורחים, CS חל גם על צמחי טחב (איור 4C); לאחר 4 ימים של טיפול בפקולטה למדעי המחשב, הפלואורסצנטיות של H2B-mRFP זוהתה בבירור עבור כל המשחק כולו עם כלורופיל אוטופלואורסצנטיות מופחתת. איורים 4D,E מציגים תמונות שחזור תלת-ממדיות של ה-H2B-mClover pistil בניקוטיאנה בנת'מיאנה שנוקתה באמצעות CSA. עומק המדגם היה 440 מיקרומטר. כפי שמראה תמונת ההקרנה בעוצמה מרבית המקודדת לעומק, CSA מאפשר הדמיה עמוקה של רקמות מאתגרות, כגון pistils טבק.

CS ו- CSA היו תואמים גם עם כתמי צבע פלואורסצנטיים. איור 5 מראה שניתן להשתמש ב-CS בו-זמנית כדי לצפות בחלבון הפלואורסצנטי (H2B-mClover) ובכתמי צבע פלואורסצנטיים אורגניים (Calcofluor White). לאחר שחזור תלת-ממדי מתמונות מחסנית z, ניתן היה לצפות בכל מקטע.

איור 3: סליקה אופטית של עלים ופיסטילים באמצעות פתרונות סליקה. (A-L) עלים קבועים של מינים שונים דוגרו ב- PBS (A,C, E, G, I, K) או CS (B,D, F, H, J, L) במשך 8 ימים ו- CS (M,O) או CSA (N,P) במשך יומיים. (A,B, O, P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) מוריפולום חרצית, (M,N) Nicotiana benthamiana. סרגלי קנה מידה: 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמיית פלואורסצנטיות של רקמות שטופלו בפתרונות סליקה. (A,B) UBQ10pro::H2B-mClover עלים של טליאנה Arabidopsis טופלו עם PBS (A) או CS (B) במשך 3 ימים. (C) H2B-mRFP עלים של פטנס פיזיקומיטריום טופלו עם CS במשך 4 ימים. הגרעינים סומנו עם H2B-mRFP (ירוק). הטיפול במדעי המחשב הפחית את כמות הכלורופיל האוטופלואורסצנטית (מגנטה). האות H2B-mRFP באזור apical נצפתה בבירור הן עבור תמונות ממוזגות של H2B-mRFP והן autofluorescence או שדה בהיר. (ד, ה) סטיגמת UBQ10pro::H2B-mClover סטיגמת ניקוטיאנה בנת'מיאנה טופלה ב- CSA במשך חודש אחד. הקרנה בעצימות מרבית (D) והקרנה בעוצמה מרבית (E) מקודדת עומק נוצרו מתמונות 88 z-stack במרווחי זמן של 5 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה: 100 מיקרומטר. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה (A,B), קונפוקל (C) ושני פוטונים (D,E). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: כתמי צבע פלואורסצנטיים תואמים ל-CS. (A) עלים שטופלו ב-CS שנצפו על ידי מיקרוסקופיה של עירור שני פוטונים עם עירור של 950 ננומטר. דופן התא מוכתמת בלבן קלקופלואור (ציאן). גרעינים מסומנים עם UBQ10pro::H2B-mClover (צהוב). התמונות yz (B) ו- xz (C) הן חתכים במיקום שצוין על-ידי הקווים המסווגים הלבנים ב- (A). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: שקיפות של נתרן דוקסיכולאט. (A) צבעים של 15% דיוקסיכולטים נתרן שונים ( המפורטים בטבלת החומרים). (B) ספקטרום פלואורסצנטיות של כל 15% נתרן deoxycholate עם עירור 380 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שיטה זו מורכבת מקיבעון, כביסה וניקוי. קיבעון הוא צעד קריטי בפרוטוקול זה. אם חלבון פלואורסצנטי לא נצפה לאחר קיבוע PFA, זה לא יהיה נצפה לאחר הטיפול עם פתרון ניקוי. החדירה של פתרון PFA לתוך רקמות היא קריטית, אבל טיפול ואקום גבוה אינו מומלץ כי זה יכול להרוס את מבנה התא. תנאי ואקום ותקופות קיבעון צריך להיות ממוטב עבור כל סוג של רקמות ומינים. מומלץ לבדוק חלבונים פלואורסצנטיים גם לאחר קיבוע. למרות דגימות היו קבועים בדרך כלל במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר, הם יכולים להיות קבועים ב 4 °C (4 ° C ( 4 ° C ( (לילה או יותר).

כפי שניתן לראות באיור 6A, לחלק מהנתרן דאוקסיכולטים היה צבע צהוב-חיוור בעת ההמסה. פתרונות כאלה של נתרן דאוקסיכולט הראו זרימה אוטומטית חזקה באזור 400-600 ננומטר לאחר עירור ב-380 ננומטר (איור 6B). זרם אוטומטי זה מונע ניקוי אופטי והדמיה פלואורסצנטית. משתמשים צריכים לבדוק את הצבע של פתרון נתרן deoxycholate כמו איכות הריאגנט עשוי להיות שונה בשל טוהר, וריאציה הרבה למגרש, או סיבות אחרות.

פתרונות הסליקה המשמשים כאן יש ריכוזים גבוהים של נתרן deoxycholate, אשר יכול להרוס את מבנה הממברנה. סמן קרום הפלזמה (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) נצפתה גם לאחר טיפול ^CS7. עם זאת, ייתכן שעדיף להפחית את הריכוז של נתרן deoxycholate, בהתאם למבנה ורקמת העניין. ואכן, תמונות עם בהירות משופרת הושגו עבור pistils Arabidopsis עם CS שונה, שבו הריכוז של נתרן deoxycholate מופחת בחצי; עם זאת, ריכוזים מופחתים של נתרן deoxycholate נדרש זמני טיפול ממושכים (למשל, 1 חודש עבור pistils Arabidopsis ).

CS יכול להפחית את autofluorescence אדום (>610 ננומטר) כדי להסיר כלורופיל בדגימות שטופלו. עם זאת, 500-600 ננומטר טווח autofluorescence (צהוב לכתום) נשאר אפילו בדגימות שטופלו ^CS7. זה autofluorescence הוא חשב נגזר דופן התא ורכיבים תאיים אחרים, כגון ^lignin12,13. לכן, קשה לעשות רקמות, כגון גבעולים עם קירות משניים מפותחים, שקוף לחלוטין על ידי טיפול במדעי המחשב.

מספר ריאגנטים ניקוי מלבד אלה המשמשים כאן פותחו כדי לצפות חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית14,15,16,17. בהשוואה לשיטות אלה, CS ו- CSA להסיר כלורופיל ולהפחית autofluorescence, מה שהופך את רקמות הצמח שקופות יותר. לאחרונה, Sakamoto ואח ' פיתח שיטה משופרת, iTOMEI, לקיבעון, ניקוי דטרגנטים, הרכבה כדי להתאים את אי התאמה אינדקס ^שבירה18. בשתילים Arabidopsis, iTOMEI ניקה את הרקמה בתוך 26 שעות.

CS חל על מגוון רחב של מיני צמחים, כגון Arabidopsis thaliana, Physcomitrium ^patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, אבוקדו21, ^שעורה22, Brassica rapa23, Callitriche ²⁴, אקליפטוס25, ^תירס26, מרצ'נטיה פולימורפ27, מונופילאאה גלאברה28, אורובנצ'ה מינור29, פטוניה30, ^אורז31, סולנום ליקופרסיקום32, פולי ^סויה33, תות ^שדה34, ^חיטה35, וולפיאלה היאלינה36. עבור רקמות עבות יותר, CS יכול גם להפוך את מקטעי הרטט לשקופים ^37,38. שיטה זו אפשרה מחקרים של המבנה התאי ודפוסי ביטוי הגנים ^{בצמחים37,38}. יתר על כן, זיהומים נמטודות20,39, זיהומים פטרייתיים, וסימביוזה19,40,41 נצפו גם עמוק בתוך הרקמות שטופלו ב- CS. לפיכך, שיטה זו שימושית להדמיית רקמות שלמות ממיקרו-קשקשים ועד קשקשי מאקרו ויכולה לעזור לגלות אינטראקציות חדשניות בין תאים, רקמות, איברים ואורגניזמים שונים.

ClearSee ממוסחר (Fujifilm Wako טהור כימי תאגיד, יפן). אוניברסיטת נגויה מחזיקה בפטנט (JP6601842) על ריאגנט הסליקה ClearSee. ד. קוריהארה הוא ממציא הפטנטים. המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (מענק בסיוע למחקר מדעי על תחומים חדשניים (JP16H06464, JP16H06280 ל- T.H.), מענק סיוע למחקר מדעי (B, JP17H03697 ל- D.K.), מענק בסיוע למחקר אקספלורציה מאתגר (JP18K19331 ל- D.K.), מענק בסיוע למחקר מדעי על תחומים חדשניים (JP20H0H053358 עבור D.K.)) וסוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית (תוכנית PRESTO (JPMJPR15QC עד Y.M., JPMJPR18K4 לD.K.)). המחברים מודים למרכז ההדמיה החיה במכון לביו-מולקולות טרנספורמטיביות (WPI-ITbM) של אוניברסיטת נגויה על תמיכתם במחקרים המיקרוסקופיים ובעריכה (www.editage.com) לעריכת השפה האנגלית.