Vermehrung von Zahn- und Atmungszellen und -organen in Schwerelosigkeit

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die Kultur und das 3D-Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen in Schwerelosigkeit vor, um ihre längliche und polarisierte Form sowie die schmelzspezifische Proteinexpression zu erhalten. Auch Kulturbedingungen für die Kultur von parodontalen Engineering-Konstrukten und Lungenorganen in Schwerelosigkeit werden beschrieben.

Die Schwerkraft ist eine der Schlüsseldeterminanten der menschlichen Zellfunktion, Proliferation, Zytoskelettarchitektur und Orientierung. Rotationsbioreaktorsysteme (RCCSs) ahmen den Verlust der Schwerkraft nach, wie er im Weltraum auftritt, und bieten stattdessen eine Mikrogravitationsumgebung durch kontinuierliche Rotation von kultivierten Zellen oder Geweben. Diese RCCSs gewährleisten eine ununterbrochene Versorgung mit Nährstoffen, Wachstums- und Transkriptionsfaktoren sowie Sauerstoff und beheben einige der Mängel der Gravitationskräfte in bewegungslosen 2D-Zell- oder Organkulturschalen. In der vorliegenden Studie haben wir RCCSs verwendet, um zervikale Schleifenzellen und Zahnpulpazellen zu Ameloblasten zu kokulturieren, parodontale Vorläufer-Gerüst-Interaktionen zu charakterisieren und die Wirkung von Entzündungen auf Lungenbläschen zu bestimmen. Die RCCS-Umgebungen erleichterten das Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen, förderten die parodontale Vorläuferproliferation als Reaktion auf Gerüstbeschichtungen und ermöglichten eine Bewertung der Auswirkungen entzündlicher Veränderungen auf kultivierte Lungenbläschen. Dieses Manuskript fasst die Umweltbedingungen, Materialien und Schritte auf dem Weg zusammen und hebt kritische Aspekte und experimentelle Details hervor. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass RCCSs innovative Werkzeuge sind, um die Kultur und das (dreidimensionale) 3D-Wachstum von Zellen in vitro zu beherrschen und die Untersuchung zellulärer Systeme oder Interaktionen zu ermöglichen, die klassischen 2D-Kulturumgebungen nicht zugänglich sind.

Die Schwerkraft beeinflusst alle Aspekte des Lebens auf der Erde, einschließlich der Biologie einzelner Zellen und ihrer Funktion innerhalb von Organismen. Zellen spüren die Schwerkraft durch Mechanorezeptoren und reagieren auf Änderungen der Schwerkraft, indem sie Zytoskelettarchitekturen neu konfigurieren und die Zellteilung^{verändern 1,2,3}. Weitere Effekte der Schwerelosigkeit sind der hydrostatische Druck in flüssigkeitsgefüllten Vesikel, die Sedimentation von Organellen und die auftriebsgetriebene Konvektion von Strömung und Wärme⁴. Studien über die Auswirkungen des Gewichtsverlusts auf menschliche Zellen und Organe wurden ursprünglich durchgeführt, um die schwerelose Umgebung des Weltraums auf Astronauten während Raumflugmissionen zu simulieren⁵. In den letzten Jahren werden diese ursprünglich von der NASA entwickelten 3D-Bioreaktortechnologien zur Simulation der Schwerelosigkeit jedoch als neuartige Ansätze für die Kultur von Zellpopulationen, die sonst nicht für 2D-Kultursysteme zugänglich sind, immer relevanter.

3D-Bioreaktoren simulieren die Schwerelosigkeit, indem sie Zellen in Suspension züchten und so einen konstanten "Freifall"-Effekt erzeugen. Weitere Vorteile der rotierenden Bioreaktoren sind die fehlende Luftexposition in Organkultursystemen, eine Verringerung von Scherspannungen und Turbulenzen sowie eine kontinuierliche Exposition gegenüber einer sich ändernden Nährstoffversorgung. Diese dynamischen Bedingungen, die von einem Rotary Cell Culture System (RCCS) Bioreaktor bereitgestellt werden, begünstigen die räumliche Kolokalisierung und dreidimensionale Assemblierung einzelner Zellen zu Aggregaten ^6,7.

Frühere Studien haben die Vorteile eines rotierenden Bioreaktors für die Knochenregeneration⁸, Zahnkeimkultur⁹ und für die Kultur menschlicher Zahnfollikelzellen¹⁰ gezeigt. Es gibt auch einen Bericht, der darauf hindeutet, dass RCCS die Proliferation und Differenzierung von EOE-Zellen in Ameloblasten verbessert¹¹. Differenzierte Zellen wurden jedoch als Ameloblasten betrachtet, die auf Ameloblastin-Immunfluoreszenz und/oder Amelogenin-Expression allein¹¹ basierten, ohne ihre längliche Morphologie oder polarisierte Zellform zu berücksichtigen.

Neben dem von der NASA entwickelten Bioreaktor Rotating Wall Vessels (RWV) gehören zu den weiteren Technologien zur Erzeugung von 3D-Aggregaten aus Zellen die Magnetschwebebahn, die Zufallspositioniermaschine (RPM) und der Klinostat¹². Um eine Magnetschwebebahn zu erreichen, werden Zellen, die mit magnetischen Nanopartikeln markiert sind, mit einer externen Magnetkraft schweben, was zur Bildung von gerüstfreien 3D-Strukturen führt, die für die Biofabrikation von Adipozytenstrukturen verwendet wurden^13,14,15. Ein weiterer Ansatz zur Simulation der Schwerelosigkeit ist die Erzeugung multidirektionaler G-Kräfte durch Steuerung der gleichzeitigen Rotation um zwei Achsen, was zu einer Aufhebung des kumulativen Schwerevektors im Zentrum eines Geräts namens Clinostat¹⁶ führt. Wenn Knochenmarkstammzellen in einem Klinostat kultiviert wurden, wurde die Knochenneubildung durch die Unterdrückung der Osteoblastendifferenzierung gehemmt, was eine der dedifferenzierenden Effekte der Mikrogravitation veranschaulicht¹⁶.

In-vitro-Systeme, die die getreue Kultur von Ameloblasten erleichtern, würden einen großen Schritt in Richtung Zahnschmelz-Tissue Engineering darstellen¹⁷. Leider war die Kultur der Ameloblasten bis heute ein herausforderndes Unterfangen^18,19. Bisher wurden fünf verschiedene Ameloblasten-ähnliche Zelllinien beschrieben, darunter die Maus-Ameloblasten-Linien-Zelllinie (ALC), die Ratten-Zahnepithelzelllinie (HAT-7), die Maus-LS8-Zelllinie²⁰, die porcine PABSo-E-Zelllinie 21 und die Ratten-SF2-24-Zelllinie²². Die Mehrheit dieser Zellen hat jedoch ihre charakteristische polarisierte Zellform in 2D-Kultur verloren.

In der vorliegenden Studie haben wir uns einem Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) zugewandt, um das Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen aus zervikalen Schleifenepithelien zu erleichtern, die mit mesenchymalen Vorläuferzellen kokultiviert wurden, und um die Herausforderungen von 2D-Kultursystemen zu überwinden, einschließlich reduziertem Nährstofffluss und zytoskelettalen Veränderungen aufgrund der Schwerkraft. Darüber hinaus hat das RCCS neue Wege für die Untersuchung von Zell-Gerüst-Interaktionen im Zusammenhang mit parodontalen Tissue Engineering und zur Untersuchung der Auswirkungen von Entzündungsmediatoren auf Lungenalveolargewebe in vitro eröffnet. Zusammen unterstreichen die Ergebnisse dieser Studien die Vorteile von Mikrogravitations-basierten rotatorischen Kultursystemen für die Ausbreitung differenzierter Epithelien und für die Bewertung von Umweltauswirkungen auf in vitro gezüchtete Zellen, einschließlich Zell-Gerüst-Interaktionen und der Gewebereaktion auf entzündliche Zustände.

Es wurden alle erforderlichen institutionellen Genehmigungen eingeholt, um sicherzustellen, dass die Studie den TAMU-Richtlinien für die institutionelle Tierhaltung entspricht.

1. Aufbau und Sterilisation von Bioreaktoren

1. Sterilisieren Sie vier Gefäße mit hohem Aspektverhältnis (HARV) für den Bioreaktor in einem Autoklaven im Kunststoff-Instrumentenzyklus für 20 Minuten bei 121 °C, wie vom Hersteller empfohlen.
2. Nach der Sterilisation montieren Sie die Gefäße in einer Zellkulturhaube, indem Sie die mit dem Bioreaktor gelieferten Schrauben anziehen, wonach die Gefäße einsatzbereit sind.

2. Gerüste für das Bioreaktor-Kokulturexperiment

1. Inkubieren Sie die Gerüste zusammen mit den Zellen, um die Zellanhaftung zu unterstützen, die für weiteres Wachstum notwendig ist.
2. Wählen Sie zwischen PGA-basierten Gerüsten, Hydroxylapatit-Gerüsten, Graphenplatten, Gelatinescheiben und Kollagen-basierten Gerüsten für Kokulturstudien.

3. Zervikale Schleife (CL) Dissektion und Einzelzellpräparation

1. Mäuse durch Enthauptung nach Atemstillstand durch CO₂ -Überdosierung opfern.
   HINWEIS: Alle Tierversuche entsprechen den Richtlinien der TAMU für die institutionelle Tierpflege.
2. Zervikale Schleifen von 6 Tagen postnatalen (DPN) Mäusen nach einer modifizierten Version eines zuvor veröffentlichten Protokolls²³.
   HINWEIS: In unserer Studie ist der distale Teil der Zervixschleife enthalten, der nicht im zuvor veröffentlichten Protokoll gezeigt wurde (Abbildung 3).
   1. Waschen Sie das sezierte Gewebe vor der Verdauung mit kaltem sterilem PBS bei 37 °C für 30 Minuten.
3. Die Lösung durch ein 70 μm steriles Zellsieb geben und 10 Minuten lang bei 800 x g weiter zentrifugieren.
4. Verwerfen Sie den Überstand. Zentrifugieren Sie das Pellet und waschen Sie es zweimal mit kaltem PBS bei 800 x g. Verwerfen Sie den Überstand.
5. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und fügen Sie 1 X 10⁵ Zellen pro Gefäß hinzu.

4. Zellkultur und Zelllinienexpansion der Zahnpulpa

1. Platte Zahnpulpazellen in einer 100 mm Gewebekulturplatte bei Durchgang 4 in einer Konzentration von 1 x 10⁵.
2. Bereiten Sie Medien für die Kultur vor, die aus DMEM-Medien mit hohem Glukosegehalt bestehen, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum / Antimykotikum (P / S).
3. Wenn die Zellen einen Zusammenfluss von 85-90% erreicht haben, saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Platten zweimal mit vorgewärmtem PBS.
4. Nach dem PBS-Waschen eine vorgewärmte 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung auf die Platte geben und die zellhaltigen Platten der Zahnpulpa bei 37 °C für 3 Minuten inkubieren.
5. Bestätigen Sie die Zellablösung durch visuelle Inspektion mit einem Mikroskop.
6. Sammeln Sie das Medium zusammen mit den Zellen von der Kulturplatte und übertragen Sie es über eine 25-ml-Pipette in ein 50-ml-steriles konisches Röhrchen.
7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g für 8 Minuten und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in frischen Medien und zählen Sie mit einem Hämozytometer.
8. Für die Kokultur mit Zervixschleifenzellen säen die Zahnpulpazellen im Bioreaktor in einer Konzentration von 1 x 10⁴ pro Gefäß.

5. Kokultur von Zervixschleifen-/Zahnpulpazellen auf einem Gerüst im RCCS-Bioreaktor

1. Fügen Sie beide Zelltypen, die Zervixschleife und die Zahnpulpa, dem Kulturmedium hinzu, das Keratinozyten-SFM-Medien mit ergänzten Wachstumsfaktoren, extrazellulären Matrixproteinen und Gerüsten enthält.
   HINWEIS: Wachstumsfaktoren werden in einer Konzentration von 0,03 μg/ml Knochenmorphogenetisches Protein 2 (BMP 2), 0,03 μg/ml Knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP-4), 10 ng/ml humaner rekombinanter Fibroblastenwachstumsfaktor (hFGF) und 15 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (hEGF) hinzugefügt, während ECM-Komponenten 200 μg/ml Matrigel, 5 μg/ml Laminin und 5 μg/ml Fibronektin umfassten.
2. Beschichten Sie Gerüste mit einer Mischung aus 500 μL Kollagengel, angereichert mit 1 mg LRAP (Leucin-reiches Amelogeninpeptid) Peptid, 1 mg lyophilisierter Schmelzmatrix im Frühstadium, hergestellt aus Schweinezähnen²⁴, 5 μg / ml Laminin und 5 μg / ml Fibronektin.
   HINWEIS: Dies funktionierte am besten für unsere Experimente.
3. Nach der Gerüstbeschichtung fügen Sie dem Bioreaktor sowohl Zellen als auch Gerüst hinzu und füllen den Bioreaktor mit 10 ml Medium pro Gefäß.
4. Schließen Sie die Kappe des Füllanschlusses des Bioreaktorbehälters nach Zugabe von Medien, Zellen und Gerüsten.
5. Befestigen Sie die sterilen Ventile zu Beginn des Experiments an den Spritzenöffnungen und halten Sie sie bis zum Ende des Experiments mit einer Abdeckung an Ort und Stelle.
6. Sobald der Behälter zu 90% gefüllt ist und die Kappen der Einfüllöffnungen geschlossen und festgezogen sind, öffnen Sie die sterilen Ventile.
7. Verwenden Sie zwei sterile Spritzen (3 ml) jedes Mal, wenn ein Medienwechsel erforderlich ist. Füllen Sie eine Spritze mit frischem Medium, während die andere Spritze leer bleibt.
8. Öffnen Sie beide Spritzenventile und manövrieren Sie die Blasen vorsichtig in Richtung der leeren Spritzenöffnung.
9. Sobald das frische Medium aus der vollen Spritze vorsichtig in das Gefäß injiziert wurde, entfernen Sie die Blasen durch den leeren Spritzenanschluss.
   HINWEIS: Dieser Vorgang wird durchgeführt, bis alle Mikrobläschen aus den Gefäßen entfernt sind.
10. Schließen Sie die Spritzenöffnungen mit Kappen und entsorgen Sie die Spritzen in einem scharfen Abfallbehälter.
11. Befestigen Sie jedes Gefäß am Rotatorenboden und legen Sie den Rotatorenboden in einen Inkubator mit einer Temperatur von 5% CO₂ und 37 °C.
12. Schalten Sie das Gerät ein und stellen Sie die Drehzahl auf 10,1 U/min ein.
    HINWEIS: Stellen Sie die Geschwindigkeit ein, um sicherzustellen, dass die Gerüste in der Schwebe sind, ohne die Behälterwand zu berühren.
13. Stellen Sie die Gefäße für den Medienwechsel in eine aufrechte Position, um sicherzustellen, dass sich die Zellen am Boden absetzen. Öffnen Sie die Spritzenöffnungen und verbinden Sie die sterilen Spritzen mit den Öffnungen.
14. Befolgen Sie das gleiche Verfahren, indem Sie 75% des nährstoffarmen Mediums absaugen und frisches Medium durch den anderen Anschluss injizieren.

6. Lungenorganpräparation und Bioreaktor-basierte Kultur

HINWEIS: E15-Wildtyp-Mauswelpen wurden zur Vorbereitung von Lungenorganen verwendet.

1. Sezieren Sie das Lungengewebe nach dem Einschläfern einer trächtigen weiblichen Maus mit CO₂ -Erstickung.
   1. Sobald der Tod nach Erstickung durch zervikale Dislokation bestätigt ist, verwenden Sie ein Skalpell, um die Brusthöhle freizulegen. Danach entfernen Sie die Welpen aus der Gebärmutter und euthanasieren durch Enthauptung.
2. Bereiten Sie nach der Euthanasierung die Brusthöhle vor, indem Sie sie mit einem Skalpell öffnen, um die Lunge zu lokalisieren. Winzige Abschnitte des Lungengewebes mit sterilem PBS waschen und 2 Stunden lang mit Organkulturmedium in einem Inkubator mit 5% CO₂ und 37 °C Temperatur auf eine vorsterilisierte Membran legen.
3. Sobald sich das Lungengewebe an der Membran in einer 2D-Organkulturplatte festsetzt, werden die Proben in das Bioreaktorgefäß überführt.
4. Bereiten Sie die Medien auf die Kultur vor.
   HINWEIS: Das Kontroll-DMEM-Hochglukosemedium enthält 10% fötales Rinderserum (FBS), 1% Antibiotikalösung (P / S) (Penicillin, 100 U / ml, Streptomycin, 50 μg / ml) und 100 μg / ml Ascorbinsäure (AA) und für die Induktion von entzündlichen Zuständen wird das Kontrollmedium mit 5 ng / ml IL-6-Protein ergänzt.
5. Führen Sie das Lungenkulturexperiment für 10 Tage mit einem Medienwechsel alle 48 Stunden im Bioreaktor wie oben beschrieben durch.

7. Beschichtetes Gerüst mit humaner Parodontalbandzellkultur (hPDL)

1. Kultur menschlicher Parodontalbandzellen.
   HINWEIS: Die Zellen werden in unserem Labor gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll²⁵ isoliert und kultiviert.
2. Beschichten Sie die Kollagengerüstscheiben mit 30 μL PBS für die Kontrollgruppe und dem Neuropeptid Galanin (GAL) in einer Konzentration von ^10-8 über Nacht.
3. Säen Sie menschliche PDL-Zellen auf dem Kontroll- und GAL-beschichteten Gerüst für 2 Stunden bei 37 °C in einer Kulturplatte aus und übertragen Sie die gesäten Gerüste in ein Bioreaktorgefäß, wie oben erwähnt.
4. Kultur der Zellgerüste für 14 Tage im Bioreaktor, bevor die Gerüste zur Analyse geerntet werden.

8. Reinigung und Wartung von Bioreaktoren

1. Nachdem die Gerüste/Zellen aus dem Bioreaktor entnommen wurden, entfernen Sie die Spritzenöffnungen aus dem Behälter.
   HINWEIS: Die Schrauben um die Gefäße werden entfernt und das Gefäß wird vorsichtig mit Seifenwasser gewaschen.
2. Spülen Sie die Gefäße mit klarem Wasser ab und ziehen Sie die Schrauben erneut fest.
3. Lagern Sie die Gefäße nach dem Autoklavieren bis zur nächsten Verwendung.

Die innere Kammer des Bioreaktors bietet eine Umgebung für die Zellen, um sich zu vermehren und zu differenzieren, sich an einem Gerüst zu befestigen oder sich zu versammeln, um gewebeähnliche Anordnungen zu bilden. Jedes HALV-Gefäß fasst bis zu 10 ml Medium und ermöglicht eine konstante Zirkulation von Nährstoffen, so dass jede Zelle eine ausgezeichnete Überlebenschance hat. Abbildung 1A zeigt die Befestigung der Spritzenöffnungen an der Frontplatte des Behälters, an der sterile Einstoppventile angebracht sind. Diese Ventile fungieren als Türhüter zur Kulturkammer. Der Mediumwechsel erfordert das Öffnen des Absperrhahnventils, um die Befestigung einer sterilen Spritze mit frischem Medium zu erleichtern. Die Mikrogravitationsumgebung innerhalb des Bioreaktors ermöglicht es den Zellen, sich an das Gerüst innerhalb des Gefäßes zu heften, ohne dass zuvor auf die Gerüste gesät werden muss. Das im Bioreaktor platzierte Gerüst (Abbildung 1B und 1C) dreht sich kontinuierlich, so dass sich Zellen an Gerüstoberflächen anheften und Zytoskelettnetzwerke bilden können. Die Oxygenatormembran am Boden der Gefäßplatte (Abbildung 1B) ermöglicht einen kontinuierlichen Gasaustausch, um das Überleben und die Langlebigkeit der Zellen zu verbessern.

Verschiedene Gerüste wurden getestet, um das Gerüst zu identifizieren, das am besten mit den Zellen kompatibel ist. Das Gerüst in Abbildung 2A und 2B ist eine Graphenschicht, die zu 75% aus Graphen und zu 25% aus PLG (Polymilchglycolid) besteht. Dieses elektrisch leitfähige Gerüst wird häufig für Zellen verwendet, die eine elektrische Stimulation benötigen, wie z. B. Skelettmuskelzellen²⁶. In unseren Studien übertraf das Kollagengerüst alle anderen getesteten Studien in Bezug auf Biokompatibilität, Förderung des Gewebewachstums und zelluläre Differenzierung. Die spezialisierte poröse Oberfläche dieses kollagenbasierten Gerüsts (Abbildung 2C und 2D) ermöglicht es den Zellen und Nährstoffen, durch das Gerüst zu fließen, wodurch der Bereich der Zellanheftung und Zellproliferation vergrößert wird.

Die Position der Zervixschleife in Bezug auf den Mausunterkiefer ist in Abbildung 3A und 3B dargestellt. Um die Zervixschlingenzellen des Mausschneidezahns vorzubereiten, wurde ein skelettierter Mausunterkiefer seziert und der distalste Teil des unteren Mausschneidezahns freigelegt. Die genaue Position der resezierten Zervikalschleife ist im 6-tägigen postnatalen Mausschneidezahn abgegrenzt (Abbildung 3B), während eine ähnliche Region in einem erwachsenen skelettierten Mausunterkiefer in Abbildung 3A als Referenz für Orientierungszwecke angegeben ist. Der Bereich der entsprechenden Zervixschlinge im erwachsenen Skelett (Abbildung 3A) und dem 6 dpn frisch präparierten Mausschneidezahn wird von zwei gestrichelten Linien eingerahmt (Abbildung 3A und B). Das Gebiss der Hemimanibeln besteht aus drei Unterkiefermolaren und einem kontinuierlich wachsenden Schneidezahn, während die zervikale Schleifenzellnische aus einer gemischten Zellpopulation besteht, die an der Schmelzbildung beteiligt ist, wie dem inneren Schmelzepithel, dem äußeren Schmelzepithel, dem Sternretikulum und dem Stratum intermedium¹⁹.

Abbildung 4 konzentriert sich auf die erfolgreiche Differenzierung der zervikalen Schleifenzellen in längliche, polarisierte, Schmelzprotein-sezernierende Ameloblasten-ähnliche Zellen. Die Daten zeigten, dass eine erfolgreiche Differenzierung von länglichen, polarisierten, Schmelzprotein-sezernierenden Ameloblasten-ähnlichen Zellen die Co-Kultur der zervikalen Schleifenzellen mit mesenchymalen Stammzellen wie Zahnpulpa-Stammzellen erfordert. Kultivierte Zellen erhielten eine maßgeschneiderte Mikroumgebung, wie in Schritt 3 des Protokolls beschrieben, was zur Bildung polarisierter Zellen mit dem Kern an einem Ende und einem langen zellulären Prozess am anderen^{Ende 27} führte, ein typisches Merkmal von Ameloblasten (Abbildung 4A). Das alleinige Auftragen von Medien und ohne Wachstumsfaktoren und/oder Gerüstbeschichtung führte zu zervikalen Schleifenzellen, die wichtige Schmelzproteine absonderten, sich aber nicht verlängerten oder polarisierten (Abbildung 4B).

Galaninbeschichtete und unbeschichtete Kollagengerüste wurden für vierzehn Tage in einen Bioreaktor mit hPDL-Zellen in einem Bioreaktor platziert. Die Zellen überlebten eine zweiwöchige Kulturperiode im 3D-Kultursystem und die Galanin-beschichtete Gerüstgruppe zeigte eine signifikant höhere Proliferationsrate (Abbildung 5B) im Vergleich zur Kontrollgruppe mit unbeschichteten Gerüsten (Abbildung 5A). Die Zellen in der Versuchsgruppe zeigten auch einen signifikant höheren Gehalt an extrazellulärer Matrix, die Bindegewebsfasern enthielt, im Vergleich zur Kontrolle.

Die Bioreaktorumgebung erwies sich als erfolgreich für das Wachstum von Lungensegmenten in einer 3D-Mikrogravitationsumgebung (Abbildung 6). Für diese Studie wurden Lungengewebesegmente, die von E15-Mäusen entnommen wurden (Abbildung 6C), für zwei Stunden auf eine Nitrozellulosemembran in einer Organkulturschale gelegt. Nach der anfänglichen Gewebebefestigung an der Membran wurde das Lungengewebe/Nitrozellulärmembran-Komposit in das Bioreaktorgefäß eingebracht und 10 Tage lang erfolgreich kultiviert (Abbildung 6A). Um die Auswirkungen von Entzündungszuständen auf das Wachstum von Lungengewebe zu untersuchen, führte die Zugabe von IL-6 zum Kulturmedium zu typischen entzündungsassoziierten Veränderungen der Alveolarmorphologie, ähnlich denen, die in vivo beobachtet wurden (Abbildung 6B).

Abbildung 1. Bestandteile eines Bioreaktorbehälters. Abbildung 1 zeigt Schlüsselkomponenten eines Bioreaktorbehälters und ihre Position in einer Vormontagephase. (A) Relative Lage der Reaktorkammer, der Spritzenöffnungen und des Gerüsts. (B) Halboffene Position der vorderen Platte (durchsichtige Abdeckung) und der hinteren Platte (weiße Platte, die von einer Oxygenatormembran bedeckt ist). Das Gerüst befindet sich in der Mitte zwischen Vorder- und Rückplatte. Das schwarz gefärbte Graphengerüst (C) veranschaulicht, wie ein Gerüst im Gefäß platziert und als Unterstützung für die Zellen verwendet wird, um sich zu vermehren, zu differenzieren und ein zelluläres Netzwerk zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2. Repräsentative Abbildungen von Gerüsten, die in dieser Studie getestet wurden. Für unsere Bioreaktorstudien wurden fünf Gerüste getestet, von denen hier zwei Beispiele vorgestellt werden. (A,B) stellen das Graphengerüst dar, das auf Ameloblasten-ähnliches Zellwachstum getestet wurde, während (C,D) das Kollagengerüst darstellt, das für unsere Bioreaktor-basierten Zellkulturstudien am erfolgreichsten ist. Beachten Sie die poröse Struktur des Kollagengerüsts (C, D) im Vergleich zu der parallelen Anordnung von Oberflächenprägungen im Graphengerüst (A, B). (A,C) sind Makrographen, die aus einer senkrechten Perspektive aufgenommen wurden, während (B,D) in einem Winkel von 45° aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3. Zervikale Schleifenvorbereitung. Der skelettierte erwachsene Mausunterkiefer in A zeigt die zervikale Schleifenregion, mit der die Zellnische für eine ameloblastenartige Zellkultur und -differenzierung vorbereitet wird. Dieses Makrodiagramm veranschaulicht auch die Position anatomischer Marker, einschließlich des kontinuierlich wachsenden Schneidezahns (Inc), der fast die gesamte Unterkieferlänge umfasst, des ersten Unterkiefermolaren (m₁) zusammen mit dem Winkel des Unterkiefers, dem Koronoidfortsatz und der Position des Unterkieferkondylus. Dieses Skelettpräparat dient als anatomische Orientierung für die in (B) präparierte Zervixschleifenregion. Referenzpunkte sind der Unterkieferknochen (mand), das Zahnpapillengewebe (DP), der Winkel des Unterkiefers (Angle) und die Position der Zervixschleife (CL), aus der die Zellen für unsere Ameloblasten-Bioreaktorstudien gewonnen wurden. Die gestrichelte Linie zeigt den vorderen und distalen Teil des fenestrierten Unterkieferfensters an, der für die Zervixschleifendissektion im skelettierten erwachsenen Unterkiefer (A) und im 6 dpn frisch sezierten Unterkiefer (B) vorbereitet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4. Erzeugung von Ameloblasten-ähnlichen Zellen mittels 3D-Kokulturansatz. (A) Erfolgreiche Differenzierung von Ameloblasten-ähnlichen Zellen aus Zervixschleifenzellen, die mit Zahnpulpa-Stammzellen in einer geeigneten Mikroumgebung kokultiviert wurden. Die resultierende Zellpopulation bestand aus langen, länglichen, polarisierten Zellen mit der Fähigkeit, Schmelzmatrixproteine zu sezernieren. Diese Zellen wiesen einen Kern an einem Ende (nucl) und einen zellulären Prozess (proc) auf, der dem Tomes-Prozess ähnelt, wie er in echten Ameloblasten am anderen Ende beobachtet wurde (A). (B) zeigt eine Population von Zellen der Kontrollgruppe, die ebenfalls Kokulturbedingungen ausgesetzt wurden, jedoch mit Medien, die frei von Wachstumsfaktoren oder Differenzierungsmitteln waren, was zu abgerundeten Zellen führte, die für typische Ameloblasten nicht repräsentativ sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5. Langzeit-3D-Kultur einer einzelligen parodontalen Vorläuferpopulation (pdl) mit beschichteten und unbeschichteten Gerüstoberflächen. Die Gerüstbeschichtung führte zu einer Erhöhung der hPDL-Zellproliferationsrate in Zellen, die auf dem galaninbeschichteten Gerüst kultiviert wurden (B), im Vergleich zu den Zellen der Kontrollgruppe, die einem nicht beschichteten Gerüst (A) ausgesetzt waren. Die Zellen aus der Versuchsgruppe sezernierten auch mehr extrazelluläre Matrix mit Bindegewebsfasern im Vergleich zur Kontrollgruppe (B versus A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6. Lungengewebekultur in einem Bioreaktor. (A) E15-Lungengewebesegmente, die zehn Tage lang auf einer Nitrozellulosemembran in einem Bioreaktor kultiviert wurden. (B) E15-Lungengewebesegmente, die (A) ähneln, aber entzündlichen Zuständen ausgesetzt sind, indem IL-6 zu den Medien hinzugefügt wird (B). (C) Paraffinschnitt eines frisch sezierten E15-Lungengewebes, das mit H&E gefärbt wurde. Beachten Sie beim Vergleich von (A) und (C) Ähnlichkeiten in alveolären Zellmorphologien vom Typ I und Typ II. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Kritische Schritte des Protokolls für das Wachstum von Zellen in Schwerelosigkeit umfassen den Bioreaktor, das Gerüst, die für die 3D-Kultur verwendeten Zellen und die Gerüstbeschichtung als Mittel zur Induktion der Zelldifferenzierung. Der in unseren Studien verwendete Bioreaktortyp umfasst den RCCS-4-Bioreaktor, eine neue Modifikation des ursprünglichen rotierenden zylindrischen Gewebekulturgeräts Rotary Cell Culture System (RCCS), das von der NASA entwickelt wurde, um Zellen in simulierter Schwerelosigkeit zu züchten. Diese RCCS-4-Umgebung bietet extrem niedrige Scherspannungen, was den Stoffaustausch verbessert und die Kulturleistung verbessert. Diese Version des Bioreaktors ermöglichte die gleichzeitige Nutzung von vier Gefäßen für vier verschiedene Experimente. Der RCCS-4-Bioreaktor war mit HARV-Gefäßen (High Aspect Ratio) ausgestattet, die einfache und unkomplizierte Kulturbedingungen mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen für unsere Studien gewährleisteten.

Eine zweite kritische Komponente unseres Ansatzes sind die Gerüste, da sie Vorlagen für schwimmende Zellen zum Befestigen und Formen von Baugruppen bieten. Während die Verwendung von Gerüsten in der 2D-Kultur aufgrund der Bildung nekrotischer Kerne begrenzt ist, verbessert der verbesserte Diffusions-, Sauerstoff- und Nährstofffluss in einem rotierenden Bioreaktor die Anwendbarkeit von Gerüsten als Träger für die Vermehrung von Zellanordnungen^28,29. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirksamkeit von fünf Arten von Gerüsten, den Poly(lactic-co-glycolic acid (PLGA)-Gerüsten, einem kollagenen und porösen Gerüst, einem Graphengerüst sowie einer Gelatinescheibe und einer Hydrodroxyapatitscheibe. Darüber hinaus haben wir die Membran aus der Vorkulturumgebung des Lungenorgans in den Bioreaktor übertragen, wobei das kultivierte Lungensegment daran befestigt ist. Unter diesen erwies sich das Kollagengerüst als das günstigste Gerüst in unseren Studien, möglicherweise aufgrund seiner kollagenen Zusammensetzung und porösen Struktur. Das PLGA-Gerüst ergab lebensfähige Zellen, während die anderen drei Gerüste in unseren Händen weniger günstig waren. Die Nitrozellulosemembran des ursprünglichen Lungenorgankultursystems erwies sich als ein weiteres effektives Gerüst, da sie die Integrität der kultivierten Lunge nach dem Transfer in die 3D-Bioreaktorumgebung erfolgreich aufrechterhielt.

Eine dritte kritische Komponente unserer Strategie sind die Arten von Zellen, die zur Aussaat des Gefäßes verwendet werden. Für unsere Amelogenese-Studien stützten wir uns auf zervikale Schleifenzellen, die aus den kontinuierlich wachsenden Mausschneidezähnen hergestellt und mit Zahnpulpazellen kokultiviert wurden. Zervikale Schleifenzellen wurden als Quelle der ursprünglichen Vorläuferzellen des Schmelzorgans ausgewählt, die im Nagetierschneidezahn kontinuierlich erneuert werden. Der Maus- oder Rattenschneidezahn ist eine bemerkenswerte Quelle von Stamm- und Vorläuferzellen, die während des gesamten Lebens des Tieres existieren, während die Zellen des Schmelzorgans für kontinuierliche Eruption und Amelogenese aufgefüllt werden^23,30. Sowohl parodontale Vorläuferzellen als auch Zahnpulpazellen wurden als Kokulturzellquellen verwendet. Die Verwendung von mesenchymalen Kokulturzellpopulationen für die erfolgreiche Kultur von Epithelzellen ist gut etabliert^31,32. In unseren Studien waren Zahnpulpazellen effektiver bei der Induktion der Ameloblastendifferenzierung als parodontale Bandvorläufer, obwohl beide aufgrund ihrer mesenchymalen Eigenschaften als odontogene und mesenchymale Kokulturkandidaten geeignet sind. Bei Anwendung auf die Amelogenese könnten Zahnpulpazellen als natürliches Gegenstück zum odontogenen Epithel während der Zahnentwicklung die entsprechenden epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen ausgelöst haben, die für die Induktion der terminalen Ameloblastendifferenzierung geeignet sind^33,34. Für die Untersuchung von Gerüstinteraktionen für das parodontale Tissue Engineering waren parodontale Vorläuferzellen jedoch ideal geeignet, da sie zu vollständig differenzierten parodontalen Bandfibroblasten führen^25,35. Schließlich verließen wir uns für die Kultur von Lungenorganen in einer Bioreaktorumgebung auf sezierte embryonale murine Lungensegmente. Verfahren zur Kultur embryonaler Lungenorgane in Organkulturschalen wurden bereits früher beschrieben³⁶ und eine Reihe von zweidimensionalen Zellkulturmodellen, die Lungenepithelzellen mit vaskulären oder glatten Muskelzellen kombinieren, wurden untersucht^37,38,39. In der vorliegenden Studie hielt das 3D-Bioreaktormodell ein robustes Niveau der Tensidsekretion aufrecht und bewahrte gleichzeitig die Integrität des Kerns des kultivierten Gewebeblocks, wodurch dieses Modell für die Untersuchung von Umweltauswirkungen auf die Integrität des Lungengewebes geeignet ist.

Der vierte wesentliche Aspekt unseres Modells ist das Aufbringen von zelltypspezifischen Beschichtungen auf die Gerüstoberflächen, um eine ameloblastenartige Zelldifferenzierung auszulösen. Insbesondere Komponenten wie LRAP und Schmelzmatrix erwiesen sich als Schlüsselfaktoren für die Ameloblasten-ähnliche Zelldifferenzierung, da eine fehlende Beschichtung mit LRAP und die anfängliche Schmelzmatrix die Bildung von länglichen und polarisierten Zellen verhinderten. Zusammen bietet die Beschichtung von Gerüstoberflächen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die gewebespezifische Differenzierung komplexer Organe in Bioreaktoren zu fördern.

Der bedeutendste Aspekt dieser Studie war die Fähigkeit, die charakteristische längliche und polarisierte Zellform von Ameloblasten wiederherzustellen. Dieses Ergebnis ist ein einzigartiger Vorteil des 3D-Bioreaktorsystems gegenüber den Einschränkungen von 2D-Kultursystemen, die stark abgerundete Schmelzorgan-Derivatzellen enthalten. Dieses Ergebnis liefert weitere Belege für den Nutzen der Verwendung von Bioreaktortechnologien bei der Kultivierung von Zellen, die mit anderen Kulturtechnologien inkompatibel sind⁴⁰. Wir führen den Erfolg der Ameloblasten-Kokulturstudien auf mehrere einzigartige Eigenschaften des rotatorischen Bioreaktorsystems zurück, einschließlich der kontinuierlichen Versorgung mit Nährstoffen, Wachstums- und Transkriptionsfaktoren und Sauerstoff sowie der Fähigkeit einzelner Zellen, soziale Interaktionen zwischen Zellen verschiedener Linien und Entwicklungsstadien zu aggregieren und zu bilden. Während es den Studien gelangweilte, polarisierte und Amelogenin-sekretierende Ameloblasten-ähnliche Zellen zu züchten, bleiben die hier gezüchteten Ameloblasten-ähnlichen Zellen isoliert und die natürliche Kontinuität der Ameloblasten-Zellreihe ging verloren. In zukünftigen Anwendungen könnten Ameloblasten-ähnliche Zellen, die mit dieser Technologie gezüchtet werden, für Schmelz-Tissue-Engineering-Anwendungen oder als experimentelles Modell verwendet werden, um Aspekte der Zahnamelogenese zu rekapitulieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich der 3D-Bioreaktor als erfolgreiche Umgebung für die Vermehrung von Gebärmutterhalsschleifen-/Zahnpulpa-Kokulturen in Ameloblasten, für das Wachstum parodontaler Bandvorläuferzellen in beschichteten Gerüsten und für die Kultur ganzer Lungenorgane herauskristallisierte. Basierend auf diesen Daten werden sich bioreaktorbasierte Technologien wahrscheinlich als wichtige Vehikel für fortschrittliches Tissue Engineering oder Teststrategien in Bereichen wie Zahnschmelz-, Parodontal- und Lungenforschung herausstellen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Studien wurden großzügig durch Zuschüsse des National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 und R01-DE027930) unterstützt.