Propagación de células y órganos dentales y respiratorios en microgravedad

Este protocolo presenta un método para el cultivo y crecimiento 3D de células similares a ameloblastos en microgravedad para mantener su forma alargada y polarizada, así como la expresión de proteínas específicas del esmalte. También se describen las condiciones de cultivo para el cultivo de construcciones de ingeniería periodontal y órganos pulmonares en microgravedad.

La gravedad es uno de los determinantes clave de la función celular humana, la proliferación, la arquitectura citoesquelética y la orientación. Los sistemas de biorreactores rotativos (RCCS) imitan la pérdida de gravedad a medida que ocurre en el espacio y, en cambio, proporcionan un entorno de microgravedad a través de la rotación continua de células o tejidos cultivados. Estos RCCS aseguran un suministro ininterrumpido de nutrientes, factores de crecimiento y transcripción, y oxígeno, y abordan algunas de las deficiencias de las fuerzas gravitacionales en placas de cultivo de células u órganos 2D (bidimensionales) inmóviles. En el presente estudio hemos utilizado CCR para cocultivar células del asa cervical y células de la pulpa dental para que se conviertan en ameloblastos, para caracterizar las interacciones progenitor/andamio periodontal y para determinar el efecto de la inflamación sobre los alvéolos pulmonares. Los entornos de RCCS facilitaron el crecimiento de células similares a los ameloblastos, promovieron la proliferación de progenitores periodontales en respuesta a los recubrimientos de andamios y permitieron una evaluación de los efectos de los cambios inflamatorios en los alvéolos pulmonares cultivados. Este manuscrito resume las condiciones ambientales, los materiales y los pasos a lo largo del camino y destaca los aspectos críticos y los detalles experimentales. En conclusión, los RCCS son herramientas innovadoras para dominar el cultivo y el crecimiento 3D (tridimensional) de células in vitro y para permitir el estudio de sistemas celulares o interacciones no susceptibles a entornos de cultivo 2D clásicos.

La gravedad afecta todos los aspectos de la vida en la Tierra, incluida la biología de las células individuales y su función dentro de los organismos. Las células detectan la gravedad a través de mecanorreceptores y responden a los cambios en la gravedad reconfigurando las arquitecturas citoesqueléticas y alterando la división celular ^1,2,3. Otros efectos de la microgravedad incluyen la presión hidrostática en vesículas llenas de fluido, la sedimentación de orgánulos y la convección impulsada por flotabilidad del flujo y el calor⁴. Los estudios sobre el efecto de la pérdida de gravedad en las células y órganos humanos se realizaron originalmente para simular el entorno ingrávido del espacio en astronautas durante misiones de vuelo espacial⁵. Sin embargo, en los últimos años, estas tecnologías de biorreactores 3D desarrolladas originalmente por la NASA para simular la microgravedad se están volviendo cada vez más relevantes como enfoques novedosos para el cultivo de poblaciones celulares que de otro modo no serían susceptibles a los sistemas de cultivo 2D.

Los biorreactores 3D simulan la microgravedad haciendo crecer células en suspensión y creando así un efecto constante de "caída libre". Otras ventajas de los biorreactores rotativos incluyen la falta de exposición al aire que se encuentra en los sistemas de cultivo de órganos, una reducción en el esfuerzo cortante y la turbulencia, y una exposición continua a un suministro cambiante de nutrientes. Estas condiciones dinámicas proporcionadas por un biorreactor del Sistema de Cultivo Celular Rotatorio (RCCS) favorecen la colocalización espacial y el ensamblaje tridimensional de células individuales en agregados ^6,7.

Estudios previos han demostrado las ventajas de un biorreactor rotatorio para la regeneración ósea⁸, el cultivo de gérmenes dentales⁹ y para el cultivo de células del folículo dental humano¹⁰. También ha habido un informe que sugiere que el CCR mejora la proliferación y diferenciación de células EOE en ameloblastos¹¹. Sin embargo, las células diferenciadas fueron consideradas ameloblastos basadas en la inmunofluorescencia de ameloblastina y/o expresión de amelogenina sola¹¹ sin considerar su morfología alargada o forma celular polarizada.

Además del biorreactor de vasos de pared giratoria (RWV) desarrollado por la NASA, otras tecnologías para generar agregados 3D a partir de células incluyen la levitación magnética, la máquina de posicionamiento aleatorio (RPM) y el clinostat¹². Para lograr la levitación magnética, las células marcadas con nanopartículas magnéticas son levitadas utilizando una fuerza magnética externa, lo que resulta en la formación de estructuras 3D sin andamios que se han utilizado para la biofabricación de estructuras de adipocitos^13,14,15. Otro enfoque para simular la microgravedad es la generación de fuerzas G multidireccionales mediante el control de la rotación simultánea alrededor de dos ejes, lo que resulta en una cancelación del vector de gravedad acumulativo en el centro de un dispositivo llamado clinostat¹⁶. Cuando las células madre de la médula ósea se cultivaron en un clinostato, se inhibió la formación de hueso nuevo a través de la supresión de la diferenciación de osteoblastos, ilustrando uno de los efectos desdiferenciadores de la microgravedad¹⁶.

Los sistemas in vitro para facilitar el cultivo fiel de ameloblastos proporcionarían un gran paso adelante hacia la ingeniería del tejido del esmalte dental¹⁷. Desafortunadamente, hasta la fecha, el cultivo de los ameloblastos ha sido una tarea desafiante^18,19. Hasta ahora, se han reportado cinco líneas celulares diferentes similares a los ameloblastos, incluida la línea celular de linaje de ameloblastos de ratón (ALC), la línea celular epitelial dental de rata (HAT-7), la línea celular LS8 de ratón 20, la línea celular porcina PABSo-E²¹ y la línea celular²² de SF2-24 de rata. Sin embargo, la mayoría de estas células han perdido su forma distintiva de células polarizadas en el cultivo 2D.

En el presente estudio hemos recurrido a un sistema de biorreactor de cultivo celular rotatorio (RCCS) para facilitar el crecimiento de células similares a ameloblastos a partir de epitelios de asa cervical cocultivados con progenitores mesenquimales y para superar los desafíos de los sistemas de cultivo 2D, incluido el flujo reducido de nutrientes y los cambios citoesqueléticos debido a la gravedad. Además, el RCCS ha proporcionado nuevas vías para el estudio de las interacciones célula/andamio relacionadas con la ingeniería del tejido periodontal y para examinar los efectos de los mediadores inflamatorios en los tejidos alveolares pulmonares in vitro. En conjunto, los resultados de estos estudios destacan los beneficios de los sistemas de cultivo rotatorio basados en microgravedad para la propagación de epitelios diferenciados y para la evaluación de los efectos ambientales en las células cultivadas in vitro, incluidas las interacciones célula/andamio y la respuesta tisular a las afecciones inflamatorias.

Se obtuvo toda la aprobación institucional necesaria para garantizar que el estudio cumpliera con las pautas institucionales de cuidado animal de TAMU.

1. Montaje y esterilización del biorreactor

1. Esterilice cuatro recipientes de alta relación de aspecto (HARV) para el biorreactor en un autoclave en el ciclo del instrumento de plástico durante 20 minutos a 121 °C según lo recomendado por el fabricante.
2. Después de la esterilización, ensamble los recipientes en una campana de cultivo celular apretando los tornillos provistos con el biorreactor, después de lo cual los recipientes están listos para usar.

2. Andamios utilizados para el experimento de cocultivo del biorreactor

1. Incubar los andamios junto con las células para proporcionar soporte para la unión celular necesaria para un mayor crecimiento.
2. Elija entre andamios basados en PGA, andamios de hidroxiapatita, láminas de grafeno, discos de gelatina y andamios a base de colágeno para estudios de cocultivo.

3. Disección del asa cervical (CL) y preparación de una sola célula

1. Sacrificar ratones por decapitación después de un paro respiratorio por sobredosis de_CO2 .
   NOTA: Todos los estudios en animales cumplen con las pautas institucionales de cuidado animal de TAMU.
2. Diseccionar los bucles cervicales de ratones postnatales (DPN) de 6 días siguiendo una versión modificada de un protocolo²³ publicado previamente.
   NOTA: En nuestro estudio, se incluye la porción distal del asa cervical no mostrada en el protocolo publicado anteriormente (Figura 3).
   1. Lavar el tejido disecado con PBS estéril en frío antes de la digestión con colagenasa dispasa a 37 °C durante 30 minutos.
3. Pasar la solución a través de un filtro de células estéril de 70 μm y centrifugar a 800 x g durante 10 minutos.
4. Deseche el sobrenadante. Centrifugar el pellet y lavar dos veces con PBS frío a 800 x g. Deseche el sobrenadante.
5. Contar las células con un hemocitómetro y añadir 1 X 10⁵ células por vaso.

4. Cultivo celular de la pulpa dental y expansión de la línea celular

1. Placas de células de la pulpa dental en una placa de cultivo tisular de 100 mm en el paso 4 a una concentración de 1 x 10⁵.
2. Preparar los medios para el cultivo que consiste en medios de glucosa alta en DMEM, suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibióticos/antimicóticos (P/S).
3. Cuando las células alcancen el 85-90% de confluencia, aspire el medio y lave las placas dos veces con PBS precalentado.
4. Después del lavado de PBS, agregue una solución precalentada de tripsina-EDTA al 0,25% a la placa e incube las placas que contienen células de la pulpa dental a 37 °C durante 3 minutos.
5. Confirme el desprendimiento de células mediante inspección visual con un microscopio.
6. Recoger el medio junto con las células de la placa de cultivo y transferir a través de una pipeta de 25 ml a un tubo cónico estéril de 50 ml.
7. Centrifugar las células a 800 x g durante 8 minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en medios frescos y contar con un hemocitómetro.
8. Para el cocultivo con células del asa cervical, sembrar las células de la pulpa dental en el biorreactor a una concentración de 1 x 10⁴ por vaso.

5. Cocultivo de células del asa cervical/pulpa dental en un andamio dentro del biorreactor RCCS

1. Agregue ambos tipos de células, el asa cervical y la pulpa dental al medio de cultivo que contiene medios SFM de queratinocitos con factores de crecimiento suplementados, proteínas de matriz extracelular y andamios.
   NOTA: Los factores de crecimiento se añaden a una concentración de 0,03 μg/ml de proteína morfogenética ósea 2 (BMP 2), 0,03 μg/ml de proteína morfogenética ósea 4 (BMP-4), 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos recombinantes humanos (hFGF) y 15 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (hEGF), mientras que los componentes de la ECM incluyeron 200 μg/ml de Matrigel, 5 μg/ml de laminina y 5 μg/ml de fibronectina.
2. Recubra los andamios con una mezcla de 500 μL de gel de colágeno enriquecido con 1 mg de péptido LRAP (péptido de amelogenina rico en leucina), 1 mg de matriz de esmalte liofilizada en etapa temprana preparada a partir de dientes porcinos²⁴, 5 μg / ml de laminina y 5 μg / ml de fibronectina.
   NOTA: Esto funcionó mejor para nuestros experimentos.
3. Después del recubrimiento del andamio, agregue ambas células y el andamio al biorreactor y llene el biorreactor con 10 ml de medio por recipiente.
4. Cierre la tapa del puerto de llenado del recipiente del biorreactor después de agregar medios, celdas y andamios.
5. Conecte las válvulas estériles a los puertos de la jeringa al comienzo del experimento y manténgalas en su lugar con una cubierta hasta el final del experimento.
6. Una vez que el recipiente esté lleno al 90% y las tapas del puerto de llenado estén cerradas y apretadas, abra las válvulas estériles.
7. Use dos jeringas estériles (3 ml) cada vez que se requiera un cambio de medio. Llene una jeringa con medio fresco mientras la otra jeringa se deja vacía.
8. Abra ambas válvulas de jeringa y maniobra suavemente las burbujas hacia el puerto vacío de la jeringa.
9. Una vez que el medio fresco de la jeringa llena se inyecta cuidadosamente en el recipiente, retire las burbujas a través del puerto vacío de la jeringa.
   NOTA: Este procedimiento se realiza hasta que se eliminan todas las microburbujas de los vasos.
10. Cierre los puertos de la jeringa con tapas y deseche las jeringas en un contenedor de residuos de objetos punzantes.
11. Acople cada vaso a la base del rotador y coloque la base del rotador en una incubadora con un 5% de_CO2 y una temperatura de 37 °C.
12. Encienda la alimentación y ajuste la velocidad de rotación a 10,1 rpm.
    NOTA: Ajuste la velocidad para asegurarse de que los andamios estén en suspensión sin tocar la pared del recipiente.
13. Para el cambio de medios, coloque los vasos en posición vertical para asegurarse de que las células se asienten en la parte inferior. Abra los puertos de la jeringa y conecte las jeringas estériles a los puertos.
14. Siga el mismo procedimiento aspirando el 75% del medio agotado en nutrientes e inyectando medio fresco a través del otro puerto.

6. Preparación de órganos pulmonares y cultivo basado en biorreactores

NOTA: Se utilizaron crías de ratón de tipo salvaje E15 para la preparación de órganos pulmonares.

1. Diseccionar el tejido pulmonar después de la eutanasia de una ratona hembra embarazada con asfixia por_CO2 .
   1. Una vez confirmada la muerte tras asfixia por luxación cervical, utilizar un bisturí para exponer la cavidad torácica. A partir de entonces, retire a los cachorros del útero y eutanasia por decapitación.
2. Después de la eutanasia, prepare la cavidad torácica abriéndola con un bisturí para localizar los pulmones. Lave pequeños segmentos de tejido pulmonar con PBS estéril y colóquelo en una membrana preesterilizada durante 2 horas con medio de cultivo de órganos en una incubadora que contenga 5% de_CO2 y 37 °C de temperatura.
3. Una vez que los tejidos pulmonares se adhieren a la membrana en una placa de cultivo de órganos 2D, transfiera las muestras al recipiente del biorreactor.
4. Preparar los medios de comunicación para la cultura.
   NOTA: El medio de control DMEM de alta glucosa contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), solución antibiótica al 1% (P/S) (penicilina, 100 U/mL, estreptomicina, 50 μg/mL) y 100 μg/mL de ácido ascórbico (AA) y para la inducción de afecciones inflamatorias, el medio control se complementa con 5 ng/mL de proteína IL-6.
5. Llevar a cabo el experimento de cultivo pulmonar durante 10 días con un cambio de medios cada 48 horas en el biorreactor como se describió anteriormente.

7. Andamio recubierto con cultivo celular del ligamento periodontal humano (hPDL)

1. Cultivar células del ligamento periodontal humano.
   NOTA: Las células se aíslan y se cultivan en nuestro laboratorio según el protocolo publicado anteriormente²⁵.
2. Cubra los discos de andamio de colágeno con 30 μL de PBS para el grupo control y el neuropéptido galanina (GAL) a una concentración de ^10-8 durante la noche.
3. Sembrar células PDL humanas en el andamio de control y recubierto de GAL durante 2 horas a 37 °C en una placa de cultivo, y transferir los andamios sembrados de células a un recipiente de biorreactor como se mencionó anteriormente.
4. Cultive los andamios sembrados por células durante 14 días en el biorreactor antes de cosechar los andamios para su análisis.

8. Limpieza y mantenimiento del biorreactor

1. Después de que los andamios/células se hayan cosechado del biorreactor, retire los puertos de la jeringa del recipiente.
   NOTA: Los tornillos alrededor de los recipientes se retiran y el recipiente se lava suavemente con agua jabonosa.
2. Enjuague los recipientes con agua limpia y apriete los tornillos una vez más.
3. Guarde los recipientes después del autoclave hasta el próximo uso.

La cámara interior del biorreactor proporciona un entorno para que las células proliferen y se diferencien, se adhieran a un andamio o se congreguen para formar tejidos como ensamblajes. Cada vaso HARV contiene hasta 10 ml de medio y facilita una circulación constante de nutrientes para que cada célula tenga una excelente oportunidad de sobrevivir. La Figura 1A ilustra la fijación de los puertos de la jeringa a la placa frontal del recipiente donde se conectan las válvulas estériles de una sola parada. Estas válvulas actúan como porteros de la cámara de cultivo. El cambio de medio requiere que la válvula de llave de cierre se abra para facilitar la fijación de una jeringa estéril que contenga medio fresco. El entorno de microgravedad dentro del biorreactor permite que las células se adhieran al andamio dentro del recipiente sin necesidad de siembra previa en los andamios. El andamio (Figura 1B y 1C) colocado en el biorreactor gira continuamente, lo que permite que las células se adhieran a las superficies del andamio y formen redes citoesqueléticas. La membrana oxigenadora en la parte inferior de la placa del vaso (Figura 1B) permite el intercambio continuo de gases para mejorar la supervivencia celular y la longevidad.

Se probaron varios andamios para identificar el andamio más compatible con las células. El andamio en las figuras 2A y 2B es una lámina de grafeno compuesta de 75% de grafeno y 25% de PLG (glicólido poliláctico). Este andamio eléctricamente conductor se utiliza con frecuencia para células que pueden requerir estimulación eléctrica, como las células del músculo esquelético²⁶. En nuestros estudios, el andamio de colágeno superó a todos los demás estudios probados en términos de biocompatibilidad, promoción del crecimiento tisular y diferenciación celular. La superficie porosa especializada de este andamio a base de colágeno (Figura 2C y 2D) permite que las células y los nutrientes fluyan a través del andamio, aumentando el área de unión celular y la proliferación celular.

La posición del asa cervical en relación con la mandíbula del ratón se ilustra en las figuras 3A y 3B. Para preparar las células del asa cervical incisiva del ratón, se diseccionó una mandíbula de ratón esqueletizada y se expuso la porción más distal del incisivo inferior del ratón. La posición precisa del asa cervical resecada se demarca en el incisivo postnatal del ratón de 6 días (Figura 3B), mientras que una región similar en una mandíbula de ratón esqueletizada adulta se proporciona como referencia en la Figura 3A con fines de orientación. El área del asa cervical correspondiente en el adulto esqueletizado (Figura 3A) y el incisivo de ratón recién preparado de 6 dpn está enmarcada por dos líneas discontinuas (Figura 3A y B). La dentición de las hemimandíbulas está compuesta por tres molares mandibulares y un incisivo en continuo crecimiento, mientras que el nicho celular del asa cervical está compuesto por una población celular mixta involucrada en la formación del esmalte, como el epitelio interno del esmalte, el epitelio externo del esmalte, el retículo estrellado y el estrato intermedium¹⁹.

La Figura 4 se centra en la diferenciación exitosa de las células del asa cervical en células alargadas, polarizadas, secretoras de proteínas del esmalte que secretan ameloblastos. Los datos revelaron que la diferenciación exitosa de células alargadas, polarizadas y secretoras de proteínas del esmalte similares a los ameloblastos requiere el cultivo conjunto de las células del asa cervical con células madre mesenquimales como las células madre de la pulpa dental. A las células cultivadas se les proporcionó un microambiente adaptado como se describe en el paso 3 del protocolo, lo que resultó en la formación de células polarizadas con el núcleo en un extremo y un proceso celular largo en el otro²⁷, una característica típica de los ameloblastos (Figura 4A). La aplicación de medios solos y sin factores de crecimiento y/o recubrimiento de andamio dio como resultado células de asa cervical que secretaron proteínas clave del esmalte pero no se alargaron ni polarizaron (Figura 4B).

Los andamios de colágeno recubiertos de galanina y no recubiertos se colocaron en un biorreactor con células hPDL durante catorce días en un biorreactor. Las células sobrevivieron a un período de cultivo de dos semanas en el sistema de cultivo 3D y el grupo de andamio recubierto de galanina demostró una tasa de proliferación significativamente mayor (Figura 5B) en comparación con el grupo de control que contenía andamios no recubiertos (Figura 5A). Las células en el grupo experimental también demostraron un nivel significativamente mayor de matriz extracelular que contiene fibras de tejido conectivo en comparación con el control.

El entorno del biorreactor demostró ser exitoso para el crecimiento de segmentos pulmonares en un entorno de microgravedad 3D (Figura 6). Para este estudio, los segmentos de tejido pulmonar cosechados de ratones E15 (Figura 6C) se colocaron en una membrana de nitrocelulosa en una placa de cultivo de órganos durante dos horas. Después de la unión inicial del tejido a la membrana, el compuesto de tejido pulmonar / membrana nitrocelular se colocó en el recipiente del biorreactor y se cultivó con éxito durante 10 días (Figura 6A). Para estudiar los efectos de las afecciones inflamatorias en el crecimiento del tejido pulmonar, la adición de IL-6 al medio de cultivo dio lugar a cambios típicos asociados a la inflamación en la morfología alveolar similares a los observados in vivo (Figura 6B).

Figura 1. Componentes de un recipiente de biorreactor. La Figura 1 ilustra los componentes clave de un recipiente de biorreactor y su posición en una etapa previa al ensamblaje. (A) Posición relativa de la cámara del reactor, los puertos de la jeringa y el andamio. (B) Posición semiabierta de la placa frontal (cubierta transparente) y la placa posterior (placa blanca cubierta por membrana oxigenadora). El andamio se coloca en el centro entre la placa delantera y trasera. El andamio de grafeno de color negro (C) ilustra cómo se coloca un andamio dentro del vaso y se utiliza como soporte para que las células proliferen, se diferencien y formen una red celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Ilustraciones representativas de andamios probados en este estudio. Se probaron cinco andamios para nuestros estudios de biorreactores, de los cuales se presentan dos ejemplos aquí. (A, B) representa el andamio de grafeno probado para el crecimiento celular similar al ameloblasto, mientras que (C, D) representa el andamio de colágeno más exitoso para nuestros estudios de cultivo celular basados en biorreactores. Tenga en cuenta la estructura porosa del andamio de colágeno (C, D) frente a la matriz paralela de relieves superficiales en el andamio de grafeno (A, B). (A, C) son macrografías tomadas desde una perspectiva perpendicular, mientras que (B, D) fueron fotografiadas en un ángulo de 45 °. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Preparación del asa cervical. La mandíbula esqueletizada del ratón adulto en A demuestra la región del asa cervical utilizada para preparar el nicho celular para el cultivo y diferenciación celular similar al ameloblasto. Este macrógrafo también ilustra la posición de los marcadores anatómicos, incluido el incisivo en continuo crecimiento (inc) que abarca casi toda la longitud mandibular, el primer molar mandibular (m₁) junto con el ángulo de la mandíbula, el proceso coronoides y la posición del cóndilo mandibular. Esta preparación esquelética sirve como una orientación anatómica para la región del asa cervical preparada en (B). Los puntos de referencia incluyen el hueso mandibular (mand), el tejido de la papila dental (DP), el ángulo de la mandíbula (Angle) y la posición del asa cervical (CL) de la que se recolectaron las células para nuestros estudios de biorreactores de ameloblas. La línea quebrada indica la porción anterior y distal de la ventana mandibular fenestrada preparada para la disección del asa cervical en la mandíbula adulta esqueletizada (A) y en la mandíbula recién diseccionada de 6 dpn (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Generación de células similares a ameloblastos mediante un enfoque de cocultivo 3D. (A) Diferenciación exitosa de células similares a ameloblastos de células de asa cervical cocultivadas con células madre de la pulpa dental en un microambiente adecuado. La población celular resultante estaba compuesta por células largas, alargadas y polarizadas con la capacidad de secretar proteínas de la matriz del esmalte. Estas células presentaban un núcleo en un extremo (nucl) y un proceso celular (proc) que se asemejaba al proceso Tomes como se observa en los verdaderos ameloblastos en el otro extremo (A). (B) ilustra una población de células del grupo control que también fueron sometidas a condiciones de cocultivo pero con medios libres de factores de crecimiento o agentes de diferenciación, lo que resulta en células redondeadas no representativas de los ameloblastos típicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Cultivo 3D a largo plazo de una población de progenitores periodontales unicelulares (pdl) con superficies de andamio recubiertas y no recubiertas. El recubrimiento del andamio dio lugar a un aumento en la tasa de proliferación celular de hPDL en las células cultivadas en el andamio recubierto de galanina (B) en comparación con las células del grupo control expuestas a un andamio no recubierto (A). Las células del grupo experimental también secretaron más matriz extracelular que contiene fibras de tejido conectivo en comparación con el grupo de control (B versus A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Cultivo de tejido pulmonar en un biorreactor. (A) Segmentos de tejido pulmonar E15 cultivados en una membrana de nitrocelulosa en un biorreactor durante diez días. (B) E15 segmentos de tejido pulmonar similares a (A) pero sometidos a condiciones inflamatorias mediante la adición de IL-6 a los medios (B). (C) Sección de parafina de un tejido pulmonar E15 recién diseccionado teñido con H&E. Tenga en cuenta las similitudes en las morfologías de las células alveolares tipo I y tipo II al comparar (A) y (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los pasos críticos del protocolo para el crecimiento de células en microgravedad incluyen el biorreactor, el andamio, las células utilizadas para el cultivo 3D y el recubrimiento de andamio como medio para inducir la diferenciación celular. El tipo de biorreactor utilizado en nuestros estudios comprende el biorreactor RCCS-4, una modificación reciente del dispositivo de cultivo de tejido cilíndrico giratorio original del Sistema de Cultivo de Células Rotativas (RCCS) desarrollado por la NASA para cultivar células en microgravedad simulada. Este entorno RCCS-4 proporciona tensiones de cizallamiento extremadamente bajas, lo que mejora la transferencia de masa y mejora el rendimiento del cultivo. Esta versión del biorreactor permitió el uso simultáneo de cuatro recipientes para cuatro experimentos diferentes al mismo tiempo. El biorreactor RCCS-4 estaba equipado con recipientes de alta relación de aspecto (HARV), lo que garantizaba condiciones de cultivo simples y directas con un número suficiente de células para nuestros estudios.

Un segundo componente crítico de nuestro enfoque son los andamios, ya que proporcionan plantillas para que las celdas flotantes se unan y formen ensamblajes. Mientras que el uso de andamios en el cultivo 2D es limitado debido a la formación de núcleos necróticos, la difusión mejorada, el flujo de oxígeno y nutrientes en un biorreactor rotativo mejora la aplicabilidad de los andamios como portadores para la propagación de conjuntos celulares^28,29. En el presente estudio exploramos la eficacia de cinco tipos de andamios, los andamios de ácido poli(láctico-co-glicólico (PLGA), un andamio colágeno y poroso, un andamio de grafeno, así como un disco de gelatina y un disco de hidrodroxiapatita. Además, transferimos la membrana del entorno de precultivo del órgano pulmonar al biorreactor, con el segmento pulmonar cultivado unido a él. Entre estos, el andamio de colágeno surgió como el andamio más favorable en nuestros estudios, posiblemente debido a su composición colágena y estructura porosa. El andamio PLGA produjo células viables, mientras que los otros tres andamios fueron menos favorables en nuestras manos. La membrana de nitrocelulosa del sistema original de cultivo de órganos pulmonares demostró ser otro andamio efectivo, ya que mantuvo con éxito la integridad del pulmón cultivado después de la transferencia al entorno del biorreactor 3D.

Un tercer componente crítico de nuestra estrategia son los tipos de células utilizadas para sembrar el recipiente. Para nuestros estudios de amelogénesis nos basamos en células de asa cervical preparadas a partir de incisivos de ratón de crecimiento continuo que fueron cocultivados con células de la pulpa dental. Las células del asa cervical se eligieron como la fuente de los progenitores originales del órgano del esmalte que se renuevan continuamente en el incisivo de roedores. El incisivo de ratón o rata es una fuente notable de células madre y progenitoras que continúa existiendo durante toda la vida del animal, mientras que las células del órgano del esmalte se reponen para la erupción continua y la amelogénesis^23,30. Tanto las células progenitoras periodontales como las células de la pulpa dental se utilizaron como fuentes de cocultivo celular. El uso de poblaciones celulares mesenquimales de cocultivo para el cultivo exitoso de células epiteliales está bien establecido^31,32. En nuestros estudios, las células de la pulpa dental fueron más efectivas para inducir la diferenciación del ameloblasto que los progenitores del ligamento periodontal, aunque en función de sus características mesenquimales, ambos son adecuados como candidatos odontogénicos y mesenquimales de cocultivo. Cuando se aplica a la amelogénesis, las células de la pulpa dental como contraparte natural del epitelio odontogénico durante el desarrollo del diente podrían haber desencadenado las interacciones epitelial-mesenquimales apropiadas adecuadas para la inducción de la diferenciación terminal del ameloblasto^33,34. Sin embargo, para el estudio de las interacciones de andamios para la ingeniería de tejidos periodontales, los progenitores periodontales fueron ideales, ya que dan lugar a fibroblastos del ligamento periodontal completamente diferenciados^25,35. Finalmente, para el cultivo de órganos pulmonares en un entorno de biorreactor, nos basamos en segmentos pulmonares murinos embrionarios disecados. Los procedimientos para cultivar órganos pulmonares embrionarios en placas de cultivo de órganos se han descrito anteriormente³⁶ y se han explorado varios modelos de cultivo celular bidimensional que combinan células epiteliales pulmonares con células vasculares o de músculo liso^37,38,39. En el presente estudio, el modelo de biorreactor 3D mantuvo un nivel robusto de secreción de surfactante al tiempo que preservó la integridad del núcleo del bloque de tejido cultivado, lo que hace que este modelo sea adecuado para el estudio de los efectos ambientales sobre la integridad del tejido pulmonar.

El cuarto aspecto significativo de nuestro modelo es la aplicación de recubrimientos específicos de tipo celular en las superficies del andamio para desencadenar la diferenciación celular similar a un amelobás. Específicamente, componentes como LRAP y matriz de esmalte surgieron como factores clave que contribuyeron a la diferenciación celular similar a los ameloblastos, ya que la falta de recubrimiento con LRAP y la matriz inicial del esmalte prohibieron la formación de células alargadas y polarizadas. En conjunto, el recubrimiento de las superficies de los andamios proporciona una poderosa herramienta para promover la diferenciación específica del tejido de órganos complejos en biorreactores.

El aspecto más significativo de este estudio fue la capacidad de restaurar la distintiva forma celular alargada y polarizada de los ameloblastos. Este resultado es un beneficio único del sistema de biorreactor 3D sobre las limitaciones de los sistemas de cultivo 2D que redondean las células derivadas de órganos de esmalte. Este resultado proporciona evidencia adicional del beneficio del uso de tecnologías de biorreactores cuando se cultivan células incompatibles con otras tecnologías de cultivo⁴⁰. Atribuimos el éxito de los estudios de cocultivo de ameloblasto a varios atributos únicos del sistema de biorreactor rotatorio, incluido el suministro continuo de nutrientes, factores de crecimiento y transcripción y oxígeno, así como la capacidad de las células individuales para agregar y formar interacciones sociales entre células de diversos linajes y etapas de desarrollo. Si bien los estudios lograron cultivar células alargadas, polarizadas y secretoras de amelogenina similares a los ameloblastos, las células similares a los ameloblastos cultivadas aquí permanecen aisladas y se perdió la continuidad natural de la fila de células del ameloblástico. En aplicaciones futuras, las células similares a los ameloblastos cultivadas con esta tecnología podrían usarse para aplicaciones de ingeniería de tejidos del esmalte o como un modelo experimental para recapitular aspectos de la amelogénesis dental.

En conclusión, el biorreactor 3D surgió como un ambiente exitoso para la propagación de cocultivos de asa cervical / pulpa dental en ameloblastos, para el crecimiento de progenitores del ligamento periodontal en andamios recubiertos y para el cultivo de órganos pulmonares completos. Sobre la base de estos datos, es probable que las tecnologías basadas en biorreactores surjan como vehículos importantes para la ingeniería avanzada de tejidos o estrategias de prueba en áreas como el esmalte dental, la periodontal y la investigación pulmonar.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Los estudios fueron generosamente apoyados por subvenciones del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (UG3-DE028869 y R01-DE027930).