Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג את השימוש ב-PSYCHE וב-SAPPHIRE-PSYCHE באפיון מטבולי של צמחים וכולל נהלים מפורטים להכנת דגימות והקלטה אופטימלית של ספקטרום NMR Pure Shift. דוגמאות שבאמצעותן נדון הרווח ברזולוציה שהושג על ידי ניתוק הומו-גרעיני המאפשר הבנה מקיפה יותר של המערכת.

Abstract

תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא אחד הכלים החזקים ביותר המשמשים במטבולומיקה. היא עומדת כשיטה מדויקת ביותר וניתנת לשחזור שלא רק מספקת נתונים כמותיים, אלא גם מאפשרת זיהוי מבני של המטבוליטים הקיימים בתערובות מורכבות.

פרופיל מטבולי על ידי 1H NMR הוכח שימושי במחקר של סוגים שונים של תרחישי צמחים, הכוללים הערכה של תנאי היבול, קציר וטיפולים לאחר הקציר, פנוטיפ מטבולי, מסלולים מטבוליים, בקרת גנים, זיהוי סמנים ביולוגיים, כימוטקסונומיה, בקרת איכות, המלים של המקור, בין היתר. עם זאת, חפיפת אותות של מספר גדול של תהודה עם מכפלות צימוד J מורחבות מסבכת את ניתוח הספקטרום ואת פרשנותו, ומייצגת מגבלה עבור פרופיל NMR קלאסי של 1H.

בעשור האחרון פותחו טכניקות חדשניות לניתוק-צימוד הומו-גרעיני בפס רחב של NMR, שבאמצעותן אותות מרובים קורסים לקווי תהודה בודדים - הנקראות בדרך כלל שיטות Pure Shift - כדי להתגבר על בעיית רזולוציית הספקטרום הטבועה בספקטרום הקלאסי של 1H NMR.

כאן מוצג פרוטוקול שלב אחר שלב של הכנת תמצית הצמח וההליך לרישום אופטימלי של ספקטרום Pure Shift PSYCHE ו- SAPPHIRE-PSYCHE בשלוש מטריצות צמחים שונות - עלי צמח וניל , פקעות תפוחי אדמה (S. tuberosum) ודומדמניות כף (P. peruviana). נדונה השפעת העלייה ברזולוציה בזיהוי מטבולי, ניתוח מתאמים וניתוחים רב-משתניים, בהשוואה לספקטרום הקלאסי.

Introduction

מערך שלם של מטבוליטים המרכיבים אורגניזם - מצעים, מתווכים ותוצרים סופיים של תהליכים ביולוגיים - נטבע בשנת 1998 עם המונח מטבוליזם. ידוע היטב כי חילוף החומרים קשור קשר הדוק לפנוטיפ, והוא מעניין במיוחד בצמחים מכיוון שהוא משקף את האינטראקציה הישירה בין הגנוטיפ לסביבה 1,2. לפיכך, אפיון הפרופיל המטבולי הפך להיות בעל חשיבות עליונה בצמחים. באמצעות זיהוי וכימות של סמנים ביולוגיים (מטבוליטים מרכזיים) ודפוסים מטבוליים, ההבחנה בין מינים, זנים, שלבי התפתחות, מחלות פתוגניות, או תנאים סביבתיים (שינויים יומיים ועונתיים, קרקעות, לחץ מים, לחץ מכני, קציר וטיפולים לאחר הקציר), בין היתר, התאפשרה 3,4,5.

ספקטרומטריית מסות (MS) וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) הן הפלטפורמות האנליטיות הנפוצות ביותר למטרה זו. בניגוד למתודולוגיות הטרשת הנפוצה, NMR עומדת כטכניקה מאוד ניתנת לשחזור, לא מוטה, כמותית, מדויקת ולא הרסנית הדורשת הכנת דגימה מינימלית, מה שהופך אותה מתאימה למחקרים מטבולומיים. עם זאת, בהשוואה לשיטות טרשת נפוצה, הרגישות הנמוכה המובנית היא מגבלה. בשנים האחרונות ובאמצעות שימוש במגנטים בעלי שדה גבוה, גשושיות קריוגניות, התקני מיקרו-סליל ושיטות קיטוב גרעיני דינמי (DNP), הרגישות של NMR השתפרה מאוד. במקרה של הגישה השנייה, למשל, העלייה ברגישות הייתה ברמה של שניים עד שלושה סדרי גודל 6,7. נכון להיום, כמעט 20% ממחקרי המטבולומיקה שפורסמו מבוססים על NMR והמספר עולה7.

למרות שפרוטון NMR הוא הניסוי הפופולרי והרגיש ביותר לטביעת אצבע מטבולומית של NMR, יש לו כמה חסרונות. ראשית, כל אותות ה-NMR של 1H שזוהו בדגימה מפוזרים בחלון קטן המתאים לחלון ההסטה הכימי של הפרוטון, מה שגורם לספקטרום צפוף. שנית, הצימוד הסקלרי ההומו-גרעיני מפצל את האותות למספר רכיבים (ריבוי אותות), מפזר את אות הפרוטון על פני טווח תדרים רחב יותר, ומסבך עוד יותר את קריאת הספקטרום על ידי הגדלת הצפיפות וחפיפת האותות. בנוסף, מטבולומיקה של NMR משמשת בניתוח תערובות המכילות בדרך כלל 50 עד 300 מולקולות בריכוז נצפה של NMR, ומייצרות ספקטרום מורכב המורכב מ-200 עד 2000 פסגות.

Homonuclear decoupling proton NMR, הידוע גם בשם Pure Shift, היא שיטה הגורמת לקריסה של אות מרובה לשיא יחיד. הוא מהווה כלי מצוין להגדלת רזולוציית האות בספקטרום צפוף 8,9,10 ולכן מהווה כלי נוח לצמחים מטבוליים11.

בעשור האחרון הופיעו רצפי פולסים חדשים של Pure Shift, המגבירים הן את הרגישות והן את ביצועי הניתוק. מגוון היישומים שלהם התרחב גם הוא, מהבהרת מבנה מולקולרי12,13, לפלוקסומיקה14, הקצאת תערובת 15,16,17, מדידות דיפוזיה תרגומית 18, אפליה אננטיומרית19, התפלגות יחידות בקו-פולימרים20, בין היתר.

מבחינה היסטורית, ניסויי Pure Shift בפס רחב סובלים מרגישות נמוכה ומשיטות עיבוד מסובכות, המגבילות את היקפם בהערכת תמציות ביולוגיות8. בשנת 2014, Foroozandeh et al. פרסמו ניסוי חדש של Pure Shift, PSYCHE (Pure Shift Yielded by Chirp Excitation), המבוסס על רצף פולסים אנטי-z-COSY שהניב ניתוק הומו-גרעיני מצוין וערכי רגישות משופרים21. עם זאת, מכיוון ש-PSYCHE הוא ניסוי אינטרפרוגרמה דו-ממדי שבו נרכשים נתחים של נתוני תחום הזמן, הוא סובל מארטיפקטים תקופתיים של פס צד הנובעים מעיוותי אפנון צימוד J בקצוות הגוש. בתערובות מורכבות, ממצאים אלה מניבים אותות גדולים יותר מאלה הקשורים למטבוליטים הנמצאים בריכוזים נמוכים מאוד, מה שמעכב את הניתוח11. ישנן שתי שיטות להסיר ממצאים אלה - TSE-PHYCHE22 ושינוי עדכני יותר של ניסוי PSYCHE שנקרא SAPPHIRE-PSYCHE (Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution)23.

בשנת 2019 הדגמנו לראשונה11 כי שיטת SAPPHIRE-PSYCHE Pure Shift, המסירה ממצאים כמעט ללא עונש רגישות23, יכולה לשמש לניתוח תערובות ביולוגיות מורכבות, כגון תמציות של פירות Physalis peruviana, הידוע בכינויו Cape gooseberries11. הראינו כי שיטות אלה מגבירות את הביצועים של ניתוחי נתונים מטאבולומיים כגון הקצאה מטבולית, ניתוח מתאם וניתוח מקדמים רב-משתנים11. מאז, מספר מחקרים מטבולומיים של Pure Shift על מטריצות ביולוגיות שונות, כגון אלמוגים רכים24, צמחי היפריקום25, דבש26,27, תה27, שמן נענע חריפה26 ואגוזי מלך28 טופלו, מה שמדגים את חשיבותו ככלי חדש לניתוח מטבולומיקס. באופן פרדוקסלי, רובם המכריע של מחקרים אלה השתמשו ברצף הדופק הנפשי הסטנדרטי והקל ליישום, הזמין מכל ספריית ספקטרומטר, במקום ברצף הדופק SAPPHIRE-PSYCHE, שהוכח כבעל ביצועים טובים יותר. עם זאת, זה דורש הבנה טובה יותר של רצף הדופק עבור הגדרה נכונה.

מאמר זה נועד לסייע למשתמשים חדשים ליישם שיטות Pure Shift בחקר צמחים, בפרט, עלים של Vanilla sp (V. planifolia and V. pompona)29, פקעות תפוחי אדמה (S. tuberosum)30, ודומדמניות כף (P. peruviana)31. הכנת דגימות, הגדרת ניסוי NMR, רכישת נתונים וניתוח נתונים מתוארים בפירוט. יתר על כן, הפרוטוקול כולל הערות מפתח כדי לסייע לחוקרים, חדשים בתחום, להקים כראוי ניסויים PSYCHE ו- SAPPHIRE-PSYCHE בפרופיל מטבולי של צמחים.

Protocol

1. הכנת מדגם

  1. דומדמניות כף
    1. מניחים 100-200 גרם של פירות טריים באגרטל בלנדר. שמור על 4 ° C במשך 30 דקות, ולאחר מכן הומוגניזציה בבלנדר מעבדה.
    2. מיד, להעביר את המיץ 50 מ"ל צינורות פלסטיק, להקפיא אותם בחנקן נוזלי lyophilize ליובש במשך 4 עד 5 ימים.
    3. טוחנים את החומר הליופילי לאבקה דקה באמצעות מטחנה חשמלית.
      הערה: הטיפול בחומר היבש צריך להיעשות במהירות מכיוון שהאבקה היגרוסקופית מאוד.
    4. שוקלים 1 גרם מחומר הקרקע ומוסיפים 10 מ"ל מים טהורים במיוחד. מערבולת במשך דקה אחת.
    5. סוניק במשך 20 דקות ב-10°C, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-23,000 × גרם למשך 20 דקות ב-10°C.
    6. לשחזר את supernatant ולסנן אותו דרך מסנן מזרק 13 מ"מ polytetrafluoroethylene (PTFE) 0.45 מיקרומטר.
    7. Lyophilize 1 מ"ל של תמצית מסוננת ליובש ולאחר מכן להשעות מחדש את מוצק המתקבל ב 0.9 מ"ל של 200 mM נתרן אוקסלט חיץ pH 4. מערבולת.
    8. Lyophilize את הדגימה המתקבלת ליובש ולהמיס אותו 0.9 מ"ל של תחמוצת דאוטריום המכיל 5 mM של 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 מלח נתרן חומצה (TMSP-d4).
    9. מלא את צינור NMR עם 0.6 מ"ל של הדגימה באמצעות micropipette.
  2. עלי וניל
    1. אספו את העלים, נקו אותם בנייר טישו לח והקפיאו אותם שלמים בחנקן נוזלי.
    2. שוברים את העלים לחתיכות קטנות ועושים ליופיליזציה במשך 4 ימים עד ליובש.
    3. טוחנים את החומר היבש לאבקה דקה באמצעות מטחנה חשמלית.
    4. שוקלים 50 מ"ג חומר טחון ומוסיפים 0.75 מ"ל חיץ פוספט pH 6.0 בתחמוצת דאוטריום המכילה 0.1% TMSP (w/w) ו-0.75 מ"ל מתנול-d4. מערבולת במשך דקה אחת.
    5. סוניק למשך 20 דקות ב-25°C.
    6. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 10 דקות ב 25 ° C.
    7. לשחזר את supernatant (~ 1.3-1.4 מ"ל) ולסנן אותו דרך מסנן מזרק 13 מ"מ PTFE 0.45 מיקרומטר.
    8. מלא את צינור NMR עם 0.6 מ"ל של הדגימה המסוננת באמצעות micropipette.
  3. פקעות תפוחי אדמה
    1. מקלפים ופורסים 4 עד 8 פקעות. יש לשים מיד כ-125 גרם חומר בשקיות עמידה ולהקפיא אותן בחנקן נוזלי.
      הערה: כדי למנוע חמצון במהלך הטיפול יש לשמור על תפוח האדמה לח.
    2. ליופיליזציה במשך 4 עד 6 ימים עד ליובש מוחלט.
    3. טוחנים את החומר היבש לאבקה דקה באמצעות מטחנה חשמלית.
    4. שוקלים 160 מ"ג של פקעת הקרקע ומוסיפים 1.6 מ"ל של מים deionized. מערבולת במשך דקה אחת.
    5. סוניק למשך 45 דקות ב-10°C.
    6. צנטריפוגה ב-23,000 x גרם למשך 20 דקות ב-10°C.
    7. לשחזר את supernatant (~ 1.5 -1.6 מ"ל) ולאדות אותו ליובש ברכז ואקום צנטריפוגלי קירור במשך 16 שעות, ב 10 ° C.
    8. מוסיפים למוצק המתקבל (20-25 מ"ג) 0.9 מ"ל של 100 mM נתרן אוקסלט חוצץ pH 4, מערבולת, ומתאדים במשך 16 שעות ב 10 ° C.
    9. להמיס את המוצק המתקבל 0.9 מ"ל של תחמוצת דאוטריום המכיל 3 mM של TMSP.
    10. צנטריפוגה ב-23,000 x גרם למשך 5 דקות ב-10°C ולסנן את הסופרנאטנט ישירות לתוך צינור ה-NMR דרך מסנן מזרק PTFE 0.45 מיקרומטר בקוטר 13 מ"מ.
      הערה: במקרה זה, סינון ישיר לתוך צינור NMR בוצע כדי להפחית את השלבים בהכנת יותר מ -1000 דגימות.

2. איסוף ועיבוד נתוני NMR

  1. התקנה ראשונית של תמ"ג
    1. העבירו את הדגימות לספקטרומטר NMR.
    2. כוונן והתאם את ראש הבדיקה.
    3. לנעול ולשפוך את המדגם.
    4. כיול הפולס הקשיח של 90°. כייל את הפולס של 90° באמצעות כל אחד מההליכים הסטנדרטיים.
    5. הפעל ספקטרום NMR סטנדרטי של פרוטון 1D.
  2. ניסוי פסיכי
    1. בחר את רצף הפולסים reset_psyche_1d מספריית Bruker Topspin (איור S1). השתמש בפרמטרים הסטנדרטיים הבאים: רוחב ספקטרלי של 5 kHz (SW2), לפחות שנייה או שתיים של עיכוב התאוששות הרפיה (D1), 16 סריקות דמה (DS), 64 או 128 נקודות נתונים מורכבות לכל בלוק (L31), ו- 64 או 128 סריקות (NS) (איור S1).
      הערה: L31 הוא מספר הנקודות הדיגיטליות המורכבות שנרכשו בכל בלוק Pure Shift, שעדיף להגדיר בחזקה של 2. 21
    2. הגדר את עירור זווית היפוך פולס CHIRP הרצוי (CNST61) ו- 10 קילו-הרץ עבור רוחב הפס של פולס CHIRP (CNST60) (איור S2).
      הערה: ניסוי הנפש מבוסס על סכמה אנטי-z-COSY ; כתוצאה מכך, זווית היפוך הדופק של CHIRP צריכה להיות קטנה כדי להימנע משחזור ממצאים (איור 1). העוצמה האבסולוטית עולה עם זווית ההתהפכות של העירור. הממצאים המחזוריים גם משופרים, מתפשטים לתוך הספקטרום ומגבירים את ה"רעש" (איור 1). ה"רעש" הופך לשילוב של רעש סטנדרטי וקיבוץ חפצים. פשרה טובה בין רגישות לבין תוצרי צימוד נמוכים היא להגדיר CNST61 = 20°. 19,22
    3. הגדר את אורך הפולס הקשיח (P1) לערך שכויל קודם לכן ואת אורך הפולס בצורת PSYCHE ל- 30 אלפיות השנייה (P49) (איור S2).
      הערה: חשוב מאוד לכייל את ערך הדופק הקשיח מכיוון שעוצמת הדופק הצורני תחושב באופן אוטומטי מערך זה.
    4. בחר את פעימת הצורה Crp_psyche.20 (SPNAM 37) עבור רכיב PSYCHE (איור S2).
    5. הגדר את עוצמת שיפוע שדה הדופק המופעל במהלך אלמנט PSYCHE (GPZ0). בחר RECT.1 לפעימת צורת מעבר הצבע (GPNAM 0) (איור S2).
      הערה: שיפוע שדה מגנטי חלש מוחל במהלך אלמנט הנפש, בדרך כלל, בין 1% ל -4% מהחוזק המרבי של השיפוע, בהתאם לבדיקה.
    6. הגדר את מספר הבלוקים שיש לרכוש כדי לשחזר את Pure Shift FID (TD1) (איור S3).
      הערה: PSYCHE נרכש כניסוי פסאודו-דו-ממדי כאשר TD1 הוא מספר בלוקי האינטרפרוגרמה של Pure Shift. רזולוציית הספקטרום תלויה בגודל החלון הספקטרלי (SW1) ובמספר הכולל של נקודות שנרכשו, שהוא TD1*2*L31. בדרך כלל, 16 או 32 בלוקים עם 64 או 128 נקודות מורכבות לכל בלוק יספקו מספיק רזולוציה דיגיטלית. כאשר PSYCHE נרשם באופן אינטרפרוגרמה, מספר גבוה יותר של בלוקים מגדיל את הרזולוציה הדיגיטלית, אבל, גם את זמן הרכישה הכולל19. צימודי J הומו-גרעיניים מתפתחים במהלך כל בלוק וכתוצאה מכך נוצרת תבנית אפנון J מתנודדת21,23. לאחר התמרת פורייה, זה יוצר תוצרי פס צד מחזוריים שתלויים באורך הבלוק (איור 2). כדי להפחית חפצים, משך הבלוק חייב להיות קצר, בדרך כלל פחות מ- 16 אלפיות השנייה (משך בלוק = 2*in0: איור S1). אם משך החסימה גבוה, הפחיתו את L31.
    7. עבד את הנתונים עם תוכנית Proc_reset AU של Bruker והתמרת פורייה.
      הערה: אנו ממליצים לשנות את הספקטרום באמצעות מילוי אפס ואפודיזציית פעמון סינוס (איור S4).
  3. ניסוי ספיר-פסיכה
    1. בחר את רצף הדופק SAPPHIRE-PSYCHE והגדר את פרמטרי רצף הדופק. הפרמטרים הסטנדרטיים יהיו הבאים: רוחב ספקטרלי של 5 קילו-הרץ (SW3), לפחות שנייה או שתיים של עיכוב הרפיה (D1), 16 סריקות דמה (DS), 8 או 16 סריקות לכל הפרש קבוע (NS) ו-D2 עד 14 אלפיות השנייה (איור S5).
      הערה: רצף זה אינו נמצא ברפרטואר של Bruker, עם זאת, ניתן לקבל את הרצף ואת תוכניות העיבוד מאתר האינטרנט של Manchester NMR Methodology Group, (https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426)23. השהיית D2 מבטיחה שההרפיה של T2 תישאר קבועה עם כל תוספת אפנון J. D2 צריך להיות גדול מ- 1/4*SW1+p16+2*d16. 23
    2. הגדר את עירור זווית היפוך פולס CHIRP הרצוי (CNST20) ו- 10 kHz עבור רוחב הפס של פולס CHIRP (CNST21) (איור S6).
      הערה: כמו בניסוי פסיכה רגיל, זווית היפוך הדופק של CHIRP צריכה להיות קצרה כדי למנוע שחזור ממצאים. CNST20 = 20° היא פשרה טובה בין רגישות לבין תוצרי צימוד נמוכים 21,23,25.
    3. הגדר את אורך הדופק הקשיח (P1) לערך שכויל קודם לכן ואת אורך הפולס בצורת PSYCHE ל- 30 אלפיות השנייה (P40) (איור S6).
      הערה: חשוב לכייל את ערך הדופק הקשיח מכיוון שעוצמת הדופק הצורני תחושב ממנו באופן אוטומטי.
    4. בחרו פולס צורה PSYCHE_Saltire_10kHz_30m עבור אלמנט PSYCHE (איור S6).
    5. הגדר את עוצמת שיפוע שדה הדופק המופעל במהלך אלמנט PSYCHE (GPZ10). בחר RECT.1 לפעימת צורת מעבר הצבע (GPNAM 10) (איור S7).
      הערה: שיפוע שדה מגנטי חלש מוחל במהלך אלמנט הנפש, בדרך כלל, בין 1% ל -4% מהחוזק המרבי של השיפוע, ערך התלוי בבדיקה.
    6. הגדר את מספר הפרשים הקבועים של אפנון SAPPHIRE J ב- F2 (TD2) (איור S7).
      הערה: בדרך כלל 8 דרגות מבטיחות דיכוי מצוין של תוצרי הרצועה הצידית (איור 2 ו-3). המספר הכולל של סריקות Pure Shift FID הסופי הוא NS*TD2. 23
    7. הגדר את החלונות הספקטרליים F1 ו- F2 (SW1 ו- SW2) (איור S5).
      הערה: SW2=SW3/(2*TD2) ו-SW3/SW1 = TD2*N, היו TD2 ו-N הם מספרים שלמים זוגיים23. ניסוי SAPPHIRE-PSYCHE נרכש כפסאודו תלת-ממדי שבו F2 מקודד את אפנון שלב החפץ צימוד J ואת F1 את רכישת אינטרפרוגרמה Pure Shift20. מאחר ש-SAPPHIRE-PSYCHE מסיר רצועות צד של אפנון J , משך בלוק האינטרפרוגרמה Pure Shift יכול להיות ארוך יותר מ-PSYCHE רגיל (Pure Shift block duration = 1/SW1), בדרך כלל בין 20 ל-40ms (איור 2). עם זאת, רכישת נתונים בנתחים ארוכים יותר מובילה לאבולוציות גבוהות יותר של צימוד J, אשר ידרשו יותר תוספות אפנון שלב של צימוד J כדי להסיר את רצועות הצד החזקות יותר שהושגו23.
    8. הגדר את מספר בלוקי Pure Shift (TD1) (איור S7).
      הערה: מכיוון שספיר-פסיכה צריכה לפצות על אפנון שלב צימוד J של הבלוק הראשון, יש לרכוש בלוק נוסף. בדרך כלל, 17 (16+1) או 33 (32+1) בלוקים נותנים מספיק רזולוציה דיגיטלית23.
    9. עבד את הנתונים המבצעים את תוכניות pm_pshift ו- pm_fidadd AU ולאחר מכן התמרת פורייה23.
      הערה: אנו ממליצים לשנות את הספקטרום באמצעות מילוי אפס ואפודיזציית פעמון סינוס (איור S4).

תוצאות

ניתוח ספקטרום NMR
ניסויי פסיכה מגדילים את רזולוציית הספקטרום על ידי כיווץ תהודה מצומדת לסינגלטים21, שבתורה מפחיתה חפיפה ומקלה על הקצאה וניתוח נתונים. ניתן ליישם NMR Pure Shift על תמציות צמחים. כאן אנו מדגימים את השימוש בו בשלוש מטריצות שונות: עלי וניל, פקעות תפוחי אדמה ופירות Physalis peruviana . שיפור הרזולוציה שהושג בספקטרום של תמציות צמחים אלה ברור מאיורים S8-S11.

על מנת להעריך את ההשפעה של רצפי פולסים אלה ברזולוציה של אות NMR, רוחב הקו ביחידות תדר ב -10% מהגובה המרבי, W10, חושב עבור מספר סוגים של תהודה, כולם מודגמים בספקטרום המתקבל עם תמציות וניל sp - Pure Shift לעומת 1 HNMR קלאסי - איור 4. בסך הכל, ההתרחבות של תהודה מצומדת הגיעה לערכי W10 מ-1 עד 60 הרץ, בעוד שפסגות סינגלט נעו בין 1 ל-10 הרץ: קבוצת המתיל של חומצה אצטית (1.97 ppm באיור 4) השיגה ערך W10 של 2.0 הרץ ב-H-NMR קלאסי ו-2.1 הרץ בספקטרום ספיר-פסיכה (S). התהודה האנומרית של סוכרוז (ב-5.40 חל"מ), כפיל עם צימוד J של 3.9 הרץ, משתרעת על פני אזור שווה ערך ל-W10 של 6.5 הרץ, כאשר כל שיא בודד מהווה 2.6 הרץ של W10 (איור 4). ערך זה היה גבוה מזה של הפסגה שקרסה שהתקבלה בספקטרום ספיר-פסיכה, W10 = 1.9 הרץ (איור 4). במקרה של חומצה מאלית Hβ' (ב- 2.55 ppm), הכפלה של כפילים עם J=7.8 הרץ, 15.6 הרץ, משתרעת על פני 29.4 הרץ (איור 4), עם ערכי W10 מחושבים עבור כל שיא בודד בין 4.7 ל- 4.9 הרץ. אות מרובה זה קרס על-ידי Pure Shift לקו יחיד (במהירות של 2.55 עמודים לדקה), והתרחב על פני ערך W10 של 4.7 הרץ (איור 4).

ריבוי האותות נעשה מורכב יותר במימנים מצומדים מאוד, שבהם הפסגות המכוננות של המכפלה כבר אינן ניתנות להבחנה בקלות, ויוצרות אות כמעט רציף. זה המקרה עבור מימן חומצה הומוציטרית, Hγ (ב-2.24 ppm), Hδ (ב-2.02 ppm) ו-Hδ' (ב-1.91 ppm), איור 4. ה-Hγ, Hδ וה-Hδ'multiplets עם W10=38.3 Hz, W10=41.5 Hz ו-W10=34.8 Hz, בהתאמה, קרסו לסינגלים של W10=7.8 Hz (Hγ, 2.24 ppm), W10=8.0 Hz (Hδ, 2.02 ppm) ו-W10=6.2 Hz (Hδ', 1.91 ppm), איור 4. רזולוציה משופרת זו אפשרה הבחנה טובה יותר של אותות חופפים אחרים המתאימים לחומצה מאלית (Hβ, 2.77 ppm Hβ', 2.55 ppm), חומצה הומוציטרית (Hα, 2.80 ppm ו-Hα', 2.63 ppm) ולקטון חומצה הומוציטרית (Hα', 2.84 ppm ו-Hδ, 2.65 ppm) (איור 4).

השיפור ברזולוציה בספקטרום המופרד ההומו-גרעיני SAPPHIRE-PSYCHE המאפשר הבחנה טובה יותר בין אותות מודגם גם בשני אזורים חשופים מאוד, 4.85 - 5.08 ppm ו- 7.05 - 7.31 ppm, שבהם ניתן לזהות מטבוליטים חשובים המעורבים במסלול חילוף החומרים של ניחוח וניל: גלוקוזיד A (ראה מבנה באיור 5), CH-2',6' (ב- 7.28 ppm), CH-2", 6" (ב- 7.18 עמודים לדקה), CH-3',5' (ב- 7.09 עמודים לדקה), CH-3",5" (ב- 7.07 עמודים לדקה), CH2-7' (ב- 4.97 עמודים לדקה ו- 5.05 עמודים לדקה), CH2-7'' (ב- 4.89 עמודים לדקה), CH-Glc (ב- 4.96 חל"מ) ו- CH'-Glc (ב- 4.93 חל"מ), גלוקוזיד B (ראה מבנה באיור 4), CH-2',6' (ב- 7.29 חל"מ), CH-2",6" (ב- 7.23 חל"מ), CH-3', 5' (ב-7.09 חל"מ), CH-3",5" (ב-7.07 חל"מ), CH2-7' (ב-4.99 חל"מ), CH2-7 אינץ' (ב-4.91 חל"מ), אלכוהול הידרוקסיבנזיל (7.23 חל"מ) והידרוקסיבנזיל אלכוהול גלוקוזיד (7.10 ו-4.51 חל"מ), איור 4.

אותן תוצאות נצפו בתמציות דומדמניות כף ובניתוח פקעות תפוחי אדמה. בשני המקרים האלה, כמה אזורים צפופים עלH-NMR רגיל, פסיכה וספיר-פסיכה הורחבו לצורך השוואה (איורים 6 ו-7).

ברור כי ניסויי PSYCHE ו-SAPPHIRE-PSYCHE שיפרו בבירור את רזולוציית האות של תמציות דומדמניות כף עבור סוכרוז (4.04 ppm), β-פרוקטוז (4.02 ppm ו-3.99 ppm), β-glucose (3.24 ppm), פרולין (2.34 ppm, 2.07 ppm ו-2.00 ppm), חומצה גלוטמית (2.16 ppm) וגלוטמין (2.13 ppm) (איור 6), כפי שהראינו בעבודה קודמת11, כמו גם במקרה של S. tuberosum תמציות: GABA (1.91 חל"מ, 2.33 חל"מ ו-3.02 חל"מ), חומצה פירוגלוטמית (2.04 חל"מ, 2.41 חל"מ ו-2.51 חל"מ), פרולין (2.00 חל"מ, 2.07 חל"מ, 3.33 חל"מ ו-3.42 חל"מ), גלוטמין (2.14 חל"מ ו-2.46 חל"מ), ואלין (2.27 חל"מ), חומצה ציטרית (2.64 חל"מ ו-2.76 חל"מ) ו-β-גלוקוז (3.25 חל"מ ו-3.47 חל"מ), איור 7.

רצף PSYCHE קל יחסית לשימוש והוא יושם בהצלחה במגוון רחב של יישומים9. כדי להשיג את הספקטרום המנותק, רצף הפולסים רוכש נתחים קטנים של FID הממקד מחדש את צימוד J באמצע כל בלוק. עם זאת, אבולוציה קטנה של צימוד J מתרחשת במהלך כל בלוק ויוצרת את הפסים הצדדיים המחזוריים המייצגים בדרך כלל פחות מ-5% משיא האב שלהם21. נוכחותם של ממצאי אפנון J אלה, הטבועים בניסויי פסיכה21, ניכרת באיור 6 אזורים מורחבים. בניתוח של תרכובות טהורות ממצאים אלה ניתן להזניח. בדגימות ביולוגיות, ייתכן שזה לא יהיה המקרה, מאחר שכפי שמוצג באיור 6 עבור פרולין (4.13 חל"מ, 3.41 חל"מ ו-3.33 חל"מ), אספרגין (3.97 חל"מ), מיו-אינוסיטול (3.27 חל"מ), GABA (3.03 חל"מ) וחומצה מאלית (2.67 חל"מ), ובאיור 6 עבור חומצה פירוגלוטמית (2.04 חל"מ, 2.41 חל"מ ו-2.51 חל"מ) וואלין (2.27 חל"מ), מטבוליטים בריכוזים גבוהים יותר מייצרים ממצאים גדולים כמו חלק מהאותות השייכים לתרכובות הקיימות בריכוזים נמוכים, ופוגעים בדרך זו בדיוק הפרופיל המטבולי.

ניסוי SAPPHIRE-PSYCHE הוא שינוי של רצף הנפש הרגיל שבו חפצים מחזוריים אלה מוסרים על ידי אפנון פאזה שיטתי, המושג על ידי הסטת נקודת המיקוד מחדש J23. כתוצאה מכך, ניסוי SAPPHIRE-PSYCHE מאפשר להבטיח ספקטרום Pure Shift נקי הרבה יותר, כפי שמוצג באיור 6 עבור פרולין (4.13 ppm, 3.41 ppm ו-3.33 ppm), אספרגין (3.97 ppm), מיו-אינוסיטול (3.27 ppm), GABA (3.03 ppm) וחומצה מאלית (2.67 ppm), במקרה של Cape gooseberries11, ובאיור 7 עבור חומצה פירוגלוטמית (2.04 ppm, 2.41 חל"מ, ו-2.51 חל"מ) וואלין (2.27 חל"מ), במקרה של תפוחי אדמה.

חפץ נוסף שממנו סובלים כל ניסויי Pure Shift הם אלה שנוצרו על ידי אפקט הצימוד החזק. כמה מטבוליטים ראשוניים חשובים כמו חומצת לימון (2.64 ppm ו-2.76 ppm) וגלוטמין (2.14 ppm ו-2.46 ppm), מציגים תוצרי צימוד חזקים, כפי שמוצג בתמצית פקעת תפוחי אדמה (איור 7). עד כה, אין רצף דופק שיכול בנוחות לחסל את הבעיה; עם זאת, SAPPHIRE-PSYCHE מתפקד טוב יותר מאשר PSYCHEרגיל 8,9,23.

ניתוח מטריצת מתאם
אחד היתרונות העיקריים של ספקטרוסקופיית NMR הוא שהריכוזים היחסיים של מטבוליטים בתערובת עומדים ביחס ישר לעוצמות האותות שלהם. לאחר מכן, ניתן לקבל מטריצת מתאם זוגות מטבוליטים ישירות ממטריצת מתאם ספקטרום32.

מטריצת מתאם H-NMR 1, הידועה בכינויה STOCSY32 (ספקטרוסקופיית מתאם סטטיסטית כוללת), מיוצגת בדרך כלל כספקטרום פסאודו-דו-ממדי, כאשר כל שיא צולב הוא מקדם מתאם בין שני אותות (איור 8)11. STOCSY מראה מתאם גבוה בין אותות השייכים לאותה מולקולה, אך גם עם אותות ממולקולות הקשורות לאותו מסלול מטבולי11,32. לפיכך, דפוסי מתאמים מספקים מידע על המצב הפיזיולוגי של המערכת, ולכן ניתן להשתמש בהם כטביעת אצבע בשלב פיזיולוגי33.

המגבלה העיקרית של STOCSY היא חפיפת אותות, אשר מקטינה את מתאם הזוגות11,32. יתר על כן, מתאמי ריבוי צימוד J, מובילים לדפוסים מורכבים מאוד, מה שמסבך עוד יותר את הניתוח11,32. השימוש ב-SAPPHIRE-PSYCHE STOCSY, המוצג באיור 8, משפר את ערכי המתאם מאחר שהוא מפחית את מתאמי הריבוי של צימוד J לשיא יחיד, ובכך מפחית את11 החופפים.

מספר אזורים הורחבו באיור 8. חומצה מאלית מראה תבניות מרובות J מורכבות הקשורות ל-Hα (4.41 ppm), Hβ (2.82 ppm) ו-Hβ′ (2.67 ppm); ב-Pure Shift STOCSY האותות האלה קורסים לפסגות מתאם בודדות (איור 9A)11. אותן תוצאות נצפו עבור β מתאמים בין-מולקולריים ותוך-מולקולריים (α-גלוקוז, α-פרוקטוז ו-β-פרוקטוז) מתוארים טוב יותר על-ידי SAPPHIRE-PSYCHE (איור 9B)11. חומצות אמינו מסוימות גם מציגות מתאם תוך-מולקולרי חזק בתמציות דומדמניות הכף. עם זאת, זיהויים ב- 1H-NMR STOCSY רגיל נפגע על ידי החפיפה באזורים צפופים. עם Pure Shift STOCSY, מתאמים בין-מולקולריים ותוך-מולקולריים של פרולין, אלנין, גלוטמין וחומצה גלוטמית מתוארים טוב יותר (איורים 9C ו-9D)11.

ניתוח רב משתני
ניתוח רב-משתני הוא אחד הכלים העיקריים המשמשים לטיפול בנתונים מטאבולומיים34,35. בעוד שאפליה מדגמית על ידי PCA (ניתוח רכיבים עיקריים) או PLS-DA (ניתוח חלקי לפחות ריבועים-מפלים) יכולה להיות מושגת בקלות באמצעות ספקטרום H-NMR רגיל של 1, הפרשנות של העומס מטופלת טוב יותר באמצעות נתוני הזזה טהורה 11,24,25,27,28.

באיור 10 אנו מראים את תרשים הניקוד PLS-DA שהתקבל באמצעות SAPPHIRE-PSYCHE (איור 10A) וספקטרום פרוטונים רגיל (איור 10B) בהבחנה של שישה אקוטיפים של תמציות P. peruviana 11. למרות שישנם כמה מחקרים הטוענים לביצועי אפליה טובים יותר בעת שימוש בנתוני Pure Shift24,25, התוצאות שלנו מראות כי הביצועים בקושי הושפעו מהניתוק ההומו-גרעיני11. במקרה של ניתוח נתוני העומסים, כפי שמוצג באיורים 10C ו-10D, הרזולוציה המוגברת שהושגה עם נתוני SAPPHIRE-PSYCHE פישטה את הניתוח ואפשרה זיהוי טוב יותר של המטבוליטים הספציפיים האחראים לאפליה של P. peruviana כלומר, α-גלוקוז, β-גלוקוז, α-פרוקטוז, β-פרוקטוז, סוכרוז, חומצת לימון ואלנין11. רווח רזולוציה זה היה קריטי גם בעת שילוב ניתוח מקדמי PLS עם מתאם STOCSY, איורים 10C ו- 10D11. המתאם החזק בין α- גלוקוז (וקטור STOCSY ב- 5.23 ppm מקודד בצבע ברכיב PLS הראשון) לבין β- גלוקוז, α-פרוקטוז ו- β- פרוקטוז - כולם מטבוליטים המתפתחים מאותו מסלול מטבולי - והאנטי-קורלציה שלו ביחס לסוכרוז, ניכרים11. בניתוח STOCSY רגיל, החפיפה הנרחבת לא אפשרה תיאור ברור בין מקדמי מתאם וגרמה לאובדן של מידע מסוים זה על המסלול המטבולי (איור 10)11.

figure-results-11264
איור 1. (A) ספקטרום פסיכה של תמציות וניל פלניפוליה באמצעות זוויות היפוך דופק CHIRP שונות עבור אלמנט PSYCHE: שמאל, ערכי זווית היפוך; מימין, גורם כפל עוצמה. (B) ו- (C) גרפים מראים את העוצמות והאות לרעש של חמש פסגות נפרדות (שחור - 4.31 עמודים לדקה, כתום - 4.16 עמודים לדקה, אדום - 2.65 עמודים לדקה, צהוב - 2.63 חל"מ וכחול 2.56 חל"מ) כפונקציה של זווית ההיפוך של פולס PSYCHE CHIRP, בהתאמה. יחס אות לרעש (S/N) (ליתר דיוק, יחס אות לרעש + חפץ) חושב באמצעות האות בעוצמה המרבית לעומת זה של הרעש, ערך שחושב בטווח של 2 עמודים לדקה: מ-7.75 עמודים לדקה עד 9.75 עמודים לדקה (איור S12). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12250
איור 2. ספקטרום PSYCHE (A) ו-SAPPHIRE-PSYCHE (B) של תמציות וניל פלניפוליה עם משך בלוק שונה של אינטרפרוגרמה Pure Shift. הניסויים נרכשו על מנת לשמור על אותה רזולוציה ורגישות דיגיטלית. פרמטר PSYCHE (A) מלמטה למעלה: 128 סריקות, 64 בלוקים אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 6.4 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 6h07min; 128 סריקות, 32 בלוקים אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 12.8 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 3 ש' 04 דקות; 128 סריקות, 16 בלוקים אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 25.6 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 1 ש' 32 דקות; 128 סריקות, 8 בלוקים אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 51.2 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 46 דקות; 128 סריקות, 4 בלוקי אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 102.4 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 24 דקות. פרמטר SAPPHIRE-PSYCHE (B) מלמטה למעלה: 16 סריקות, 8 דרגות אפנון J , 65 בלוקי אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 6.4 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 6 ש' 19 דקות; 16 סריקות, 8 דרגות אפנון J , 33 בלוקים אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 12.8 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 3 ש' 13 דקות; 16 סריקות, 8 דרגות אפנון J , 17 בלוקים אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 25.6 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 1 ש' 40 דקות; 16 סריקות, 8 דרגות אפנון J , 9 בלוקים אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 51.2 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 53 דקות; 16 סריקות, 8 דרגות אפנון J , 5 בלוקים אינטרפרוגרמה, אורך בלוק 102.4 אלפיות השנייה, זמן רכישה כולל 30 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-13965
איור 3. (A) ספקטרום של תמציות וניל (Vanilla planifolia ) באורך גוש של 102.4 אלפיות השנייה: למעלה, PSYCHE 128 סריקות, 4 דרגות Pure Shift; חלק עליון אמצעי, 4 סריקות, 4 דרגות Pure Shift, 32 דרגות ספיר; תחתית אמצעית, 8 סריקות, 4 דרגות Pure Shift, 16 דרגות ספיר; למטה, 16 סריקות, 4 דרגות Pure Shift, 16 דרגות ספיר. (B) ספקטרום של תמציות וניל (Vanilla planifolia) באורך גוש של 51.2 אלפיות השנייה: למעלה, PSYCHE 128 סריקות, 8 דרגות Pure Shift; חלק עליון אמצעי, 4 סריקות, 9 דרגות Pure Shift, 32 דרגות ספיר; תחתית אמצעית, 8 סריקות, 9 דרגות Pure Shift, 16 דרגות ספיר; למטה, 16 סריקות, 9 דרגות Pure Shift, 16 דרגות ספיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-14965
איור 4. אזורי הרחבה נבחרים של 1H NMR (1H) וספקטרום ספיר-פסיכה (S) V. planifolia (1.85 - 2.9 ppm) ו - V. pompona (4.85 - 7.31 ppm), המציגים הקצאות אותות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-15485
איור 5. מבנים של מבשרי ניחוח וניל: 4-הידרוקסיבנזיל אלכוהול (4-HBA), גלוקוזיד 4-HBA, גלוקוזיד A וגלוקוזיד B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-15931
איור 6. אזורי התפשטות נבחרים של 1HNMR (1H), פסיכה (P) וספיר (S) ספקטרום של תמצית מימית של דומדמניות כף (Bambamarca I אזור האנדים הפרואני28) המציג הקצאות אותות (הודפס מחדש באישור לופז ואחרים 11 ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-16524
איור 7. אזורי התפשטות נבחרים של 1HNMR (1H), פסיכה (P) וספיר (S) ספקטרום של תמצית מימית של תפוח אדמה המראה הקצאת אות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-17007
איור 8. אזורים מורחבים נבחרים (3.20 חל"מ עד 4.30 חל"מ) של ספקטרום STOCSY NMR דו-ממדי התקבלו עם נתונים משש תמציות דומדמניות כף המראים ערכי מתאם (r2) מעל 0.85: (A) רגיל 1H NMR STOCSY ו-(B) ספיר-פסיכה סטוסי. הודפס מחדש באישור Lopez et al.11 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-17663
איור 9. ייצוגי STOCSY של ספקטרום NMR של שש תמציות דומדמניות כף שונות המראים מתאמים (r2), משמאל ללא homodecoupling ובימין עם homodecoupling עבור אזורים: (A) 4.38-4.42 ppm ו- 2.40-4.42 ppm עם r2 מעל 0.80 עבור אות חומצה מאלית (MA) (Hα-MA); (B) 3.21-3.27 חל"מ ו-3.21-4.67 חל"מ עם r2 מעל 0.85 עבור אות β-גלוקוז (H2-β-Gluc); (C) 2.30-2.38 עמודים לדקה ו-1.25-4.36 עם r2 מעל 0.93 עבור אות פרולין (Pro) (Hβ′-Pro); (D) 2.15-2.17 חל"מ ו-1.25-4.5 חל"מ עם r2 מעל 0.90 חל"מ עבור אות חומצה גלוטמית (Glu) (Hβ-Glu); α-גלוקוז, α-פרוקטוז, β-פרוקטוז מסומלים כ-α-גלוק, α-פרוק ו-β-פרוק, בהתאמה. הודפס מחדש באישור Lopez et al.11 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-18754
איור 10. PLS מבקיע חלקת תמציות דומדמניות כף הגדלות בשישה אזורים שונים בהרי האנדים11,28 (סן מרקוס: עיגולים אדומים, סלנדין III: משולשים חומים, במבמרקה I: כוכבים כחולים, סלנדין I: משולשים צהובים, במבמרקה II: ריבועים ירוקים, סלנדין II: יהלומי מג'נטה) המבוססים על (A) ניסויים קלאסיים של 1H NMR ו-(B) ספיר-פסיכה. אליפסות T2 של הוטלינג הוגדרו לרמת ביטחון של 95%. שילוב של עומסי PLS1 ו-1D STOCSY למתאם α-גלוקוז באמצעות אות STOCSY ב-5.23 עמודים לדקה כשיא הנהג. מקדם הקביעות (r2) קודד בצבע והוקרן על מקדמי רכיב ה- PLS הראשון: (A) STOCSY 1D שהתקבל עם נתוני SAPPHIRE-PSYCHE (למעלה) והרחבתו 3.15-4.17 ppm (למטה); (B) STOCSY 1D המתקבל עם נתוני NMR של 1H (למעלה) והרחבתו 3.15-4.17 עמודים לדקה (למטה); α-גלוקוז, β-גלוקוז, α-פרוקטוז, β-פרוקטוז וסוכרוז מסומלים כ-α-G, β-G, α-F, β-F ו-S, בהתאמה. ניתוח PLS-DA ו-STOCSY בוצע באמצעות MATLAB Version R2018a. (הודפס מחדש באישור לופז ואחרים 11) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

זיהוי מכנסי מטבוליטים וכימות הם נושאים מרכזיים באפיון המטבוליזם, נתונים שכאשר הם נתונים לניתוחים מרובי משתנים מאפשרים להבין טוב יותר את המערכת הביולוגית הנחקרת. הכנת מדגם ורכישת נתונים הם היבטים קריטיים הזקוקים לאופטימיזציה על מנת לספק תוצאות אמינות.

במאמר זה נתאר ונמחיש את הכנת הדגימה לניתוח NMR של שלוש מטריצות צמחים שונות. כמו בכל הליך מיצוי, כמות הממס לגרם של חומר והתכונות הפיזיקליות של הממס שנבחר יקבעו את ההרכב הכימי של התמצית הסופית ואת ריכוז המטבוליטים שחולצו. במקרה של פרופיל מטבולי NMR, pH, שכפול בין מיצוי דגימה בלתי תלוי, וכמות סופית של תמצית בצינור NMR הם גם היבטים הדורשים אופטימיזציה. חשיבות השחזור במטבולומיקה היא להימנע מהכנסת שונות לא מתואמת, שעלולה להוביל לתוצאות לא אמינות. מניסיוננו, הושגו תנאי מיצוי אופטימליים עם החומר הצמחי היבש והטחון. במקרה של דומדמניות הכף, המוצר היבש היה קשה מאוד לטיפול (היגרוסקופי מאוד) ולכן פירות היער הטריים היו הומוגניים תחילה, לפני lyophillization.

במקרה של רכישת ספקטרה, ההתקנה הניסיונית של Pure Shift היא בעלת חשיבות מיוחדת, מכיוון שפרמטרים שגויים יכולים להוביל לקיבוץ ושחזור של תוצרים. התיאוריה שמאחורי עקרונות ניסויי Pure Shift, שנסקרה בהרחבה במקומות אחרים 8,9,10, חשובה כדי להבין כיצד להגדיר נכון את רצף הדופק וליישם אותו כניסוי שגרתי.

בקצרה, רוב ניסויי Pure Shift מבוססים על מיקוד מחדש של אבולוציית צימוד J במהלך רישום שינויים כימיים. זה מושג בדרך כלל על ידי אלמנט מיקוד מחדש של צימוד J שהופך באופן סלקטיבי ספינים "פסיביים", בעוד שהספינים ה"פעילים" נשארים ללא השפעה. PSYCHE ו-SAPPHIRE-PSYCHE מבוססים על ניסוי anti-z-COSY שבו ספינים "פסיביים" הם הפוכים סטטיסטית.

אלמנט ה-PSYCHE, המורכב משני פולסים בעלי זווית היפוך נמוכה בתדר סוחף בנוכחות שיפוע שדה פועם חלש, משרה ממוצע מרחבי-זמני של תדרים, תוך בחירת מונחי COSY האנטי-אלכסוניים תוך דיכוי מונחי מתאם קוונטי וצלב אפס. בהתאם לכך, כדי להימנע מהחזרי הצימוד הטבועים, זווית היפוך הדופק של CHIRP צריכה להיות קצרה (איור 1). בדרך כלל, זווית היפוך של 20° היא פשרה טובה בין רגישות לביצועי ניתוק (איור 1). לכן, כיול הדופק הוא קריטי לאיכות ולרגישות של הספקטרום.

מחקרים מטאבולומיים קשורים בדרך כלל להקלטת ספקטרום על מספר רב של דגימות, מה שמרמז על כיול הדופק חייב להיות מהיר או אוטומטי. מניסיוננו, אם מכינים את הדגימות בדיוק באותו אופן, השונות באורך הדופק הקשיח בין הדגימות קטנה מ-± 0.2 מיקרוגרם. בדרך כלל אנו מכיילים בין 6 ל-12 דגימות ולאחר מכן משתמשים בערך הממוצע שהושג כדי להגדיר את כל קבוצת הדגימות. במקרה שהשונות באורך הדופק מדגימה לדגימה הייתה גבוהה יותר, יש לבצע כיול אוטומטי של כל דגימה באמצעות תוכנת אוטומציה דופקית Topspin על ספקטרומטר Bruker.

הפרמטר החשוב השני שיש לקחת בחשבון הוא אורך הבלוקים שנרשמו במהלך רכישת האינטרפרוגרמה המדורגת21,23. רכישת אינטרפרוגרמה מורכבת מרישום ה-FID על ידי גושים קטנים, כאשר נקודת המיקוד מחדש של התפתחות צימוד J תמיד חופפת למרכז הגוש הנרכש. FID מנותק נבנה על ידי שרשור כל גוש עוקב 8,9,10. כדי להבטיח שרכישת הבלוק לא תפגע בהתפתחות ההסטה הכימית, ההתחלה של כל רישום נתונים חייבת להתאים בדיוק לסוף הקטע הקודם.

אף על פי שהליך זה מאפשר לנו לקבל ספקטרום הומודצימוד, האבולוציה הקטנה של צימוד J במהלך כל בלוק יוצרת פסי צד מחזוריים התלויים ישירות באורך הגוש. מצד שני, הרזולוציה הדיגיטלית הספקטרלית תלויה בחלון הספקטרלי ובמשך הכולל של ה- FID המנותק, אשר, בתורו, תלוי באורך הבלוק ובמספר הבלוקים המוקלטים. לכן, כדי להפחית ממצאים תקופתיים מבלי להקריב את הרזולוציה, משך הבלוק צריך להיות קצר, והמספר הכולל של בלוקים מתועדים צריך להיות גבוה. תנאים אלה, לעומת זאת, יגדילו מאוד את זמן רכישת הניסוי הכולל מבלי להגביר את הרגישות (איור 2). בדרך כלל, ניסוי PSYCHE שנרכש עם 16 עד 32 בלוקים של 10 עד 16 מילישניות משך נותן מספיק רזולוציה דיגיטלית בזמן ניסוי סביר (30 דקות עד 5 שעות) (איור 2).

במקרה של SAPPHIRE-PSYCHE, ניסוי שנרכש כפסאודו תלת-ממדי, אחד הממדים העקיפים מקודד לרכישת אינטרפרוגרמה של Pure Shift והשני לאפנון הפאזה של הממצאים המחזוריים באמצעות הסטה שיטתית של נקודת המיקוד מחדש של J בכל גוש.

מכיוון שממצאים תקופתיים מדוכאים מאוד על ידי ספיר, אורכי הבלוקים עשויים להיות ארוכים יותר; אולם גושים ארוכים מאוד משפיעים מאוד על עוצמת האותות (איורים 2 ו-3). בספיר, תוספות אפנון J תורמות לרגישות הספקטרום, ולכן המספר הכולל של סריקות FID מנותקות שווה ל- TD2 * NS (איורים 2 ו- 3)23. באופן כללי, שמונה דרגות אפנון J מבטיחות דיכוי ארטיפקט מחזורי מצוין, וליותר משמונה דרגות יש השפעה מועטה מאוד על איכות הספקטרום, אפילו אם משתמשים באורכי גושים ארוכים (איור 3)23. דרגות Pure Shift של 33 או 17 עם משכי זמן בין 20 ל-40 אלפיות השנייה מבטיחות רזולוציה דיגיטלית ספקטרלית טובה.

מגבלה אחת של שני רצפי פולסי Pure Shift אלה, PSYCHE ו-SAPPHIRE-PSYCHE, היא כימות על ידי אינטגרציה מוחלטת של תקן מטבוליט-פנימי. ב- 1H-NMR רגיל, העוצמה המשולבת עומדת ביחס ישר לריכוז של כל מטבוליט. בפסיכה זה כבר לא המצב, כי מספר תופעות מעוותות את האותות ומשפיעות על האינטגרציה. לדוגמה, הערך האינטגרלי הכולל פוחת עקב הרפיית T2 במהלך בחירת הספין של רצף הדופק. כמו כן, אבולוציית הצימוד J הקטועה במהלך רכישת הגוש היוצרת חפצי צד, משבשת את הצורה הלורנציאנית של האות. לפיכך, האינטגרל מורכב כעת מאזורים מתחת לפסגה הראשית ומתחת לכל הפסים הצדדיים, מה שמסבך את שילוב האותות 8,9,21,23. התדירות והגודל של רצועות הצד קשורות ישירות לאורך הגוש אך גם לתכונות מולקולריות מהותיות כגון הרפיה וגודל צימוד J וריבוי: עוצמות צימוד J גבוהות יותר וריבוי גבוה יותר, מובילים לאותות מעוותים יותר. במקרה של ספיר, למרות שניסוי NMR זה מסיר ביעילות את תוצרי הפס הצידי, עוצמות האות נפגעות על ידי אבולוציית צימוד J קטועה. הסכום של כל תוספת אפנון J, יוצר FID מנותק ממוצע שבו הפחתת האות קשורה ישירות לאורך הגוש ולגודל הצימוד J ולריבוי 23. יתר על כן, זוויות היפוך דופק CHIRP מייצרות ארטיפקט recoupling אשר גם משפיע על כל אות באופן שונה, מה שמסבך עוד יותר את הכימות21. עוצמת ההשפעה של רצפי פולסים אלה בניתוח כמותי הוערכה במחקר הקודם שלנו Cape gooseberry והניבה טעויות של כ-10% עד 30%11.

לבסוף, אנו יכולים להסיק כי Pure Shift הוא כלי חדש מצוין עבור metabolomics צמחים, שכן הוא מגדיל באופן דרסטי את רזולוציית הספקטרום, המאפשר ניתוח מטריצת מתאם עדין יותר ופרשנות טובה יותר של ניתוחים רב משתניים 11,24,25,27,28.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) - Programa Atracción de Investigadores Cienciactiva - חוזה # 008-2017-FONDECYT.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
77500 Series Freezone 4.5 Liter benchtopLabconco77500
Bruker Avance III 500 MHz equiped with a 5 mm TCI Z-gradient cryogenic probeBruker Corporation
Centrivap Refrigerated Centrifugal Concentrators Labconco 7310000 SeriesLabconco7310000
Deuterium oxideSigma-Aldrich151882
Grinder machine MKM6003BoschMKM6003
Licuadora Blender 8011S model Hgb2wts3WaringHgb2wts3
Methanol-d4Sigma-Aldrich151947

References

  1. Hall, R., Beale, M., Fiehn, O., Hardy, N., Sumner, L., Bino, R. Plant metabolomics: the missing link in functional genomics strategies. The Plant Cell. 14 (7), 1437-1440 (2002).
  2. Fiehn, O. Metabolomics-the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
  3. Schauer, N., Fernie, A. R. Plant metabolomics: towards biological function and mechanism. Trends in Plant Science. 11 (10), 508-516 (2006).
  4. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go. Trends in Biotechnology. 29 (6), 267-275 (2011).
  5. Kumar, R., Bohra, A., Pandey, A. K., Pandey, M. K., Kumar, A. Metabolomics for Plant Improvement: Status and Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  6. Dumez, J. -. N., et al. Hyperpolarized NMR of plant and cancer cell extracts at natural abundance. Analyst. 140 (17), 5860-5863 (2015).
  7. Emwas, A. -. H., et al. NMR Spectroscopy for Metabolomics Research. Metabolites. 9 (7), (2019).
  8. Zangger, K. Pure shift NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 86-87, 1-20 (2015).
  9. Foroozandeh, M., Morris, G. A., Nilsson, M. PSYCHE Pure Shift NMR Spectroscopy. Chemistry - A European Journal. 24 (53), 13988-14000 (2018).
  10. Castañar, L. Pure shift NMR: Past, present, and future. Magnetic Resonance in Chemistry. 56 (10), 874-875 (2018).
  11. Lopez, J. M., Cabrera, R., Maruenda, H. Ultra-Clean Pure Shift 1 H-NMR applied to metabolomics profiling. Scientific Reports. 9 (1), 1-8 (2019).
  12. Marcó, N., Gil, R. R., Parella, T. Isotropic/Anisotropic NMR Editing by Resolution-Enhanced NMR Spectroscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (9), 1024-1029 (2018).
  13. Kaltschnee, L., et al. Extraction of distance restraints from pure shift NOE experiments. Journal of Magnetic Resonance. 271, 99-109 (2016).
  14. Sinnaeve, D., et al. Improved Isotopic Profiling by Pure Shift Heteronuclear 2D J-Resolved NMR Spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (6), 4025-4031 (2018).
  15. Timári, I., et al. Real-Time Pure Shift HSQC NMR for Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2304-2311 (2019).
  16. Zhao, Q., et al. Combination of pure shift NMR and chemical shift selective filters for analysis of Fischer-Tropsch waste-water. Analytica Chimica Acta. 1110, 131-140 (2020).
  17. Zhao, Q., et al. Pure Shift NMR: Application of 1D PSYCHE and 1D TOCSY-PSYCHE Techniques for Directly Analyzing the Mixtures from Biomass-Derived Platform Compound Hydrogenation/Hydrogenolysis. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 9 (6), 2456-2464 (2021).
  18. Foroozandeh, M., et al. Ultrahigh-Resolution Diffusion-Ordered Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (50), 15579-15582 (2016).
  19. Castañar, L., Pérez-Trujillo, M., Nolis, P., Monteagudo, E., Virgili, A., Parella, T. Enantiodifferentiation through Frequency-Selective Pure-Shift 1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. ChemPhysChem. 15 (5), 854-857 (2014).
  20. Lopez, J. M., Sánchez, L. F., Nakamatsu, J., Maruenda, H. Study of the Acetylation Pattern of Chitosan by Pure Shift NMR. Analytical Chemistry. , (2020).
  21. Foroozandeh, M., Adams, R. W., Meharry, N. J., Jeannerat, D., Nilsson, M., Morris, G. A. Ultrahigh-Resolution NMR Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6990-6992 (2014).
  22. Foroozandeh, M., Adams, R. W., Kiraly, P., Nilsson, M., Morris, G. A. Measuring couplings in crowded NMR spectra: pure shift NMR with multiplet analysis. Chemical Communications. 51 (84), 15410-15413 (2015).
  23. Moutzouri, P., et al. Ultraclean pure shift NMR. Chemical Communications. 53 (73), 10188-10191 (2017).
  24. Santacruz, L., Hurtado, D. X., Doohan, R., Thomas, O. P., Puyana, M., Tello, E. Metabolomic study of soft corals from the Colombian Caribbean: PSYCHE and 1 H-NMR comparative analysis. Scientific Reports. 10 (1), 5417 (2020).
  25. Stark, P., Zab, C., Porzel, A., Franke, K., Rizzo, P., Wessjohann, L. A. PSYCHE-A Valuable Experiment in Plant NMR-Metabolomics. Molecules. 25 (21), 5125 (2020).
  26. Kakita, V. M. R., Rachineni, K., Hosur, R. V. Ultraclean Pure Shift NMR Spectroscopy with Adiabatic Composite Refocusing Pulses: Application to Metabolite Samples. ChemistrySelect. 4 (34), 9893-9896 (2019).
  27. Bo, Y., et al. High-resolution pure shift NMR spectroscopy offers better metabolite discrimination in food quality analysis. Food Research International. 125, 108574 (2019).
  28. Watermann, S., Schmitt, C., Schneider, T., Hackl, T. Comparison of Regular, Pure Shift, and Fast 2D NMR Experiments for Determination of the Geographical Origin of Walnuts. Metabolites. 11 (1), 39 (2021).
  29. Leyva-Zegarra, V., et al. NMR-based leaf metabolic profiling of V. planifolia and three endemic Vanilla species from the Peruvian Amazon. Food Chemistry. , 129365 (2021).
  30. Toubiana, D., et al. Morphological and metabolic profiling of a tropical-adapted potato association panel subjected to water recovery treatment reveals new insights into plant vigor. The Plant Journal. 103 (6), 2193-2210 (2020).
  31. Maruenda, H., Cabrera, R., Cañari-Chumpitaz, C., Lopez, J. M., Toubiana, D. NMR-based metabolic study of fruits of Physalis peruviana L. grown in eight different Peruvian ecosystems. Food Chemistry. 262, 94-101 (2018).
  32. Cloarec, O., et al. Statistical total correlation spectroscopy: an exploratory approach for latent biomarker identification from metabolic 1H NMR data sets. Analytical Chemistry. 77 (5), 1282-1289 (2005).
  33. Steuer, R. Review: on the analysis and interpretation of correlations in metabolomic data. Briefings in Bioinformatics. 7 (2), 151-158 (2006).
  34. Trygg, J., Holmes, E., Lundstedt, T. Chemometrics in Metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 469-479 (2007).
  35. Worley, B., Powers, R. Multivariate Analysis in Metabolomics. Current Metabolomics. 1 (1), 92-107 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

NMRPure Shift

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved