ריבוי תאים ואיברים דנטליים ונשימתיים במיקרו-כבידה

פרוטוקול זה מציג שיטה לתרבית ולצמיחה תלת-ממדית של תאים דמויי אמלובלסט במיקרו-כבידה כדי לשמור על צורתם המוארכת והמקוטבת, כמו גם על ביטוי חלבונים ספציפיים לאמייל. כמו כן מתוארים תנאי תרבית לתרבית של מבנים הנדסיים פריודונטליים ואיברי ריאה במיקרו-כבידה.

כוח הכבידה הוא אחד הגורמים המרכזיים המשפיעים על תפקוד התא האנושי, התפשטותו, ארכיטקטורה ציטוסקטלית והתמצאות. מערכות ביוריאקטורים סיבוביים (RCCSs) מחקות את אובדן הכבידה כפי שהוא מתרחש בחלל ובמקום זאת מספקות סביבת מיקרו-כבידה באמצעות סיבוב מתמשך של תאים או רקמות בתרבית. RCCSs אלה מבטיחים אספקה ללא הפרעה של חומרים מזינים, גורמי גדילה ושעתוק וחמצן, ומטפלים בכמה מהחסרונות של כוחות הכבידה בכלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תאים דו-ממדיים או של תרביות איברים ללא תנועה. במחקר הנוכחי השתמשנו ב-RCCSs כדי לתרבת תאים של לולאת צוואר הרחם ותאי מוך השן כדי להפוך לאמלובלסטים, כדי לאפיין אינטראקציות של אבות חניכיים/פיגומים, וכדי לקבוע את ההשפעה של דלקת על נאדיות ריאה. סביבות ה-RCCS הקלו על צמיחה של תאים דמויי אמלובלסט, קידמו שגשוג אבות חניכיים בתגובה לציפויי פיגומים, ואפשרו הערכה של ההשפעות של שינויים דלקתיים על נאדיות ריאה בתרבית. כתב יד זה מסכם את התנאים הסביבתיים, החומרים והצעדים לאורך הדרך ומדגיש היבטים קריטיים ופרטים ניסיוניים. לסיכום, RCCSs הם כלים חדשניים כדי לשלוט בתרבית ובצמיחה התלת-ממדית (תלת-ממדית) של תאים במבחנה ולאפשר מחקר של מערכות תאיות או אינטראקציות שאינן מקובלות על סביבות תרבית דו-ממדיות קלאסיות.

כוח הכבידה משפיע על כל היבטי החיים על פני כדור הארץ, כולל הביולוגיה של תאים בודדים ותפקודם בתוך אורגניזמים. תאים חשים את כוח הכבידה באמצעות מכנורצפטורים ומגיבים לשינויים בכוח הכבידה על ידי הגדרה מחדש של ארכיטקטורות ציטוסקטליות ועל ידי שינוי חלוקת התא ^1,2,3. השפעות אחרות של מיקרו-כבידה כוללות את הלחץ ההידרוסטטי בבועיות מלאות בנוזל, שקיעה של אברונים, והסעה מונעת ציפה של זרימה וחום⁴. מחקרים על השפעת אובדן כוח הכבידה על תאים ואיברים אנושיים נערכו במקור כדי לדמות את הסביבה חסרת המשקל של החלל על אסטרונאוטים במהלך משימות טיסה בחלל⁵. עם זאת, בשנים האחרונות, טכנולוגיות הביו-ריאקטור התלת-ממדיות הללו, שפותחו במקור על ידי נאס"א כדי לדמות מיקרו-כבידה, הופכות רלוונטיות יותר ויותר כגישות חדשניות לתרבית של אוכלוסיות תאים, שאחרת אינן מקובלות על מערכות תרבית דו-ממדיות.

ביוריאקטורים תלת-ממדיים מדמים מיקרו-כבידה על-ידי גידול תאים בתרחיף ובכך יוצרים אפקט קבוע של "נפילה חופשית". יתרונות נוספים של הביוריאקטורים המסתובבים כוללים את היעדר החשיפה לאוויר במערכות תרבית איברים, הפחתה בלחץ הגזירה ובמערבולות, וחשיפה מתמשכת לאספקה משתנה של חומרי מזון. תנאים דינמיים אלה המסופקים על ידי ביוריאקטור של מערכת תרביות תאים סיבובית (RCCS) מעדיפים לוקליזציה של קו-לוקליזציה מרחבית והרכבה תלת-ממדית של תאים בודדים לתוך אגרגטים ^6,7.

מחקרים קודמים הדגימו את היתרונות של ביוריאקטור סיבובי להתחדשות עצם⁸, תרבית נבט שיניים⁹, ולתרבית של תאי זקיק דנטליים^{אנושיים 10}. כמו כן, פורסם דו"ח המצביע על כך ש-RCCS מגביר את התפשטות תאי ה-EOE ואת התמיינותם לאמלובלסטים¹¹. עם זאת, תאים ממוינים נחשבו לאמלובלסטים המבוססים על אימונופלואורסצנציה של אמלובלסטין ו/או ביטוי אמלוגנין בלבד¹¹ מבלי לקחת בחשבון את המורפולוגיה המוארכת שלהם או את צורת התא המקוטבת שלהם.

בנוסף לביוריאקטור של כלי קיר מסתובבים (RWV) שפותח על ידי נאס"א, טכנולוגיות אחרות ליצירת אגרגטים תלת-ממדיים מתאים כוללות ריחוף מגנטי, מכונת המיקום האקראית (RPM) והקלינוסטט¹². כדי להשיג ריחוף מגנטי, תאים המסומנים בננו-חלקיקים מגנטיים מרחפים באמצעות כוח מגנטי חיצוני, וכתוצאה מכך נוצרים מבנים תלת-ממדיים נטולי פיגומים ששימשו לייצור ביולוגי של מבנים אדיפוציטים^13,14,15. גישה נוספת להדמיית מיקרו-כבידה היא יצירת כוחות G רב-כיווניים על ידי שליטה בסיבוב סימולטני על שני צירים וכתוצאה מכך ביטול וקטור הכבידה המצטבר במרכז התקן הנקרא קלינוסטט¹⁶. כאשר תאי גזע של מח עצם גודלו בתרבית בקלינוסטט, היווצרות עצם חדשה עוכבה באמצעות דיכוי התמיינות אוסטאובלסט, מה שממחיש את אחת ההשפעות המפרישות של מיקרו-כבידה¹⁶.

מערכות במבחנה כדי להקל על התרבות הנאמנה של אמלובלסטים יספקו צעד גדול קדימה לקראת הנדסת רקמת אמייל השן¹⁷. למרבה הצער, עד כה, תרבות האמלובלסטים הייתה משימה מאתגרת^18,19. עד כה דווח על חמישה קווי תאים שונים דמויי אמלובלסטים, כולל קו תאי שושלת האמלובלסטים של העכבר (ALC), קו תאי האפיתל הדנטלי של החולדה (HAT-7), קו תאי LS8 של העכבר²⁰, קו התאים PABSo-E החזירי 21 וקו התאים SF2-24 של החולדה²². עם זאת, רוב התאים האלה איבדו את צורת התא המקוטבת הייחודית שלהם בתרבית דו-ממדית.

במחקר הנוכחי פנינו למערכת ביוריאקטורים של תרבית תאים סיבוביים (RCCS) כדי להקל על צמיחתם של תאים דמויי אמלובלסט מאפיתליה של לולאת צוואר הרחם בתרבית משותפת עם אבות מזנכימליים ולהתגבר על האתגרים של מערכות תרבית דו-ממדיות, כולל זרימה מופחתת של חומרים מזינים ושינויים ציטוסקטליים עקב כוח הכבידה. בנוסף, ה-RCCS סיפק אפיקים חדשניים לחקר אינטראקציות בין תאים לפיגומים הקשורים להנדסת רקמות חניכיים ולבחינת ההשפעות של מתווכי דלקת על רקמות נאדיות ריאה במבחנה. יחד, תוצאות מחקרים אלה מדגישות את היתרונות של מערכות תרבית סיבוביות מבוססות מיקרו-כבידה להפצת אפיתליה מובחנת ולהערכת השפעות סביבתיות על תאים הגדלים במבחנה, כולל אינטראקציות בין תאים לפיגומים ותגובת הרקמות למצבים דלקתיים.

כל האישורים המוסדיים הדרושים הושגו כדי להבטיח שהמחקר תואם את ההנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים של TAMU.

1. הרכבה ועיקור של ביוריאקטורים

1. יש לעקר ארבעה כלי בעלי יחס גובה-רוחב גבוה (HARV) עבור הביוריאקטור באוטוקלאב במחזור המכשירים הפלסטיים למשך 20 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס לפי המלצת היצרן.
2. לאחר העיקור, הרכיבו את כלי הדם במכסה המנוע של תרבית התאים על ידי הידוק הברגים המסופקים עם הביוריאקטור ולאחר מכן כלי הדם מוכנים לשימוש.

2. פיגומים המשמשים לניסוי בתרבית ביוריאקטור

1. דגירה של הפיגומים יחד עם התאים כדי לספק תמיכה לחיבור התאים הנחוצה להמשך הצמיחה.
2. בחרו בין פיגומים מבוססי PGA, פיגומי הידרוקסיאפטיט, יריעות גרפן, דיסקיות ג'לטין ופיגומים מבוססי קולגן למחקרי תרביות משותפות.

3. דיסקציה של לולאת צוואר הרחם (CL) והכנת תא בודד

1. להקריב עכברים על ידי עריפת ראש בעקבות מעצר נשימתי על ידי מנת יתר של CO₂ .
   הערה: כל המחקרים בבעלי חיים תואמים להנחיות המוסדיות של TAMU לטיפול בבעלי חיים.
2. נתחו לולאות צוואר הרחם מעכברים לאחר הלידה (DPN) במשך 6 ימים בעקבות גרסה שונה של פרוטוקול²³ שפורסם בעבר.
   הערה: במחקר שלנו, החלק הדיסטלי של לולאת צוואר הרחם שאינו מוצג בפרוטוקול שפורסם בעבר נכלל (איור 3).
   1. שטפו את הרקמה המנותקת ב-PBS סטרילי קר לפני העיכול עם קולגןאז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. מעבירים את התמיסה דרך מסננת תאים סטריליים בקוטר 70 מיקרומטר וצנטריפוגה נוספת בגודל 800 x גרם למשך 10 דקות.
4. השליכו את הסופר-נטנט. צנטריפוגה את הכדור לשטוף פעמיים עם PBS קר ב 800 x גרם. השליכו את הסופר-נטנט.
5. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהוסיף 1 X 10^{5 תאים לכל} כלי.

4. תרבית תאי מוך השן והרחבת קו התא

1. צלחת תאי מוך שיניים בצלחת תרבית רקמה 100 מ"מ במעבר 4 בריכוז של 1 x 10⁵.
2. הכינו את המדיה לתרבית המורכבת ממדיה עתירת גלוקוז DMEM, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטי (P/S).
3. כאשר התאים מגיעים למפגש של 85-90%, שאפו את המדיום ושטפו את הצלחות פעמיים עם PBS שחומם מראש.
4. לאחר שטיפת PBS, יש להוסיף לצלחת תמיסת טריפסין-EDTA שחוממה מראש ב-0.25%, ולדגור על הצלחות המכילות תאי מוך השן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
5. אשר את ניתוק התא על ידי בדיקה חזותית באמצעות מיקרוסקופ.
6. לאסוף את המדיה יחד עם התאים מצלחת התרבית ולהעביר באמצעות פיפטה 25 מ"ל לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
7. צנטריפוגה של התאים ב 800 x גרם במשך 8 דקות ולהשליך את supernatant. יש להשעות את התאים במדיה טרייה ולספור באמצעות המוציטומטר.
8. עבור תרבית משותפת עם תאי לולאה צווארית, זרעו את תאי מוך השן בביוריאקטור בריכוז של 1 x 10⁴ לכל כלי.

5. תרבית משותפת של תאי לולאת צוואר הרחם/מוך השן על פיגום בתוך הביוריאקטור RCCS

1. הוסף את שני סוגי התאים, לולאת צוואר הרחם ואת מוך השן למדיום התרבית המכיל מדיית SFM קרטינוציטים עם גורמי גדילה משלימים, חלבוני מטריצה חוץ-תאית ופיגומים.
   הערה: גורמי גדילה מתווספים בריכוז של 0.03 מיקרוגרם/מ"ל חלבון מורפוגנטי עצם 2 (BMP 2), 0.03 מיקרוגרם/מ"ל חלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP-4), 10 ng/mL גורם גדילה פיברובלסט רקומביננטי אנושי (hFGF) ו-15 ng/mL גורם גדילה אפידרמלי (hEGF), בעוד שרכיבי ECM כללו 200 מיקרוגרם/מ"ל מטריגל, 5 מיקרוגרם/מ"ל למינין ו-5 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין.
2. פיגומי פרווה בתערובת של 500 μL של ג'ל קולגן מועשר ב-1 מ"ג של פפטיד LRAP (פפטיד אמלוגנין עשיר בלאוצין), 1 מ"ג של מטריצת אמייל בשלב מוקדם שהוכנה משיני חזיר²⁴, 5 מיקרוגרם/מ"ל למינין ו-5 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין.
   הערה: זה עבד הכי טוב עבור הניסויים שלנו.
3. לאחר ציפוי הפיגומים, הוסיפו את התאים ואת הפיגום לביוריאקטור, ומלאו את הביוריאקטור במדיום של 10 מ"ל לכל כלי.
4. סגור את מכסה יציאת המילוי של כלי הביוריאקטור לאחר הוספת מדיה, תאים ופיגומים.
5. חברו את השסתומים הסטריליים ליציאות המזרק בתחילת הניסוי והשאירו אותם במקומם עם כיסוי עד סוף הניסוי.
6. ברגע שהכלי מלא ב-90% ומכסי היציאה למילוי סגורים ומהודקים, פתחו את השסתומים הסטריליים.
7. השתמש בשני מזרקים סטריליים (3 מ"ל) בכל פעם שנדרש שינוי מדיה. ממלאים מזרק אחד במדיום טרי בעוד המזרק השני נותר ריק.
8. פתחו את שני שסתומי המזרק ותמרנו בעדינות את הבועות לכיוון יציאת המזרק הריקה.
9. לאחר שהמדיום הטרי מהמזרק המלא מוזרק בזהירות לכלי, הסר את הבועות דרך יציאת המזרק הריקה.
   הערה: הליך זה מבוצע עד שכל המיקרו-בועות מוסרות מהכלים.
10. סגרו את יציאות המזרקים עם פקקים והשליכו את המזרקים במיכל פסולת חד.
11. חברו כל כלי לבסיס המסובב והניחו את בסיס המסובב באינקובטור עם טמפרטורה של 5% CO₂ ו-37 מעלות צלזיוס.
12. הפעל את הכוח והגדר את מהירות הסיבוב ל-10.1 סל"ד.
    הערה: כוונן את המהירות כדי לוודא שהפיגומים נמצאים במתלה מבלי לגעת בדופן כלי השיט.
13. לשינוי מדיה, מקם את כלי הדם במצב זקוף כדי להבטיח שהתאים ישקעו בתחתית. פתח את יציאות המזרק וחבר את המזרקים הסטריליים ליציאות.
14. בצע את אותו הליך על ידי שאיפה של 75% מהמדיום המדולדל בתזונה והזרקת מדיום טרי דרך היציאה השנייה.

6. הכנת איברי ריאות ותרבית מבוססת ביוריאקטור

הערה: גורי עכברים מסוג בר E15 שימשו להכנת איברי ריאה.

1. לנתח את רקמת הריאה לאחר המתת עכבר בהריון עם חנק CO₂ .
   1. לאחר אישור המוות בעקבות חנק על ידי נקע צוואר הרחם, השתמש באזמל כדי לחשוף את חלל בית החזה. לאחר מכן, להסיר את הגורים מן הרחם ולהרדים על ידי עריפת ראש.
2. לאחר המתת חסד, להכין את חלל החזה על ידי פתיחתו עם אזמל כדי לאתר את הריאות. לשטוף מקטעים זעירים של רקמת ריאה עם PBS סטרילי ולהניח אותו על קרום מעוקר מראש במשך 2 שעות עם מדיום תרבית איברים באינקובטור המכיל 5% CO₂ ו 37 מעלות צלזיוס טמפרטורה.
3. ברגע שרקמות הריאה מתחברות לממברנה בצלחת תרבית איברים דו-ממדית, מעבירים את הדגימות לכלי הביוריאקטור.
4. הכינו את התקשורת לתרבות.
   הערה: מדיית הסוכר הגבוהה DMEM לבקרה מכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS), תמיסה אנטיביוטית 1% (P/S) (פניצילין, 100 U/mL, סטרפטומיצין, 50 מיקרוגרם/מ"ל) ו-100 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית (AA) ועבור אינדוקציה של מצבים דלקתיים, אמצעי הבקרה מתווסף לחלבון IL-6 של 5 ננוגרם/מ"ל.
5. בצע את ניסוי תרבית הריאות במשך 10 ימים עם שינוי מדיה כל 48 שעות בביוריאקטור כמתואר לעיל.

7. פיגום מצופה בתרבית תאים של רצועת חניכיים אנושית (hPDL)

1. תרבית תאי רצועת חניכיים אנושית.
   הערה: התאים מבודדים ומתורבתים במעבדה שלנו בהתאם לפרוטוקול^{שפורסם בעבר 25}.
2. מצפים את דיסקיות פיגומי הקולגן ב-30 μL של PBS לקבוצת הביקורת ואת הנוירופפטיד גלנין (GAL) בריכוז של ^10-8 בלילה.
3. זרעו תאי PDL אנושיים על פיגומי הבקרה וה-GAL המצופים במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בצלחת תרבית, והעבירו את הפיגומים שנזרעו בתאים לכלי ביוריאקטור כאמור לעיל.
4. תרבית התא זרע פיגומים במשך 14 יום בביוריאקטור לפני קצירת הפיגומים לניתוח.

8. ניקוי ותחזוקה של ביוריאקטורים

1. לאחר שהפיגומים/התאים נקטפים מהביוריאקטור, יש להסיר את יציאות המזרק מהספינה.
   הערה: הברגים סביב הכלים מוסרים והכלי נשטף בעדינות במי סבון.
2. שטפו את הכלים במים נקיים והדקו את הברגים פעם נוספת.
3. אחסנו את הכלים לאחר ההקפצה האוטומטית עד לשימוש הבא.

החדר הפנימי של הביוריאקטור מספק סביבה לתאים להתרבות ולהתמיין, להתחבר לפיגום או להתכנס ליצירת רקמות כמו מכלולים. כל כלי HARV מחזיק עד 10 מ"ל של בינוני ומאפשר מחזור קבוע של חומרים מזינים, כך שלכל תא יש סיכוי מצוין לשרוד. איור 1A ממחיש את החיבור של יציאות המזרק ללוח הקדמי של כלי השיט, שם מחוברים שסתומים חד-פעמיים סטריליים. שסתומים אלה משמשים כשוערים ללשכת התרבות. שינוי בינוני דורש פתיחה של שסתום הזין כדי להקל על חיבור מזרק סטרילי המכיל מדיום טרי. סביבת המיקרו-כבידה בתוך הביוריאקטור מאפשרת לתאים להתחבר לפיגום בתוך הכלי מבלי לדרוש זריעה מוקדמת על הפיגומים. הפיגום (איור 1B ו-1C) שממוקם בביו-ריאקטור מסתובב באופן רציף, מה שמאפשר לתאים להתחבר למשטחי פיגומים וליצור רשתות ציטוסקטליות. קרום המחמצן בתחתית לוחית כלי הדם (איור 1B) מאפשר חילופי גזים רציפים כדי לשפר את הישרדות התאים ואת תוחלת החיים.

פיגומים שונים נבדקו כדי לזהות את הפיגום המתאים ביותר לתאים. הפיגום באיורים 2A ו-2B הוא יריעת גרפן המורכבת מ-75% גרפן ו-25 % PLG (פולי-לקטיק גליקוליד). פיגום מוליך חשמלי זה משמש לעתים קרובות עבור תאים שעשויים לדרוש גירוי חשמלי, כגון תאי שריר השלד²⁶. במחקרים שלנו, פיגום הקולגן עלה על כל המחקרים האחרים שנבדקו במונחים של תאימות ביולוגית, קידום צמיחת רקמות והתמיינות תאית. המשטח הנקבובי המיוחד של הפיגום מבוסס הקולגן הזה (איור 2C ו-2D) מאפשר לתאים ולחומרים המזינים לזרום לאורך הפיגום, מה שמגדיל את שטח החיבור של התאים ואת התפשטות התאים.

מיקומה של לולאת צוואר הרחם ביחס למנדיבל העכבר מודגם באיורים 3A ו-3B. כדי להכין תאי לולאה צווארית חותכת של עכבר, נותח מנדיבל עכבר בעל שלד ונחשף החלק הדיסטלי ביותר של חותך העכבר התחתון. המיקום המדויק של לולאת צוואר הרחם שנכרתה מתוחם בחתך העכבר במשך 6 הימים שלאחר הלידה (איור 3B), בעוד שאזור דומה במנדיבל עכבר שלד בוגר מסופק כהפניה באיור 3A למטרות התמצאות. האזור של לולאת צוואר הרחם המתאימה בשלד הבוגר (איור 3A) ובחתך העכבר הטרי 6 dpn ממוסגר על-ידי שני קווים שבורים (איור 3A ו-B). השיניים של המנדיבלים של המי מורכבות משלוש טוחנות מנדיבולריות וחתך שגדל ברציפות, בעוד שנישת תאי הלולאה הצווארית מורכבת מאוכלוסיית תאים מעורבת המעורבת ביצירת אמייל כגון אפיתל האמייל הפנימי, אפיתל האמייל החיצוני, רשתית סטלטית ושכבה אינטרמדיום¹⁹.

איור 4 מתמקד בהתמיינות מוצלחת של תאי לולאת צוואר הרחם לחלבון אמייל מוארך, מקוטב, המפריש תאים דמויי אמלובלסט. הנתונים חשפו כי התמיינות מוצלחת של תאי חלבון אמייל מוארכים, מקוטבים, המפרישים תאים דמויי אמלובלסט, דורשת תרבית משותפת של תאי לולאת צוואר הרחם עם תאי גזע מזנכימליים כגון תאי גזע מוך השן. תאים בתרבית קיבלו מיקרו-סביבה מותאמת אישית כמתואר בשלב 3 של הפרוטוקול, וכתוצאה מכך נוצרו תאים מקוטבים עם הגרעין בקצה אחד ותהליך תאי ארוך^{בקצה השני 27}, מאפיין אופייני לאמלובלסטים (איור 4A). שימוש במדיה בלבד וללא גורמי גדילה ו/או ציפוי פיגומים הביא לתאי לולאה צווארית שהפרישו חלבוני אמייל מרכזיים אך לא התארכו או התקטבו (איור 4B).

פיגומי קולגן מצופים גלנין ולא מצופים הוכנסו לביוריאקטור עם תאי hPDL במשך 14 יום בביוריאקטור. התאים שרדו תקופת תרבית של שבועיים במערכת התרבית התלת-ממדית, וקבוצת הפיגומים המצופים גלנין הדגימה קצב התפשטות גבוה יותר באופן משמעותי (איור 5B) בהשוואה לקבוצת הביקורת שהכילה פיגומים לא מצופים (איור 5A). התאים בקבוצת הניסוי הדגימו גם רמה גבוהה משמעותית של מטריצה חוץ-תאית המכילה סיבי רקמת חיבור בהשוואה לקבוצת הביקורת.

הסביבה הביו-ריאקטורית הוכיחה את עצמה כמוצלחת לצמיחה של מקטעי ריאה בסביבת מיקרו-כבידה תלת-ממדית (איור 6). לצורך המחקר הזה, מקטעי רקמת ריאה שנקטפו מעכברי E15 (איור 6C) הונחו על קרום ניטרוצלולוז בצלחת תרבית איברים במשך שעתיים. לאחר חיבור ראשוני של רקמה לממברנה, רקמת הריאה/הממברנה הניטרו-תאית הוכנסה לכלי הביוריאקטור וגודלה בהצלחה במשך 10 ימים (איור 6A). כדי לחקור את ההשפעות של מצבים דלקתיים על צמיחת רקמת הריאה, הוספת IL-6 למדיום התרבית גרמה לשינויים אופייניים הקשורים לדלקת במורפולוגיה של הנאדיות, בדומה לאלה שנראו ב-vivo (איור 6B).

איור 1. רכיבים של כלי ביוריאקטור. איור 1 ממחיש מרכיבים מרכזיים של כלי ביוריאקטור ואת מיקומם בשלב טרום-הרכבה. (A) מיקום יחסי של תא הכור, יציאות המזרק והפיגום. (B) מיקום פתוח למחצה של הלוח הקדמי (כיסוי שקוף) ושל הלוח האחורי (צלחת לבנה המכוסה בקרום מחמצן). הפיגום ממוקם במרכז בין הלוח הקדמי והאחורי. פיגום הגרפן בצבע שחור (C) ממחיש כיצד פיגום ממוקם בתוך כלי השיט ומשמש כתמיכה לתאים להתרבות, להתמיין וליצור רשת סלולרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2. איורים מייצגים של פיגומים שנבדקו במחקר זה. חמישה פיגומים נבדקו עבור מחקרי הביוריאקטורים שלנו, מתוכם מוצגות כאן שתי דוגמאות. (A,B) מייצג את פיגומי הגרפן שנבדקו לצמיחת תאים דמויי אמלובלסט, בעוד ש-(C,D) מייצג את פיגומי הקולגן המוצלחים ביותר עבור מחקרי תרביות התאים מבוססי הביו-ריאקטור שלנו. שימו לב למבנה הנקבובי של פיגומי קולגן (C,D) לעומת המערך המקביל של הבלטות פני השטח בפיגומי גרפן (A,B). (A,C) הם מקרוגרפים שצולמו מנקודת מבט ניצבת ואילו (B,D) צולמו בזווית של 45°. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3. הכנת לולאת צוואר הרחם. מנדיבל העכבר הבוגר בעל השלד ב-A מדגים את אזור הלולאה הצווארית המשמש להכנת גומחת התא לתרבית תאים דמוית אמלובלסט והתמיינות. מקגרוגרף זה ממחיש גם את מיקומם של סמנים אנטומיים, כולל החותך הגדל ברציפות (inc) המשתרע כמעט על כל אורך המנדיבולרי, הטוחנת המנדיבולרית הראשונה (m₁) יחד עם זווית המנדיבולרית, התהליך הקורונואידי ומיקום הקונדיל המנדיבולרי. הכנה זו של השלד משמשת כאוריינטציה אנטומית לאזור לולאת צוואר הרחם המוכן ב-(B). נקודות הייחוס כוללות את העצם המנדיבולרית (מאנד), רקמת הפפילה הדנטלית (DP), זווית המנדיבל (זווית) ומיקום לולאת צוואר הרחם (CL) שממנה נקטפו התאים למחקרי הביוריאקטור האמלובלסטים שלנו. הקו השבור מציין את החלק הקדמי והדיסטלי של החלון המנדיבולרי הפנסטרטיבי המוכן לנתיחת לולאת צוואר הרחם במנדיבל הבוגר בעל השלד (A) ובמנדיבל 6 dpn שזה עתה נותח (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תרשים 4. יצירת תאים דמויי אמלובלסט בגישה של תרבית משותפת תלת-ממדית. (A) התמיינות מוצלחת של תאים דמויי אמלובלסט מתאי לולאה צווארית בתרבית משותפת עם תאי גזע של מוך השן במיקרו-סביבה מתאימה. אוכלוסיית התאים שנוצרה הורכבה מתאים ארוכים, מוארכים ומקוטבים בעלי יכולת להפריש חלבוני מטריצת אמייל. תאים אלה הציגו גרעין בקצה אחד (nucl) ותהליך תאי (proc) הדומה לתהליך טומס כפי שנצפה באמלובלסטים אמיתיים בקצה השני (A). (B) ממחיש אוכלוסייה של תאי קבוצת ביקורת שגם הם היו נתונים לתנאי תרבית משותפת אך עם מדיה נקייה מגורמי גדילה או סוכני התמיינות, וכתוצאה מכך תאים מעוגלים אינם מייצגים אמלובלסטים טיפוסיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5. תרבית תלת-ממדית ארוכת טווח של אוכלוסיית אבות פריודונטליים חד-תאיים (pdl) עם משטחי פיגומים מצופים ולא מצופים. ציפוי פיגום הביא לעלייה בקצב ההתרבות של תאי hPDL בתאים שגודלו בתרבית על הפיגום המצופה גלנין (B) בהשוואה לתאי קבוצת הביקורת שנחשפו לפיגום לא מצופה (A). התאים מקבוצת הניסוי גם הפרישו יותר מטריצה חוץ-תאית המכילה סיבי רקמת חיבור בהשוואה לקבוצת הביקורת (B לעומת A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תרשים 6. תרבית רקמת ריאות בביוריאקטור. (A) מקטעי רקמת ריאה E15 שגודלו בתרבית על קרום ניטרוצלולוז בביוריאקטור במשך עשרה ימים. (B) מקטעי רקמת ריאה E15 הדומים ל-(A) אך נתונים למצבים דלקתיים על-ידי הוספת IL-6 למדיה (B). (C) מקטע פרפין של רקמת ריאה E15 שזה עתה נותחה ומוכתמת ב-H&E. שימו לב לדמיון במורפולוגיות של תאים מסוג I ו-II בעת השוואה בין (A) ו-(C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שלבים קריטיים בפרוטוקול לצמיחת תאים במיקרו-כבידה כוללים את הביוריאקטור, הפיגום, התאים המשמשים לתרבית תלת-ממדית וציפוי הפיגומים כאמצעי להשראת התמיינות תאים. סוג הביוריאקטור המשמש במחקרים שלנו כולל את הביוריאקטור RCCS-4, שינוי שנערך לאחרונה במערכת תרבית התאים הסיבובית המקורית (RCCS) של מתקן תרבית רקמה גלילית מסתובבת שפותח על ידי נאס"א כדי לגדל תאים במיקרו-כבידה מדומה. סביבת RCCS-4 זו מספקת לחצי גזירה נמוכים במיוחד, המשפרים את העברת המסה ומשפרים את ביצועי התרבית. גרסה זו של הביוריאקטור אפשרה שימוש בו זמנית בארבעה כלי שיט לארבעה ניסויים שונים בו זמנית. הביוריאקטור RCCS-4 היה מצויד בכלי דם בעלי יחס גובה-רוחב גבוה (HARV), שהבטיחו תנאי תרבית פשוטים וישרים עם מספר מספיק של תאים למחקרים שלנו.

מרכיב קריטי שני בגישתנו הם הפיגומים שכן הם מספקים תבניות לתאים צפים לחיבור וליצירת מכלולים. בעוד שהשימוש בפיגומים בתרבית דו-ממדית מוגבל בשל היווצרות ליבות נמיות, הדיפוזיה, החמצן וזרימת החומרים המזינים המשופרים בביוריאקטור סיבובי משפרים את תחולתם של פיגומים כנשאים להפצת מכלולי תאים^28,29. במחקר הנוכחי בחנו את יעילותם של חמישה סוגים של פיגומים, פיגומי חומצה פולית (לקטית-קו-גליקולית (PLGA), פיגום קולגן ונקבובי, פיגום גרפן, כמו גם דיסק ג'לטין ודיסק הידרודרוקסיאפטיט. בנוסף, העברנו את הממברנה מסביבת התרבות של איברי הריאה לתוך הביוריאקטור, כאשר מקטע הריאה המתורבת מחובר אליה. מבין אלה, פיגום הקולגן התגלה כפיגום החיובי ביותר במחקרינו, אולי בשל הרכבו הקולגן והמבנה הנקבובי שלו. פיגום ה-PLGA הניב תאים בני קיימא, בעוד ששלושת הפיגומים האחרים היו פחות נוחים בידינו. קרום הניטרוצלולוז של מערכת תרבית איברי הריאה המקורית הוכח כפיגום יעיל נוסף מכיוון שהוא שמר בהצלחה על שלמות הריאה המתורבתת לאחר העברתה לסביבת הביוריאקטור התלת-ממדית.

מרכיב קריטי שלישי באסטרטגיה שלנו הוא סוגי התאים המשמשים לזרע כלי השיט. עבור מחקרי האמלוגנזה שלנו הסתמכנו על תאי לולאה צווארית שהוכנו מחותכי העכברים הגדלים ללא הרף, אשר גודלו בתרבית משותפת עם תאי מוך השן. תאי לולאה צווארית נבחרו כמקור לאברי האמייל המקוריים המתחדשים ברציפות בחותך המכרסמים. חותך העכבר או החולדה הוא מקור יוצא דופן של תאי גזע ותאי אב שממשיכים להתקיים לאורך כל חיי החיה בעוד שתאי איבר האמייל מתחדשים להתפרצות מתמשכת ולאמלוגנזה^23,30. הן תאי אב פריודונטליים והן תאי מוך השן שימשו כמקורות לתאי תרבית. השימוש באוכלוסיות תאי תרבית מזנכימלית לתרבית מוצלחת של תאי אפיתל מבוסס היטב^{על 31,32.} במחקרים שלנו, תאי מוך השן היו יעילים יותר בגרימת התמיינות אמלובלסטים מאשר אבות של רצועות חניכיים למרות שבהתבסס על המאפיינים המזנכימליים שלהם, שניהם מתאימים כמועמדים לתרבית משותפת אודונטוגנית ומזנכימלית. כאשר מיישמים אותם כלפי אמלוגנזה, תאי מוך השן כמקבילה הטבעית לאפיתל אודונטוגני במהלך התפתחות השן עשויים היו לעורר את האינטראקציות האפיתליות-מזנכימליות המתאימות להשראת התמיינות אמלובלסטים סופנית^33,34. עם זאת, לצורך חקר אינטראקציות פיגומים לצורך הנדסת רקמות חניכיים, אבות פריודונטליים התאימו באופן אידיאלי מכיוון שהם מולידים פיברובלסטים של רצועות חניכיים מובחנות לחלוטין^25,35. לבסוף, עבור תרבית של איברי ריאה בסביבת ביוריאקטור, הסתמכנו על מקטעי ריאה עובריים מנותקים. נהלים לתרבית איברי ריאה עובריים במנות תרבית איברים תוארו קודם לכן³⁶ ומספר מודלים של תרביות תאים דו-ממדיות המשלבים תאי אפיתל ריאה עם תאי כלי דם או שריר חלק נחקרו^37,38,39. במחקר הנוכחי, מודל הביוריאקטור התלת-ממדי שמר על רמה איתנה של הפרשת חומרים פעילי שטח תוך שמירה על שלמות הליבה של גוש הרקמה בתרבית, מה שהופך מודל זה למתאים לחקר ההשפעות הסביבתיות על שלמות רקמת הריאה.

ההיבט המשמעותי הרביעי של המודל שלנו הוא יישום של ציפויים ספציפיים מסוג תא על משטחי הפיגומים כדי לגרום להתמיינות תאים דמויי אמלובלסט. באופן ספציפי, רכיבים כגון LRAP ומטריצת אמייל התגלו כגורמים תורמים מרכזיים להתמיינות תאים דמויי אמלובלסט, שכן חוסר ציפוי עם LRAP ומטריצת האמייל הראשונית אסרו על היווצרות תאים מוארכים ומקוטבים. יחד, הציפוי של משטחי פיגומים מספק כלי רב עוצמה לקידום התמיינות ספציפית לרקמות של איברים מורכבים בביוריאקטורים.

ההיבט המשמעותי ביותר של מחקר זה היה היכולת לשחזר את צורת התא המוארכת והמקוטבת הייחודית של אמלובלסטים. תוצאה זו היא יתרון ייחודי של מערכת הביוריאקטור התלת-ממדית על פני המגבלות של מערכות תרבית דו-ממדיות שעיגלו מאוד תאים נגזרים של אמייל-איבר. תוצאה זו מספקת עדות נוספת לתועלת השימוש בטכנולוגיות ביוריאקטור בעת גידול תאים שאינם תואמים לטכנולוגיות תרבית אחרות⁴⁰. אנו מייחסים את ההצלחה של מחקרי התרבית המשותפת של האמלובלסט למספר תכונות ייחודיות של מערכת הביוריאקטור הסיבובית, כולל אספקה רציפה של חומרים מזינים, גורמי גדילה ושעתוק וחמצן, כמו גם היכולת של תאים בודדים לצבור וליצור אינטראקציות חברתיות בין תאים של שושלות שונות ושלבי התפתחות. בעוד שהמחקרים הצליחו לגדל תאים מוארכים, מקוטבים ואמלוגנין המפרישים תאים דמויי אמלובלסט, התאים דמויי האמלובלסט הגדלים כאן נשארים בבידוד, וההמשכיות הטבעית של שורת תאי האמלובלסט אבדה. ביישומים עתידיים, תאים דמויי אמלובלסט הגדלים בטכנולוגיה זו עשויים לשמש ליישומי הנדסת רקמות אמייל או כמודל ניסיוני לספיגת היבטים של אמלוגנזה של השן.

לסיכום, הביוריאקטור התלת-ממדי התגלה כסביבה מוצלחת להתפשטות של תרביות לולאה צווארית/מוך השן לאמלובלסטים, לצמיחת אבות רצועות חניכיים בפיגומים מצופים ולתרבית של איברי ריאה שלמים. בהתבסס על נתונים אלה, טכנולוגיות מבוססות ביוריאקטורים עשויות להתגלות ככלי חשוב להנדסת רקמות מתקדמת או לאסטרטגיות בדיקה בתחומים כגון אמייל השן, פריודונטלי וחקר ריאות.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

המחקרים נתמכו בנדיבות על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי (UG3-DE028869 ו-R01-DE027930).