שיטות תרבות ישירות ועקיפות לחקר חומרי שתל מתכלים במבחנה

אנו מציגים שלוש שיטות של תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה להערכת תאימות במבחנה של חומרי שתל מתכלים מתכלים. שיטות הפריה חוץ גופית אלה מחקות אינטראקציות שונות של שתל תא vivo וניתן ליישם אותן כדי ללמוד חומרים מתכלים שונים.

במהלך העשורים האחרונים, חומרים מתכלים נחקרו בהרחבה עבור יישומים ביו-רפואיים כגון שתלים אורתופדיים, דנטליים וקרניומקסיופסיאליים. כדי לסנן חומרים מתכלים עבור יישומים ביו-רפואיים, יש צורך להעריך חומרים אלה במונחים של תגובות תא במבחנה , ציטוקי תאימות, ו ציטוטוקסיות. תקני הארגון הבינלאומי לתקנון (ISO) נוצלו באופן נרחב בהערכת ביו-חומרים. עם זאת, רוב תקני ISO נקבעו במקור כדי להעריך את הציטוטוקסיות של חומרים שאינם מתכלים, ובכך לספק ערך מוגבל לסינון חומרים מתכלים.

מאמר זה מציג ודן בשלוש שיטות תרבות שונות, כלומר, שיטת תרבות ישירה, שיטת תרבות חשיפה ישירה ושיטת תרבות חשיפה להערכת תאימות במבחנה של חומרי שתל מתכלים מתכלים, כולל פולימרים מתכלים, קרמיקה, מתכות ומרוכבים שלהם, עם סוגי תאים שונים. מחקרים הראו כי שיטות תרבות משפיעות על תגובות התאים לחומרים מתכלים מכיוון שהשפלה הדינמית שלהם גורמת להבדלים מרחביים בממשק ובסביבה המקומית. באופן ספציפי, שיטת התרבות הישירה חושפת את התגובות של תאים שנזרעו ישירות על השתלים; שיטת תרבות החשיפה הישירה מבהירה את התגובות של תאים מארחים מבוססים שבאים במגע עם השתלים; ושיטת תרבות החשיפה מעריכה את התאים המארחים שנקבעו שאינם נמצאים במגע ישיר עם השתלים אך מושפעים מהשינויים בסביבה המקומית עקב התדרדרות השתל.

מאמר זה מספק דוגמאות לשלוש שיטות תרבית אלה לחקר הציות במבחנה של חומרי שתל מתכלים והאינטראקציות שלהם עם תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (BMSCs). הוא גם מתאר כיצד לקצור, מעבר, תרבות, זרע, זרע, לתקן, כתם, לאפיין את התאים, ולנתח מדיה וחומרים פוסט תרבותיים. שיטות הפריה חוץ גופית המתוארות במאמר זה מחקות תרחישים שונים של סביבת in vivo , הרחבת הישימות והרלוונטיות של בדיקות ציטו-תאימות במבחנה של ביו-חומרים שונים עבור יישומים ביו-רפואיים שונים.

במשך עשרות שנים, חומרים מתכלים נחקרו בהרחבה ונעשה בהם שימוש ביישומים ביו-רפואיים כגון יישומים אורתופדיים ^כגון אורתופדיים ^1,2, ^{שיניים, 3,4}, ו craniomaxillofacial5 יישומים. שלא כמו שתלים וחומרים קבועים, מתכות מתכלות, קרמיקה, פולימרים ומרוכבים שלהם בהדרגה להתפרק בגוף לאורך זמן באמצעות תגובות כימיות שונות בסביבה הפיזיולוגית. לדוגמה, מתכות מתכלות כגון סגסוגות מגנזיום (מ"ג)^1,6,7 ואבץ (Zn) ^{סגסוגות8,9} הם חומרים מבטיחים עבור מכשירי קיבוע עצם. ההתכלות שלהם יכולה לבטל את הצורך בניתוחים משניים כדי להסיר את השתלים לאחר ריפוי העצם. קרמיקה מתכלה כגון מלט סידן פוספט (CPCs) הראו פוטנציאל מרגש לטיפול בשברים דחיסת חוליות אוסטאופורוטית בקיפופלסטיקה ^{מלעורית10}. ה- CPCs מספקים תמיכה מכנית לגוף החוליות השבור ומתפרקים בהדרגה לאחר שהשבר החלים.

פולימרים מתכלים, כגון כמה פוליסכרידים ופוליאסטרים, נחקרו גם הם בהרחבה עבור יישומים ביו-רפואיים. לדוגמה, הידרוג'ל צ'יטוסן כפוליסכריד מתכלה הפגין את יכולותיו למניעת זיהום והתחדשות רקמת ^העור11. חומצה פולי-L-לקטית (PLLA), פולי(חומצה גליקולית) (PGA) וחומצה פולי(לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) נחקרות באופן נרחב עבור ייצור פיגומים נקבוביים דו-ממדיים או תלת-ממדיים עבור יישומי הנדסת רקמות12,13,144. יתר על כן, חומרים מרוכבים לשלב שני שלבים או יותר של מתכות, קרמיקה, ופולימרים כדי לספק פונקציות מתקדמות עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים15,16,17. לדוגמה, PLGA וסידן פוספט מרוכבים ניתן להשתמש כדי לפברק פיגומים מתכלים עבור יישומים כגון תיקון פגמים עצם ^{הגולגולת18}. פיגומים ושתלים מתכלים אלה יכולים לתמוך ולקדם את הצמיחה של תאים ורקמות ולאחר מכן בהדרגה להתפרק בגוף לאורך זמן.

כפי שמוצג בטבלה משלימה 1, חומרים מתכלים שונים עשויים להיות בעלי מנגנוני השפלה, מוצרים ותעריפים מגוונים. לדוגמה, סגסוגות מגנזיום, כגון Mg-2 wt % Zn-0.5 wt % Ca (ZC21)¹, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)¹⁹, ו Mg-9 wt% Al-1 wt% אבץ (AZ91)²⁰, להתפרק על ידי תגובה עם מים, ומוצרי השפלה שלהם כוללים בעיקר ^{Mg2 +} יונים, OH^- יונים, גז _H2, ותצהירים מינרליים. שיעור ההשפלה של מתכות מתכלות משתנה בהתאם להרכבים, הגיאומטריות וסביבות ההשפלה השונות שלהן. לדוגמה, Cipriano et ^al.19 דיווח כי חוטי ZSr41 (Ø1.1 × 15 מ"מ) איבדו 85% מסה בעוד חוטי Mg טהורים עם אותה גיאומטריה איבדו 40% מסה לאחר שהושתלו בשוקה החולדה במשך 47 ימים. חומרים קרמיים מתכלים כגון הידרוקסיאפטיט (HA) ופוספט β-טריקלציום (β-TCP) יכולים להתפרק באמצעות פירוק נוזלי חוץ-תאי מונחה פתרון או להתפרק לחלקיקים קטנים ולאחר מכן להתפרק באמצעות פירוק נוזלים חוץ-תאיים ותהליכי ספיגה בתיווך תאים. מוצרי השפלה של קרמיקה מבוססת סידן פוספט אלה עשויים לכלול ^{Ca2 +} יונים, (_PO4)^3- יונים, OH^- יונים, תצהירים ^{מינרליים21}. שיעור ההשפלה עבור קרמיקה סידן פוספט מושפע באופן משמעותי על ידי מבני הגביש שלהם. לדוגמה, ואן Blitterswijk et ^al.22 דיווח כי HA עם 40 vol.% micropores לא לאבד שום מסה בעוד β-TCP עם 40 vol.% מיקרופוריות איבדו 30 ± 4% מסה לאחר שהושתל בשוקה של ארנבות במשך 3 חודשים. פולימרים כגון ^PLGA14,23 עלולים להתפרק עקב הידרוליזה של הצמדות אסתר בנוכחות מים, ומוצרי השפלה כוללים בעיקר חומצות לקטיות וגליקוליות. זה יכול לקחת חודש אחד עבור PLGA 50/50 וכמה חודשים עבור PLGA 95/5 כדי להשיג השפלה ^מלאה24.

תגובה תאית ובדיקות תאימות הן קריטיות להערכה וסינון של חומרי שתל מתכלים אלה עבור יישומים ביו-רפואיים. עם זאת, הסטנדרטים הנוכחיים של הארגון הבינלאומי לתקנות (ISO), כגון ISO 10993-5:2009 "הערכה ביולוגית של מכשירים רפואיים-חלק 5 בדיקות עבור ציטוטוקסיות במבחנה", תוכננו בתחילה כדי להעריך את הציטוטוקסיות של ביו-חומרים מתכלים כגון סגסוגות Ti וסגסוגות Cr-Co במבחנה25. באופן ספציפי, ISO 10993-5:2009 מכסה רק את בדיקות הציטוטוקסיות במבחנה של התמצית, מגע ישיר, ובדיקות מגע עקיפות. בבדיקת התמצית, התמצית מוכנה על ידי טבילת דגימות בנוזלי מיצוי כגון מדיה תרבותית עם סרום ופתרונות מלוחים פיזיולוגיים תחת אחד מתנאי הזמן והטמפרטורה הסטנדרטיים. התמצית או הדילול שנאספו מתווספים לאחר מכן לתרבות התא כדי ללמוד ציטוטוקסיות. עבור בדיקת מגע ישיר, מגע ישיר בין מדגם ותאים מושגת על ידי הצבת דגימת הבדיקה על שכבת התא הוקמה (דבק). במבחן המגע העקיף, מדיה התרבות המכילה סרום אגר מומס הוא pipetted כדי לכסות את התאים שנקבעו. לאחר מכן המדגם ממוקם על שכבת אגר המוצקה עם או בלי מסנן.

תקני ISO הראו מגבלות מסוימות כאשר מוחלים על הערכת חומרים מתכלים במבחנה. שלא כמו חומרים בלתי מתכלים, התנהגויות ההשפלה של חומרים מתכלים הן דינמיות ועשויות להשתנות בזמן אחר או בתנאים סביבתיים מגוונים (למשל, טמפרטורה, לחות, הרכב מדיה וסוג תא). בדיקת התמצית רק מעריכה את הציטוטוקסיות של תוצרי השפלה של החומר ואינה משקפת את התהליך הדינמי של השפלה מדגם. בדיקות מגע ישירות ועקיפות של תקן ISO מאפיינות רק את האינטראקציות בין התאים והדגימות שנקבעו. יתר על כן, במבחן המגע העקיף, החומרים והתאים נמצאים במיקרו-סביבה שונים שאינם משקפים את סביבת in vivo ואינם לוכדים את ההשפלה הדינמית של חומרים מתכלים.

מטרת מאמר זה היא להציג ולדון בשיטות בדיקת הציטו-תאימות לחומרי שתל מתכלים שונים כדי לטפל במגבלות הנ"ל של השיטות המתוארות בתקני ISO הנוכחיים. השיטות המוצגות במאמר זה מתייחסות להתנהגות ההשפלה הדינמית של חומרי השתלה ולנסיבות השונות של אינטראקציות בין תאים לחומרים ב- vivo. באופן ספציפי, מאמר זה מספק שלוש שיטות לבדיקת ציטושים, כלומר תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה לחומרים מתכלים שונים, כולל פולימרים מתכלים, קרמיקה, מתכות ומרוכבים שלהם ליישומי שתלים רפואיים.

בשיטת התרבות הישירה, תאים התלויים בתקשורת התרבות נזרעים ישירות על הדגימות, ובכך מעריכים את האינטראקציות בין תאים חדשים שנזרעו לבין השתלים. בתרבית החשיפה הישירה, הדגימות ממוקמות ישירות על שכבת התא שנקבעה כדי לחקות את האינטראקציות של שתלים עם תאים מארחים מבוססים בגוף. בתרבית החשיפה, הדגימות ממוקמות בתוספות הבאר שלהם ולאחר מכן מוצגות לבארות התרבות עם תאים מבוססים, המאפיינים את התגובות של תאים מבוססים לשינויים בסביבה המקומית הנגרמים על ידי השפלת שתל כאשר אין להם מגע ישיר עם שתלים. התרבות הישירה ושיטות תרבית החשיפה הישירה מעריכות את התאים במישרין או בעקיפין במגע עם חומרי השתל באותה תרבות היטב. תרבית החשיפה מאפיינת את התאים במגע עקיף עם חומרי השתל במרחק שנקבע באותה תרבות היטב.

מאמר זה מציג תיאור מפורט של בדיקות הציטו-תאימות לחומרים מתכלים שונים והאינטראקציות שלהם עם תאי מודל, כלומר, תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (BMSCs). הפרוטוקולים כוללים קצירה, פולחן, זריעה, תיקון, הכתמה והדמיה של התאים, יחד עם ניתוחים של חומרים פוסט-תרבותיים ומדיה, החלים על מגוון חומרי שתל מתכלים ומגוון רחב של סוגי תאים. שיטות אלה שימושיות לסינון חומרים מתכלים עבור יישומים ביו-רפואיים שונים במונחים של תגובות תאים וציות במבחנה.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה בריברסייד (UCR) לקצירת תאים ורקמות. חולדת ספראג-דולי (SD) בת 12 שבועות מוצגת כדוגמה בסרטון. נקבות צעירות יותר ועכברושים זכרים עדיפים.

1. הכנה לתרבות התא

הערה: שלוש שיטות התרבות המתוארות במאמר זה ישימות בדרך כלל עבור סוגי תאים שונים התואמים. כאן, BMSCs שנקטפו מגמילה חולדה יוצגו כדוגמה להכנת תרבית תאים. בהתאם לרלוונטיות שלהם עבור יישומים רפואיים ספציפיים, סוגים שונים של תאים עשויים להיות מנוצלים, כולל תאים ראשוניים שנקטפו מבעלי חיים או תורמים אנושיים וקווי תאים מבנק תאים / רקמות.

1. קצירת BMSCs מגמילה מעכברושים
   הערה: הדיאגרמה השרטוטית באיור 1 מציגה את השלבים לקציר BMSCs מגמילה מעכברושים.
   1. המתת חסד החולדה Sprague דולי (SD) על ידי שאיפת _CO2 .
   2. הסר את העור והשרירים ורקמות החיבור כדי לנתח את עצם הירך מתוך החולדה המתת חסד. מניחים את עצמות הירך בצינור חרוטי 15 מ"ל (פוליפרופילן) המכיל מדיום תרבית תאים. מניחים את הצינורות החרוטיים על קרח עד למועד ביצוע חילוץ התא.
      הערה: שוקה יכולה לשמש גם כדי לקצור BMSCs. מדיום תרבית התאים הוא מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).
   3. מעבירים את העצמות לצלחת פטרי בארון הבטיחות הביולוגי. חותכים את קצות העצם באמצעות להב כירורגי ולשטוף את מוח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל (פוליפרופילן) על ידי שטיפת חלל מח העצם עם מדיה תרבית התא באמצעות מזרק עם מחט 251/2 G.
      הערה: הכנס מזרק עם מחט של 18 גרם למדיה עם מח עצם. לאט ובעדינות, לקחת ולחלק את המדיה כדי לשבור את הנתח הגדול של מח העצם עד שאין תאים גלויים / רקמה agglomerates נוכחים.
   4. לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסנן 70 מיקרומטר, ואחריו צנטריפוגה ב 126 × גרם (1,000 סל"ד) במשך 5 דקות כדי לקבל את כדורי התא.
   5. שאפו את המדיה העל-טבעית וחידשו עם 10 מ"ל של מדיה טרייה. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי resuspend התאים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.
   6. פיפטה המתלה ישירות בחלק התחתון הפנימי של בקבוקון T-75 ולהוסיף מדיה כדי להביא את עוצמת הקול עד 25 מ"ל. תרבית את התאים באינקובטור בסביבת תרבית תאים סטרילית סטנדרטית (כלומר, 37 מעלות צלזיוס, אטמוספרה לחה עם 5% _CO2 ו-95% אוויר).
   7. לאחר 3-7 ימים, לשטוף את התאים שאינם טהורים על ידי שאיפה המדיום הישן וחידוש עם מדיום טרי. המשך להקדיש ולהאכיל את התאים במדיום טרי עד שיהיו מוכנים למעבר תאים, הקפאה או שימוש בניסוי.
2. תחזוקת תאים
   1. שנה את מדיום תרבית התא באופן קבוע כדי להסיר מוצרי פסולת תאית ולחדש את החומרים המזינים בערך כל יומיים עד שהתאים הם 90%-100% יחד. ב 90% מפגש, מעבר, להקפיא, או להשתמש בתאים בניסוי.
   2. תאים חולפים
      הערה: Passaging, המכונה גם תת-תרבות, הוא מונח החל בכל פעם שתאים מועברים מתרבות אחת לאחרת. תאים שנקטפו זה עתה נמצאים בשלב המעבר 0 (_P0). הכמויות של פתרון חומצה טריפסין-אתילנדימינטטראצטט (טריפסין-EDTA) ומדיה המתוארת במאמר זה הן עבור בקבוקון T-75.
      1. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר כי התאים הם 90% יחד.
      2. שאפו את המדיום מבקבוק התא.
      3. יש לפזר 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) לתוך הבקבוקון באמצעות פיפטה סרולוגית. בעדינות לטלטל את הבקבוק כדי לשטוף את התאים עם PBS; לשאוף את כל PBS.
         הערה: שלב זה משמש כשטיפה נוספת כדי להבטיח שלא יועברו תאים מתים או פסולת תאית במהלך המעבר.
      4. יש לפזר 3 מ"ל של טריפסין-EDTA לתוך בקבוקון התא ישירות על פני השטח של התאים. נענעו בעדינות את הבקבוקון כדי להבטיח שכל פני השטח עם התאים מכוסים על ידי הטריפסין-EDTA.
      5. מניחים את בקבוקון התא עם טריפסין-EDTA לתוך האינקובטור במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק.
      6. לאחר 5 דקות באינקובטור, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר כי התאים מנותקים. אם חלק מהתאים לא התנתקו, הקישו בעדינות על הצד של בקבוקון התא ובדקו שוב את הבקבוקון.
      7. הוסיפו 9 מ"ל של מדיום טרי לבקבוקון התא כדי לדלל את הטריפסין-EDTA. זה מספק חלבונים נגישים יותר עבור טריפסין-EDTA להיקשר במקום lysing התאים.
      8. פיפטה את התאים במדיה טריפסין-EDTA ולחלק אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים ב 126 × גרם (1,000 סל"ד) במשך 5 דקות.
      9. מבלי להפריע לכדור התא, שאפו את המדיום עם טריפסין-EDTA.
      10. הוסיפו 5-10 מ"ל של מדיה טרייה לצינור הצנטריפוגה והוסיפו בעדינות את התאים במדיום באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
      11. פיפטה התאים תלויים בינוני מתוך צינור הצנטריפוגה לפצל את הנפח לתוך 2-3 בקבוקונים תרבית טריים. הוסף מספיק בינוני כדי להביא את הנפח הבינוני הכולל ל-25 מ"ל עבור כל בקבוקון.
          הערה: יחס הפיצול במהלך תת-תרבות עשוי להשתנות בהתאם לסוגי התאים ולמאפייני הצמיחה הספציפיים.
      12. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי והחזר אותם לאינקובטור.
   3. הקפאת תאים
      1. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר כי התאים הם 90% יחד.
      2. חזור על שלבים 1.2.2.2 עד 1.2.2.9.
      3. הוסף 900 μL של בינוני טרי לצינור הצנטריפוגה עם 100-1000 μL micropipette. לאט ובעדינות מחדש תאים במדיום באמצעות אותה מיקרופיפט.
      4. העבר את ההשעיה תא 900 μL לתוך cryovial. הוסף 100 μL של דימתילסולפוקסיד (DMSO).
      5. בהקדם האפשרי, למקם את cryovial לתוך מיכל קצף גלילי שנועד לווסת את ירידת הטמפרטורה (ראה את טבלת החומרים). מניחים את מיכל הקצף במקפיא -80 °C (80 °F).
   4. הפשרת תאים
      1. להפשיר את התאים הקפואים באמבט המים. קח צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל מלא 5 מ"ל של בינוני טרי, למקם את התאים בצינור החרוטי, וצנטריפוגה ב 126 × גרם (1,000 סל"ד) במשך 5 דקות.
      2. שאפו את המדיום המכיל את DMSO.
      3. הוסף 5-10 מ"ל של מדיום טרי לצינור החרוטי 15 מ"ל של תאים. לאט ובעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי respend התאים.
      4. פיפטה התאים תלויים בינוני מתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ולחלק לתוך בקבוקון T-75 חדש. בעת חלוקת תאים, השתמש בתנועה גורפת כדי להפיץ את התאים באופן שווה ככל האפשר בתחתית בקבוקון התא.
      5. הוסיפו מספיק מדיום טרי כדי להביא את הנפח הבינוני הכולל ל-25 מ"ל עבור כל בקבוק T-75.
      6. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אופטי והנח את בקבוקון התא בחזרה לתוך האינקובטור.

2. הכנה ועיקור מדגם

1. הכנה לדוגמה
   1. השתמש בלוחות שטופלו בתרבית רקמות כגון לוחות שטופלו בתרבית רקמות כגון 6, 12, 24, 48 או 96 well עבור ניסויים בתרבית תאים המתוארים במאמר זה. בחר את סוג לוחות תרבית הרקמות ואת נפח המדיום בכל באר בהתבסס על עיצובים ניסיוניים שונים כגון ממד מדגם.
2. לחטא או לחטא את כל הדגימות המתכלות לפני תרבית התא.
   הערה: חיטוי מקובל עבור in vitro מחקרים כאשר הדגימות נוטות לשינויים כימיים ו/או פני השטח בתנאי עיקור מסוימים הכוללים חום גבוה, חמצון ו/או רדיקלים. שיטות עיקור או חיטוי עבור סוגי מדגמים שונים משתנות בהתאם למאפיינים השונים של החומרים, כגון פולימרים, מתכות וקרמיקה. תהליך העיקור או החיטוי יכול לכלול חום, גז, קרינה, כימיקלים, לחץ גבוה או שילוב של אלה.
   1. מתכות מתכלות
      1. באופן כללי, השתמש בקרינה אולטרה סגולה (UV) לחיטוי מתכות מתכלות למחקרי הפריה חוץ גופית .
         הערה: לדוגמה, ג'אנג ואח ' דיווח כי מגנזיום טהור (מ"ג) ו ZC21 דגימות סגסוגת מ ג עברו חיטוי תחת קרינת UV במשך 4 שעות לפני שהם נוצלו במחקרי ^התא1. עבור במחקרים vivo , הדגימות נדרשות בדרך כלל להיות מעוקר. עבור מתכות מתכלות רבות כגון מגנזיום או סגסוגות מגנזיום, יש להימנע משעבוד אוטומטי באמצעות קיטור מכיוון שדגימות אלה יכולות להיות מחומצנות או חלודות ^במים6. צלחת קוורץ מומלצת לחיטוי UV מכיוון שהיא מספקת שקיפות UV טובה יותר מרוב הכוסות והפלסטיק.
      2. לחטא דגימות סגסוגת Mg תחת חום יבש בתנור או autoclave בטווח הטמפרטורה של 100-200 °C (600 °F).
         הערה: כמו כמה סגסוגות מתכתיות עדיין יכול להיות מחומצן על פני השטח בטמפרטורות גבוהות באוויר, קרינה בעוצמה גבוהה עשוי לשמש כחלופה במקרים מסוימים. עם זאת, קרינה בעוצמה גבוהה כגון קרינת אלפא או גמא יש להימנע בעת עיקור רדידים מתכתיים דקים. זה עלול לגרום תזוזת אטום בתוך החומרים, שינוי המבנה הזעיר של חומרים.
      3. השתמש עיקור גז תחמוצת אתילן (EtO) כשיטה חלופית למתכות מתכלות רגישות לחום ^{וקרינה26}.
   2. קרמיקה מתכלה
      1. בדרך כלל, לחטא קרמיקה מתכלה באמצעות קרינת UV או 70% פתרון אתנול לפני מחקרי הפריה חוץ גופית .
         הערה: לדוגמה, ליו ואח ' דיווח כי דגימות סידן פוספט היו מחוטאים באמצעות טבילה 70% אתנול עבור 1 שעה וחשיפה לאור UV במשך 12 שעות בכל צד לפני שהם שימשו במבחן vitro ציטו ^{תאימות27}.
      2. השתמש autoclaves כדי לחטא קרמיקה מתכלה אם טמפרטורה גבוהה אדי מים אינם פוגעים קומפוסטים שלהם מיקרו מבנים.
         הערה: חלק מהקרמיקה עשויה להיות מושפעת מהליכה אוטומטית. לדוגמה, שינוי פאזה וגסות פני השטח נמצאו כאשר קרמיקה זירקוניה מיוצבת yttria היו autoclaved ב 121 °C (60 °F) במשך 15 דקות. בנוסף, לא ניתן לעקר CPCs באמצעות autoclaving עם קיטור כי הדגימות יגיבו עם מים.
      3. השתמש בשיטות עיקור חלופיות כגון קרינת קובלט-60 עבור קרמיקת זירקוניה המיוצבת לעיל ודגימות ^CPC28.
   3. פולימרים מתכלים
      1. באופן כללי, לחטא פולימרים מתכלים באמצעות קרינת UV או 70% אתנול לפני השימוש בהם במחקרי תאים במבחנה.
         הערה: פולימרים מסוימים עשויים לעבור שינויים כימיים תחת קרינת UV. עבור עיקור, טיפול קרני גמא כגון קרינת קובלט-60 עשוי לשמש. לדוגמה, אבקות עמילן עוקרו תחת קרינת קובלט-60 לפני שנעשה בהם שימוש במחקרי אין ויטרו ^תאים29.
      2. חומרים פולימריים אוטומטיים שיכולים לעמוד בטמפרטורה ולחות גבוהות.
         הערה: לדוגמה, פולימרים כגון פוליפרופילן יכולים להיות autoclaved כפי שהם יכולים לסבול טמפרטורות autoclaving (כלומר, 121-134 °C (65 °F). פולימרים מסוימים כגון polycaprolactone (PCL) לא ניתן autoclaved בגלל נקודות ההיתוך הנמוכות יחסית שלהם (כלומר, סביב 60 °C)³⁰.
      3. השתמש בגז EtO כדי לחטא חומרים פולימריים רגישים לחיטוי חום או קרינה.

3. שיטות תרבית תאים

1. שיטות תרבות ישירה
   הערה: הדיאגרמה הסכמטית באיור 2A מציגה את שלבי שיטת התרבות הישירה. במאמר זה, BMSCs היו תרבית על צלחת נגזר Mg להציב בתוך הבארות של צלחת 12-well-תרבות רקמות מטופלים כדוגמה כדי להמחיש את שיטת התרבות.
   1. בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.2.2.1-1.2.2.10 כדי לקבל את ההשעיה הסלולרית.
   2. השתמש בקבוקון 90% confluent כדי לקבוע את ריכוז התא בהשעיית התא באמצעות hemocytometer. לדלל את ההשעיה התא באמצעות בינוני טרי לריכוז התא שנקבע הדרוש למחקר התא במבחנה.
      הערה: צפיפות הזריעה של תאים נקבעת על ידי התכנון הניסיוני. לדוגמה, צפיפות תאים של 2,000-40,000 תאים / ^cm2 שימשו במחקרי תאים שונים עם חומרים מתכלים.
   3. מניחים את הדגימות (צלחת Mg) במרכז לוחות תרבית רקמות מטופלים היטב. ברצף, לשטוף את לוחות התרבות עם 2 מ"ל של PBS ו 2 מ"ל של DMEM כדי לכייל את הלחץ האוסמוטי בתנאים סטריליים. הוסף 3 מ"ל של השעיית התא המדולל לתוך כל באר על דגימות של עניין.
   4. תרבית התאים באינקובטור בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות.
      הערה: זמן התרבות עשוי להיות ארוך או קצר יותר מ- 24 שעות בהתאם לעיצוב הניסיוני.
2. תרביות חשיפה ישירה
   הערה: הדיאגרמה הסכמטית באיור 2B מציגה את השלבים של תרבות החשיפה הישירה.
   1. כפי שמתואר בשלבים 3.1.1.1 ו 3.1.2, להכין את ההשעיה התא עם הריכוזים הנדרשים של תאים המבוססים על העיצוב הניסיוני עבור סוגי תאים שונים ויישומים מיועדים.
   2. יש לשטוף את לוחות התרבות עם 2 מ"ל של PBS ו-2 מ"ל של DMEM ברצף כדי לכייל את הלחץ האוסמוטי בתנאים סטריליים. הוסף 3 מ"ל של השעיית התא המדולל לתוך כל באר. תרבית התאים באינקובטור הלח בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים במשך 24 שעות או עד שהתאים מגיעים למפגש של 50-80%.
      הערה: רמת המפגש בין התאים עשויה להשתנות עבור סוגי תאים שונים ועיצוב ניסיוני.
   3. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים בצלחת הבאר עם PBS באמצעות פיפטה כדי להסיר תאים מתים צפים.
   4. מניחים את הדגימות המחוטאות או המעוקרות ישירות על התאים הדבוקים. מוסיפים 3 מ"ל של מדיום טרי לתוך כל באר.
   5. תרבית את התאים בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות נוספות.
      הערה: זמן התרבות עשוי להיות ארוך או קצר יותר מ- 24 שעות בהתאם לעיצוב הניסיוני.
3. תרביות חשיפה
   הערה: הדיאגרמה השרטוטית באיור 2C מציגה את שלבי שיטת תרבות החשיפה.
   1. השלבים הראשוניים להכנת התא זהים לתרבות החשיפה. כמתואר בשלבים 3.1.1 ו 3.1.2, להכין את השעיית התא עם התאים הרצויים. בדומה לשלבים 3.2.1 ו 3.2.2, זרעו את התאים בצלחת הבאר בצפיפות הרצויה ותרבית אותם בחממה בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות.
   2. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים דבקים עם PBS כדי להסיר תאים מתים צפים, ואחריו תוספת של 3 מ"ל של מדיום טרי לתוך כל באר.
   3. לאחר מכן, מניחים את הדגימות בתוספות באר עם גודל נקבובית ממברנה של 0.4 מיקרומטר ומניחים את התוספות היטב עם הדגימות לתוך כל באר עם התאים.
   4. תרבית את התאים בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים למשך 24 שעות נוספות.
      הערה: זמן התרבות עשוי להיות ארוך או קצר יותר מ- 24 שעות בהתאם לעיצוב הניסיוני.

4. אפיון פוסט-תרבותי של תאים

הערה: לתרבות ישירה ולתרבית חשיפה ישירה, תקן, כתם, תמונה וניתח את התאים הנדבקים הן בלוחות והן בדגימות. לתרבית החשיפה, נתחו את התאים שנדבקו ללוחות הבאר.

1. קיבוע תאים
   1. לאסוף את המדיום postculture מכל באר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המתאים לניתוח נוסף. לאסוף את כל הדגימות לאחר התרבות לניתוח נוסף.
   2. לשטוף את התאים דבק על שתי דגימות וצלחות היטב 3 פעמים באמצעות PBS.
   3. הוסף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA, 10% פורמלין חוצץ נייטרלי) לתוך כל צלחת באר. שים את המכסה בחזרה על צלחת הבאר ולאפשר PFA להגיב במשך 20 דקות.
   4. לאחר 20 דקות, לשאוף PFA ולחלק אותו לתוך בקבוק פסולת. לשטוף את צלחת הבאר 3 פעמים באמצעות PBS כדי להסיר את PFA, ולהעביר את הפסולת לבקבוק הפסולת.
2. כתמי תאים
   1. הכן את מלאי העבודה של סוכני הכתמים בהתאם להוראות היצרנים.
      הערה: לדוגמה, Alexa Fluor 488 Phalloidin משמש להכתמת F-actin, ו 4′, 6-diamidino-2-פנילינדולה (DAPI) משמש להכתמת גרעיני תאים. זמן ההכתמה עשוי להצטמצם אם הדגימות מתפרקות במהירות בתמיסות ההכתמה.
   2. הוסף 200-400 μL של אלקסה פלואור מדולל 488 Phalloidin מכתים סוכן לכל באר כדי לכסות את התאים על צלחת הבאר ואת המדגם. לעטוף את צלחת הבאר בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור, ולאפשר Alexa Fluor 488 Phalloidin להגיב במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. לאסוף את Alexa פלואור 488 Phalloidin מכתים סוכן ולחלק אותו לתוך בקבוק הפסולת המתאים. לשטוף את צלחת הבאר 3 פעמים באמצעות PBS כדי להסיר את עודף Alexa Fluor 488 Phalloidin, ולחלק את PBS בשימוש לתוך בקבוק הפסולת המתאים.
   4. הוסף 200-400 μL של DAPI מדולל לכל באר כדי לכסות את התאים בבאר ועל המדגם. לעטוף את צלחת הבאר בנייר אלומיניום ולאפשר DAPI להגיב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. לאסוף את DAPI ולחלק אותו לתוך בקבוק הפסולת המתאים. לשטוף את צלחת הבאר 3 פעמים באמצעות PBS כדי להסיר את DAPI, ולחלק את PBS בשימוש לתוך בקבוק הפסולת המתאים.
3. הדמיה סלולרית
   1. לאחר ההכתמה, דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במידת האפשר, צלמו תמונות ניגודיות פאזה של תאים בנוסף לתמונות פלואורסצנטיות. דמיינו את התאים על הדגימות המתכלות בהקדם האפשרי או מיד לאחר ההכתמה כדי למנוע או להפחית שינויים אפשריים הנגרמים על ידי השפלה מתמשכת של דגימות. אחסן את התאים בלוחות הבאר בתמיסת חיץ בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס לאחר הקיבעון, וצלם את התאים בהקדם האפשרי לאחר ההכתמה כדי למנוע אובדן אותות פלואורסצנטיים.
   2. עבור תרבות ישירה ותרבות חשיפה ישירה, דמיינו והעריכו שני סוגי תאים: (1) התאים על הדגימות (במגע ישיר עם הדגימות) ו-(2) התאים הנדבקים בלוח הבאר המקיף את הדגימות (מגע עקיף עם הדגימות), כפי שמוצג באיור 3A.
   3. לתרבות החשיפה, כפי שמוצג באיור 3B, השתמשו במדריך תמונה בעת צילום תמונות הפלואורסצנטיות של תאים כדי לקבוע אם תגובת התא תהיה שונה בתגובה למעבר ההשפלה הדינמי של הדגימות. צלם וניתח את התאים הממוקמים באזור בתוך הטבעת הפנימית (במרחק של 3.5 מ"מ מהמרכז) ואת הטבעת החיצונית (במרחק של 7 מ"מ מהמרכז) בנפרד.
      הערה: מדריך התמונה משמש להגדרת המרחק בין התאים והדגימות.
   4. עבור כל דגימה וגם בלוחות התרבות, צלם באופן אקראי לפחות חמש תמונות מכל אזור מעניין שבו התאים נמצאים במגע ישיר או במגע עקיף עם הדגימות במרחק מוגדר מראש.
4. ניתוח תמונה
   1. עבור כל תמונות התא המתקבלות משלב 4.3, כימת את המורפולוגיה של התא על-ידי מדידת אזור התפשטות התא ויחס הגובה-רוחב באמצעות תוכנה כגון ImageJ לניתוח תמונה.
   2. ספור את מספר התאים בכל אזור תמונה. חשב את צפיפות ההדבקה בתא בתנאי מגע ישירים ועקיפים כמספר התאים ליחידת שטח.

5. ניתוחים פוסט-תרבותיים של מדיה ודגימות

1. מדוד את ה- pH של מדיום פוסט-תרבותי.
   הערה: דגימות מסוימות משנות את ערך ה- pH של המדיום במהלך השפלתן. לדוגמה, מתכות מתכלות כגון סגסוגות מגנזיום בדרך כלל להגדיל את ערך ה- pH של המדיום בשל השפלה ^שלהם31. לעומת זאת, פולימרים מתכלים כגון PLGA לעתים קרובות להקטין את ערך ה- pH של המדיום כאשר הם משפילים ³². מדידת ערך ה- pH של מדיום פוסט-תרבותי יכולה להצביע על השפלה של דגימות אלה במבחנה.
   1. לפני קיבוע תאים, לאסוף את המדיום פוסט-תרבותי כמו בשלב 4.1.1.
   2. מדוד את ערכי ה- pH של מדיום הפוסט-תרבותי בכל באר מיד לאחר האיסוף, באמצעות מד pH מכויל מראש.
      הערה: ה- pH של התקשורת עלול להיסחף לאורך זמן בגלל תנאים סביבתיים כגון רמת _CO2 וטמפרטורה, אשר יש לקחת בחשבון.
2. לנתח את הרכבים בינוניים עבור התנהגות השפלה של דגימות מתכלות. עבור דגימות מסוימות הגורמות לשינוי צבע של המדיום, מדוד את ערך הצפיפות האופטית (O.D.) של המדיום שלאחר התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר או קורא מיקרופלט כדי לקבוע את התנהגות ההשפלה. לחלופין, יש להשתמש בספקטרוסקופיה גלויה אולטרה סגולה (UV-VIS) וב-Fourier transform infrared spectroscopy-מוחלשת של רפלקטוריה כוללת (FTIR-ATR) כדי לנתח את מוצרי ההשפלה במדיום הפוסט-תרבותי.
   הערה: מדידת מוצרי השפלה במדיום שלאחר התרבות היא בעלת ערך להבנת התנהגות ההשפלה של הדגימות. אחת הגישות הנפוצות ביותר היא למדוד את יוני העניין במדיום הפוסט-תרבותי באמצעות ספקטרומטר פליטת פלזמה אופטית מצמידה אינדוקטיבית (ICP-OES). ניתן להשתמש ב- ICP-OES כדי למדוד את הרכבי המדיום הפוסט-תרבותי של מתכות וקרמיקה, אך ייתכן שאינו מתאים לפולימרים. פולימרים מורכבים בדרך כלל מפחמן, מימן וחמצן, וכימות מדויק של יסודות אלה קשה עבור ICP-OES.
   1. לאחר שלב 5.1.2 למדידת pH, לאסוף ולדלל את המדיום באמצעות גורם דילול רצוי למדידות אופטימליות של ריכוזי יונים.
   2. מדוד את הריכוזים של יונים של עניין במדיום שלאחר התרבות באמצעות ICP-OES.
3. ניתוח פוסט-תרבותי של דגימות
   הערה: לאחר מחקר תאי הפריה חוץ גופית , הדגימות המתכלות עשויות להשתנות בממד, במסה, במורפולוגיה של פני השטח, במיקרו-מבנה ובהרכב. ניתוח פוסט-תרבותי של דגימות מסייע להבין את מנגנון ההשפלה של דגימות.
   1. לאחר תרבית התא, צלם את תצלומי הדגימות כדי להציג שינויים אפשריים בממד המדגם, בצבע, במורפולוגיה ובמאפיינים גלויים אחרים.
   2. יבש או ייבש את דגימות הפוסט-תרבותיות ומדוד את מסת המדגם, הממד והנפח כדי לכמת כל שינוי במסה, בממד ובנפח.
   3. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאפיין את המיקרו-מבנה והמורפולוגיה של הדגימות. השתמש ספקטרוסקופיה רנטגן פיזור אנרגיה (EDX) ו עקיפה רנטגן (XRD) כדי לאפיין את ההרכב ואת השלב של מוצרי השפלה על הדגימות. השתמש FTIR-ATR כדי לזהות את מליטה כימית על משטחי המדגם.

איור 4 מציג את תמונות הפלואורסצנטיות הייצוגיות של BMSCs בתנאי מגע ישירים ועקיפים באמצעות שיטות תרבות שונות. איור 4A,B מציג את חומצות BMSCs בתנאי מגע ישירים ועקיפים לאחר אותה תרבות ישירה של 24 שעות עם סגסוגות מגנזיום ZC21111. סגסוגות ZC21 מורכבות מ-97.5 wt% מגנזיום, 2 wt% אבץ ו-0.5 wt% סידן. התאים שאין להם מגע ישיר עם דגימות סגסוגת ZC21 להתפשט טוב יותר מאשר אלה שיש להם מגע ישיר עם הדגימות. כפי שניתן לראות באיור 4C,D, התאים בתנאי מגע ישירים ועקיפים מציגים מורפולוגיה רגילה לאחר חשיפה ישירה של 24 שעות עם הידרוג'ל חומצה היאלורונית (HyA) המקושרים על ידי יונים ^Fe3+ . עם זאת, מספר התאים בתנאי המגע העקיף נמוך מזה שתחת תנאי המגע ^הישיר33. מחקר אחר דיווח על ההשפעות של השפלה של סגסוגות ZSr41 (ф = 1.1 מ"מ) על BMSCs לאחר תרבות חשיפה 24 ^שעות19. סגסוגות ZSr41 מורכבות מ-95 wt% מגנזיום, 4 wt% אבץ ו-1 wt% סטרונציום. איור 4E מציג את תמונות הפלואורסצנטיות הייצוגיות של BMSCs שדבקות בתרבות היטב במיקום המרוחק 3.5 מ"מ ממרכז הבאר, לאחר תרבות חשיפה של 24 שעות עם הפינים המתכלים19.

איור 5 מציג את הנתונים לדוגמה עבור צפיפות הידבקות תאים מכמתת. כפי שניתן לראות באיור 5A, בתרבית החשיפה הישירה (24h_DE) של 24 שעות, BMSCs במגע ישיר עם ZC21 יש צפיפות הידבקות תאים גדולה משמעותית מכל קבוצה אחרת. בתרבית הישירה של 24 שעות (24h_D), BMSCs במגע ישיר עם ZC21 מראים צפיפות הידבקות תאים גבוהה משמעותית מאשר קבוצת Mg, נמוכה משמעותית מקבוצת הייחוס זכוכית, אך אין הבדל סטטיסטי בהשוואה לבקרת סגסוגת Ti (T64). כפי שניתן לראות באיור 5B, בתנאי המגע העקיף של תרבות החשיפה הישירה, צפיפות ההידבקות של BMSC גבוהה משמעותית עבור קבוצת ZC21 מאשר קבוצת Mg. עם זאת, הוא אינו מראה הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצות הבקרה T64 ותאים בלבד. במצב המגע העקיף של תרבות ישירה, צפיפות ההידבקות של BMSC גבוהה משמעותית עבור קבוצת ZC21 מאשר עבור קבוצת Mg, אך אינה מראה הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצות הבקרה T64 ותאים ^בלבד1.

איור 6A מציג את ערך החומציות של מדיום פוסט-תרבותי לאחר תרבות החשיפה הישירה והתרבות הישירה. עבור תרבות החשיפה הישירה, ערכי ה- pH של טווח בינוני בין 8.3 ל- 8.4 עבור כל הדגימות. בתרבות הישירה, ערכי ה- pH של טווח בינוני בין 7.9 ל -8 על פני הקבוצות. איור 9B מציג את ריכוז היונים ^Mg2+ במדיום שלאחר התרבות. הן בתרבות החשיפה הישירה והן בתרבות הישירה, ריכוזי היונים ^Mg2+ בקבוצות ZC21 ו- Mg גבוהים משמעותית מאשר בכל קבוצות בקרה ^אחרות1. איור 7 מציג את דפוסי ה-XRD עבור ZSr41 ו-Mg טהור לאחר תרבות חשיפה של 3 ימים. באיור 7A, השלבים הגבישיים של Mg, Ca(OH)₂, ZnO, MgO∙_H2O, Ca(HPO4)(_H2O)₂ ו-Ca5(_PO4)₃(OH) (כלומר הידרוקסיאפטיט או HA), _Mg17Sr2 נמצאים על פני השטח של ZSr41. באיור 7B, השלבים הגבישיים של Mg, Ca(OH)₂, _Mg3(_PO4)₂, _Mg7(_PO4)₂(OH)₈, Ca2P2O7∙_5H2O נמצאים על פני השטח של ^Mg19 טהור. איור 8A מציג את שכבת העל של תמונות SEM ומפות EDX של הרכב יסוד פני השטח עבור Mg מצופה Mg ואת השליטה של מצעים וזכוכית Mg לאחר 24 שעות של תרבות ישירה עם BMSCs. איור 8B מציג את ההרכב היסודי של פני השטח הכמותי של משטחי המדגם, המציין תצהירים שונים שנוצרו במהלך תרבית ^התא34.

איור 1: דיאגרמה סכמטית המציגה את השלבים לקציר BMSCs מגמילה מעכברושים. נתון זה משתנה ^מ-35. קיצור: BMSCs = תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דיאגרמה סכמטית המציגה את שלוש שיטות תרבית התאים. (א) תרבות ישירה, (ב) תרבות חשיפה ישירה ו- (ג) תרבות חשיפה. נתון זה משתנה ^מ-36. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דיאגרמות סכמטיות המציגות תרבות ישירה ותרבות חשיפה ישירה. (א) תאים הנמצאים תחת מגע ישיר ותנאי מגע עקיפים בתרבות ישירה ובתרבית חשיפה ישירה. (ב) שימוש במדריך הדמיה לצילום תאים שנדבקו ללוח הבאר במרחקים שונים ממרכז הדגימות בתרבית החשיפה. איור 3B משתנה מ ^{- 37}. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של BMSCs. (A, B) תנאי מגע ישירים ועקיפים לאחר תרבות ישירה של 24 שעות עם סגסוגות ZC21. (ג, ד) תרבות חשיפה ישירה עם הידרוג'ל HyA. (E) על צלחת התרבות לאחר תרבות חשיפה של 24 שעות עם סגסוגות ZSr41. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. A ו - B משוחזרים מ ¹; C ו - D משוחזרים מ ^{- 33}; ו-E משוחזר ^מ-19. קיצורים: BMSCs = תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם; HyA = חומצה היאלורונית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תוצאות כמותיות עבור צפיפות הידבקות תאים של BMSCs. (A) מגע ישיר ותנאי מגע עקיפים (ב) לאחר תרבות החשיפה הישירה של 24 שעות (24 h_DE) ותרבות ישירה (24 h_D). נתון זה משוחזר מ ^{- 1}. קיצורים: BMSCs = תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם; DE = תרבות חשיפה ישירה; D = תרבות ישירה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תוצאות מייצגות לניתוחים פוסט-תרבותיים של מדיום לאחר תרבות החשיפה הישירה של 24 שעות ותרבות ישירה. (A) ערכי pH וריכוזי יונים מסוג ^Mg2+ (B). נתון זה משוחזר מ^{- 1}. קיצורים: DE = תרבות חשיפה ישירה; D = תרבות ישירה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: תוצאות פוסט-תרבותיות מייצגות לניתוחי שלבים של דגימות מתכתיות מתכלות לאחר 3 ימים של תרבות עם BMSCs. (A) ספקטרום עקיפה של קרני רנטגן עבור ZSr41. (B) ספקטרום XRD עבור Mg טהור. נתון זה משוחזר ^מ-19. קיצורים: BMSCs = תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם; XRD = עקיפה של קרני רנטגן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: תוצאות פוסט-תרבותיות מייצגות לניתוחי שטח של דגימות לאחר 24 שעות של תרבות ישירה עם BMSCs, כולל מיקרו-מבנה פני השטח, מורפולוגיה והרכב. (A) שכבת-על של תמונות SEM ומפות EDX של הרכב יסוד פני השטח עבור Mg מצופה Mg., בקרת Mg שאינה מצופה והתייחסות לזכוכית. (B) הרכב יסוד פני השטח (ב. %) מכמת מניתוחי EDX. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. שוחזר ^מ-34. קיצורים: BMSCs = תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם; SEM = סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים; EDX = ספקטרוסקופיית רנטגן פיזור אנרגיה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: מנגנוני השפלה, מוצרים ותעריפים עבור סוגים שונים של חומרים, והתוצאות שנאספו עבור המדגם שלאחר התרבות וניתוח בינוני. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

שיטות שונות של תרבית תאים יכולות לשמש כדי להעריך את ציטו-תאימות במבחנה של ביו-חומרים של עניין עבור היבטים שונים של יישומים ב vivo. מאמר זה מדגים שלוש שיטות תרבות הפריה חוץ גופית , כלומר תרבות ישירה, תרבות חשיפה ישירה ותרבות חשיפה, כדי לחקות תרחישים שונים של vivo שבהם נעשה שימוש בחומרי השתלה מתכלים בתוך גוף האדם. שיטת התרבות הישירה משמשת בעיקר להערכת התנהגותם של תאים חדשים שנזרעו ישירות דבקים בחומרי השתל וסביבתם. שיטת תרבית החשיפה הישירה מחקה את תרחיש in vivo שבו חומרי השתל באים במגע ישיר עם התאים והרקמות שנקבעו. ניתן להשתמש בשיטת תרבית החשיפה כדי להראות כיצד מוצרי ההשפלה מחומרי השתל והשינויים במיקרו-סביבה המקומית יכולים להשפיע על התאים והרקמות שנקבעו שאינם במגע ישיר עם חומרי השתל.

בתרבות הישירה, התאים החדשים שנזרעו בתנאי מגע ישירים ועקיפים מוערכים. בתרבית החשיפה הישירה, ניתן להעריך תאים מבוססים בתנאי מגע ישירים ועקיפים כאחד. בתרבית החשיפה, ניתן להעריך רק תאים מבוססים בתנאי מגע עקיפים. התאים החדשים שנזרעו בתנאי מגע ישירים בתרבית הישירה מושפעים מתכונות חומריות ומשינויים הנגרמים על ידי חומרים במדיום כגון השינויים בריכוז היונים ובערך ה- pH.

תכונות החומר הנ"ל עשויות לכלול מורפולוגיה על פני השטח, הידרופיליות, אנרגיה חופשית על פני השטח, נוקשות והרכב. התאים החדשים שנזרעו בתנאי מגע עקיפים בשיטת התרבות הישירה וכל התאים שהוקמו בתרבית החשיפה הישירה ובשיטות תרבות החשיפה מושפעים בעיקר משינויים הנגרמים על ידי חומרים במדיום. שלוש השיטות השונות המתוארות במאמר זה קרובות יותר לתרחיש המעשי של סביבת in vivo מאשר שיטות קונבנציונליות כגון שיטת החילוץ הבינוני. שיטת החילוץ הבינונית רק מעריכה את הציטוטוקסיות של מוצרי השפלה של החומר ואינה משקפת את התהליך הדינמי של השפלה מדגם. בשיטות התרבות המתוארות במאמר זה, כאשר התאים מתורבתים עם חומרי השתל, השינוי הדינמי של החומרים המתכלים והסביבה הבינונית יכול להשפיע על התאים במקום.

למרות שאין מחקרי הפריה חוץ גופית שיכולים להחליף לחלוטין במחקרי vivo , מחקרים במבחנה משלימים ויכולים לספק נתונים בעלי ערך באופן בעלות נמוכה ויעילה. במחקרים vivo בדרך כלל כוללים את כל המשתנים המרובים במודל, בעוד בתרבית תאים במבחנה יכול ללמוד את ההשפעות של גורם יחיד על אינטראקציות תא-חומר. השיטות שהוצגו במאמר זה יכולות לחקות תרחישים שונים של הרלוונטיים במחקרי vivo . אנו יכולים ליצור את הקשרים בין משתנים שונים כדי לספק תוספי תזונה עבור מחקרי vivo . דגם in vivo כולל בדרך כלל רק את אותה רקמה בסוג של בעלי חיים. עם זאת, אין ויטרו מחקרים יכולים לכלול סוגי תאים שונים בתרבות אחת, אשר יכול ללמוד את ההשפעות המשולבות של משתנים שונים על אינטראקציות תא-חומר. יתר על כן, קשה יחסית ללמוד את ההשפעות של שינויים סביבתיים דינמיים על אינטראקציות בין תאים לחומר במודלים של vivo . השיטות המתוארות במאמר זה יכולות לחקור את ההשפעות של שינויים דינמיים כגון ריכוזי יונים במדיום על התנהגות ^התא38.

השיטות המוצגות במאמר זה ישימות להבנת הציטוטיות במבחנה של כל סוגי החומרים, כולל פולימרים, מתכות, קרמיקה, מרוכבים וננו-חלקיקים, וקביעת האינטראקציות שלהם עם תאים, חיידקים או פטריות שונים בהתבסס על היישומים המיועדים. לדוגמה, שו ואח ' העריך את הציטוט במבחנה של הידרוג'לים מבוססי HyA עם BMSCs באמצעות שיטת תרבות החשיפה ^{הישירה33}. צפיפות הידבקות תאים ומורפולוגיות תאים נותחו בתנאי מגע ישירים ועקיפים. הציטוטוקסיות של מרוכבים הידרוג'ל מבוססי HyA עשויה להיות קשורה לריכוזים של יונים ^Fe3+ ו- H ⁺ ששוחררו מההידרוגלים המקושרים של HyA במהלך ניסוי תרבית התאים. טיאן ואח ' תאי urothelial אנושיים מתורבתים (HUCs) עם ארבע סגסוגות Mg שונות עבור 24 שעות ו 48 שעות באמצעות שיטת תרבות החשיפה ומוצרי השפלה בלתי מסיסים שלהם של MgO ו Mg(OH)₂ עבור 24 שעות באמצעות תרבות חשיפה ישירה לחקור התנהגויות ציטוטיות והשפלה של סגסוגות Mg המכילות אבץ (Zn) וסטרונציום (Sr) עבור יישום סטנט השופכה ^{פוטנציאלי39} . במחקר זה, ZSr41_B המכיל 4 wt% Zn ו 0.5 wt% Sr נמצא שיש ציטוקי תאימות טובה יותר עם HUCs בין כל סגסוגות Mg-4Zn-xSr האחרות הן 24 שעות ו 48 h תרבויות חשיפה. התוצאות הראו גם כי לא נמצאו תאים דבקים גלויים על צלחת הבאר כאשר הריכוזים של תחמוצת מגנזיום (MgO) ומגנזיום הידרוקסיד (Mg(OH)₂) עלה על 1.0 מ"ג / מ"ל לאחר 24 שעות של תרבות חשיפה ישירה. לכן, טיאן ואח ' הגיע למסקנה כי הפחתת שיעורי השפלה של סגסוגות Mg יש צורך לשלוט על תופעות הלוואי האפשריות לקראת תרגום קליני עתידי. Wetteland et al. יצר ננו-קומפוזיט מבוסס פולימר על ידי פיזור הידרוקסיאפטיט (nHA) וננו-חלקיקי nMgO בפולימר PLGA ^מתכלה40. ננו-קומפוזיט זה נחקר על ידי כת BMSCs עם דגימות שונות באמצעות שיטת התרבות הישירה. התוצאות הראו כי פיזור משופר של חלקיקים בפולימר יכול לשפר הידבקות BMSC על nHA / PLGA אבל להקטין את הכדאיות של התא על nMgO / PLGA. בהתבסס על התוצאות של מחקרי תאי הפריה חוץ גופית , Wetteland ואח ' דיווחו על תובנה רבת ערך להנדסת ננו-קומפוזיטים קרמיים/פולימריים אופטימליים עבור יישומים ביו-רפואיים שונים.

ניתן לראות ולכמת מורפולוגיות תאים ומספרי תאים בתמונות פלואורסצנטיות באמצעות תוכנה לניתוח תמונה כמותית כגון ImageJ. אנו יכולים לחקור את ההשפעות של חומרים שונים על הידבקות תאים ומורפולוגיה על ידי כימות צפיפות הידבקות התא, יחסי רוחב-גובה של התאים ואזורי התפשטות התאים עבור קבוצות מדגם שונות. המורפולוגיה של תאים מקבוצת הביקורת הריקה, שבה רק התאים מתורבתים במדיום, יכולה לשמש כסטנדרט התייחסות ללא כל השפעה מחומרי מדגם. אנו יכולים לקבוע אם חומרי המדגם ישפיעו על הידבקות תאים ומורפולוגיה במבחנה על ידי השוואת צפיפות הידבקות התאים ומורפולוגיות התאים של קבוצות המדגם עם אלה של הפקד הריק. אזור התפשטות התא חושף את ההעדפה של הידבקות תאים על פני השטח המדגם, ומראה כיצד התאים מקיימים אינטראקציה עם חומרי המדגם. במאמר זה, צמצמנו את זמן התגובה עבור כתמי DAPI להיות פחות מהזמן האופטימלי המומלץ על ידי הספק כי דגימות מתכלות, כגון מגנזיום טהור, להתפרק במהירות בפתרונות מימיים. המורפולוגיה של תאים דבוקים לחומרים מתכלים עשוי להשתנות אם תהליך ההכתמה לוקח יותר מדי זמן וזמן החשיפה למים ארוך מדי עבור הדגימות. יתר על כן, עבור התאים דבקים בחומרים מתכלים, תמונות תאים יש לקחת מיד כדי להפחית את כל השינויים האפשריים הידבקות התא ומורפולוגיה בגלל השפלה מדגם.

מלבד איסוף תוצאות של תאים, ניתוחים בינוניים ודגימות לאחר התרבות חשובים מכיוון שהם יספקו נתונים בעלי ערך לניתוח מנגנון ההשפלה, המוצרים והשיעורים של חומרי השתל. לדוגמה, פולימרים מתכלים כגון PLGA עשויים ליצור תוצרי לוואי של השפלה חומצית כגון חומצות הידרוקסיל-קרבוקסיליות מונומריות או אוליגומריות במהלך תרבית ^התא32, אשר עשויים להשפיע על צמיחת התא והתפשטותו. לעומת זאת, מתכות מתכלות, כגון מגנזיום וסגסוגות שלה, לייצר יוני הידרוקסיד וגז מימן במהלך השפלה ^שלהם31, אשר יכול להגדיל באופן משמעותי את ה- pH המקומי, ואלקליניות חמורה עלולה להיות השפעות שליליות על תפקודי התא המקומי. קרמיקה מתכלה שונים עשויה גם להגדיל את ה- pH של ^{המדיום41}. באופן כללי, תאים דורשים טווח pH מסוים במדיום תרבית לתפקד כראוי, וזה ידוע כי ערכי pH מוגברת או ירדה בנוזלי הגוף מזיקים ^לחיים42. מדידת ה- pH של מדיום פוסט-תרבותי היא בעלת ערך להבנת כל נזק פוטנציאלי שחומרי מדגם מתכלים עלולים לגרום בתרבית התאים. לכן, יש צורך למדוד את ערך ה- pH של המדיום הפוסט-תרבותי כדי להבין את המנגנונים הפוטנציאליים של האופן שבו חומרים מתכלים אלה משפיעים על התאים.

חשוב למדוד את ריכוזי היונים החיוניים במדיום הפוסט-תרבותי לחומרים מתכלים. לדוגמה, Cortez Alcaraz et al. מדד את ריכוזי היונים ^Mg2+ ו- ^Ca2+ של המדיום שלאחר התרבות כאשר הם חקרו דגימות מגנזיום מצופות ננו-חלקיקים תחמוצת מגנזיום באמצעות תרבות ישירה עם BMSCs34. הריכוזים של יוני מגנזיום מצביעים על תכונות השפלה של דגימות שונות במבחנה במהלך תרבית התא, וריכוזים של יוני סידן יכולים לספק מידע על תצהיר סידן במהלך התפשטות התאים. שו ואח ' נמדדו ^{Fe3 +} ריכוזי יון של המדיום פוסט-תרבותי כאשר הם חקרו הידרוג'לים HyA באמצעות תרבות חשיפה ישירה עם BMSCs. הם השתמשו ביוני ^Fe3+ כדי להתאים את צפיפות הקישור הצולבת של ^HyA33. יונים ^Fe3+ עשויים להקטין את ערך ה- pH של מדיום התרבות, וריכוזים גבוהים של יונים ^Fe3+ עשויים להיות רעילים לתאים. לכן, חשוב למדוד את הריכוזים של יונים של עניין כדי לשפר את cytocompatibility של חומרים מתכלים ומוצרי השפלה הקשורים שלהם.

אנו עשויים לאסוף נתונים שונים כדי לנתח את האינטראקציות בין החומרים לתאים עבור חומרים שונים. לדוגמה, כפי שמוצג בטבלה משלימה 1, סגסוגות Mg להשפיל על ידי תגובה עם מים, ומוצרי השפלה עשויים לכלול ^Mg2+ ו- OH^- יונים, גז _H2 , וכמה מוצרים השפלה מסיסים אחרים כגון Mg(OH)₂. XRD, SEM ו- EDX, אשר יכול לשמש כדי לקבוע את התצהיר המינרלי שנוצר על החומר. אנו עשויים לחקור את ההשפעות של ריכוז של ^{Mg2 +} יונים וערכי pH במדיום על התנהגויות התא. יתר על כן, אנו עשויים להשתמש בתוצאות אלה כדי ללמוד את התפתחות הגז במהלך השפלת מתכת. אין ויטרו מחקרים דיווחו על רמת הסובלנות הקריטית של גז _H2 להיות <0.01 מ"ל / ^cm2 / יום, וזה כבר בשימוש נרחב כדי לסנן סגסוגות מגנזיום עבור יישומי שתל זמניים. בעיקרו של דבר, כמות האבולוציה של הגז תלויה בשיעור השפלה של סגסוגות מגנזיום. בדוגמה אחרת, PLGA מתפרק עקב הידרוליזה של הצמדות אסתר שלה בנוכחות מים. ניתן ללמוד את תוצרי ההשפלה של חומצה לקטית וחומצה גליקולית, כמו גם את ערכי ה- pH במדיום, כדי לנתח אינטראקציות בין תאים לחומרים. השיטות המתוארות במאמר זה כוללות את מדידת היונים שפורסמו ואת ערכי ה- pH במדיה של תרבית התאים ואת השינוי ההמוני של החומרים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את שיעור השפלה של החומרים.

חומרים שונים בדרך כלל מתנהגים באופן שונה במבחנה וב - vivo, ואת השיטות למחקרי תאימות יש לבחור בהתבסס על סביבת היישום וסוג החומר. עבור יישומים אורתופדיים, רצוי להעריך את האינטראקציות בין תאי העצם והשתלים הרלוונטיים כאשר הם נמצאים במגע ישיר זה עם זה. ניתן להשתמש בשיטת התרבות הישירה כדי לחקור את האינטראקציות בין התאים החדשים שנזרעו לבין השתל. ביישומים לב וכלי דם, כמו התאים שנקבעו יבואו במישרין או בעקיפין במגע עם חומרי סטנט מושתלים, תרבות חשיפה ישירה ושיטות תרבות חשיפה עשוי לשמש כדי להעריך את הציות של מתכות מתכלות עבור יישומי לב וכלי דם. אנו מאמינים כי שיטות הפריה חוץ גופית המתוארות במאמר זה אפשריות לספק ראיות ראשוניות לציות של חומרי שתל מתכלים. יש לשנות את שיטות התרבות עבור חומרים שונים עם מנגנוני השפלה מגוונים, מוצרים ותעריפים. לדוגמה, ניתן לשנות את זמן ההשפלה של חומרים שונים בהתבסס על שיעורי השפלה מגוונים מסוגי חומרים שונים. ניתן לאסוף תוצאות שונות בהתבסס על מנגנוני השפלה שונים ומוצרים של החומרים.

לסיכום, חשוב לנתח את התאים, החומרים הבינוניים והדגומים בצורה איכותית וכמותית, לפני ואחרי תרבית תאי הפריה חוץ גופית , כדי להבין את ההשפעות של חומרי שתל מתכלים ומוצרי השפלה שלהם על ציטו-תאימות. שלוש שיטות התרבות המוצגות במאמר זה יכולות לשמש לחקר מגוון רחב של חומרים מתכלים, כולל פולימרים מתכלים, קרמיקה ומתכות מתכלים ליישומי השתלה רפואית והנדסת רקמות. מחקרים אלה של תאי הפריה חוץ גופית הם בעלי ערך לסינון חומרים מתכלים, אופטימיזציה של העיצוב של מכשירים מושתלים ופיגומים בשלב מוקדם של פיתוח המוצר, והפחתת רעילות פוטנציאלית לתאים.

למחברים אין ניגודי עניינים.

המחברים מעריכים את התמיכה הכספית של הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (פרס NSF CBET 1512764 ו- NSF PIRE 1545852), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH NIDCR 1R03DE028631), מלגת הפיתוח של הפקולטה לפקולטה לריג'נטים באוניברסיטת קליפורניה (UC) והוועדה למענק זרעי מחקר (Huinan Liu), ומענק מחקר עבודת הדוקטורט של UC-ריברסייד (Jiajia Lin). המחברים מעריכים את המתקן המרכזי למיקרוסקופיה מתקדמת ומיקרואנליזה (CFAMM) באוניברסיטת קליפורניה ריברסייד לשימוש ב- SEM / EDS וד"ר פרי צ'ונג לשימוש במכשירי XRD. המחברים מעריכים גם את תאן וי נגוין וקוויני שו על עריכה חלקית. המחברים גם רוצים להודות לסינדי לי על הקלטת הקריינות לסרטון. כל הדעות, הממצאים והמסקנות, או ההמלצות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את השקפותיהם של הקרן הלאומית למדע או המכונים הלאומיים לבריאות.