انتشار خلايا وأعضاء الأسنان والجهاز التنفسي في الجاذبية الصغرى

يقدم هذا البروتوكول طريقة للثقافة ونمو 3D للخلايا الشبيهة بالأرومة المينائية في الجاذبية الصغرى للحفاظ على شكلها الممدود والمستقطب بالإضافة إلى تعبير البروتين الخاص بالمينا. كما يتم وصف ظروف الثقافة لثقافة التركيبات الهندسية للثة وأعضاء الرئة في الجاذبية الصغرى.

الجاذبية هي واحدة من المحددات الرئيسية لوظيفة الخلية البشرية ، والانتشار ، والبنية الهيكلية الخلوية والتوجه. تحاكي أنظمة المفاعلات الحيوية الدوارة (RCCSs) فقدان الجاذبية عند حدوثه في الفضاء وتوفر بدلا من ذلك بيئة الجاذبية الصغرى من خلال الدوران المستمر للخلايا أو الأنسجة المستزرعة. تضمن هذه RCCSs إمدادا غير منقطع من العناصر الغذائية وعوامل النمو والنسخ والأكسجين ، وتعالج بعض أوجه القصور في قوى الجاذبية في أطباق زراعة الخلايا أو الأعضاء 2D (ثنائية الأبعاد) بلا حراك. في الدراسة الحالية ، استخدمنا RCCSs لمشاركة خلايا حلقة عنق الرحم وخلايا لب الأسنان لتصبح أرومات مينائية ، لتوصيف تفاعلات السلف / السقالة اللثوية ، ولتحديد تأثير الالتهاب على الحويصلات الهوائية الرئوية. سهلت بيئات RCCS نمو الخلايا الشبيهة بالأرومات المينائية ، وعززت تكاثر السلف اللثوي استجابة لطلاء السقالات ، وسمحت بتقييم آثار التغيرات الالتهابية على الحويصلات الهوائية الرئوية المزروعة. تلخص هذه المخطوطة الظروف البيئية والمواد والخطوات على طول الطريق وتسلط الضوء على الجوانب الهامة والتفاصيل التجريبية. في الختام ، RCCSs هي أدوات مبتكرة لإتقان الثقافة والنمو ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للخلايا في المختبر والسماح بدراسة الأنظمة الخلوية أو التفاعلات غير القابلة لبيئات ثقافة 2D الكلاسيكية.

تؤثر الجاذبية على جميع جوانب الحياة على الأرض ، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الفردية ووظيفتها داخل الكائنات الحية. تستشعر الخلايا الجاذبية من خلال المستقبلات الميكانيكية وتستجيب للتغيرات في الجاذبية عن طريق إعادة تكوين البنى الهيكلية الخلوية وتغيير انقسام الخلايا¹،^2،3. تشمل التأثيرات الأخرى للجاذبية الصغرى الضغط الهيدروستاتيكي في الحويصلات المملوءة بالسوائل ، وترسيب العضيات ، والحمل الحراري المدفوع بالطفو للتدفق والحرارة⁴. أجريت دراسات حول تأثير فقدان الجاذبية على الخلايا والأعضاء البشرية في الأصل لمحاكاة بيئة الفضاء عديمة الوزن على رواد الفضاء أثناء بعثات الرحلات الفضائية⁵. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، أصبحت تقنيات المفاعلات الحيوية ثلاثية الأبعاد هذه التي طورتها ناسا في الأصل لمحاكاة الجاذبية الصغرى ذات أهمية متزايدة كنهج جديدة لثقافة مجموعات الخلايا التي لا تكون قابلة لأنظمة الثقافة 2D.

تحاكي المفاعلات الحيوية 3D الجاذبية الصغرى عن طريق نمو الخلايا المعلقة وبالتالي خلق تأثير "السقوط الحر" المستمر. تشمل المزايا الأخرى للمفاعلات الحيوية الدوارة عدم التعرض للهواء الذي تصادفه أنظمة زراعة الأعضاء ، وتقليل إجهاد القص والاضطراب ، والتعرض المستمر لإمدادات متغيرة من العناصر الغذائية. هذه الظروف الديناميكية التي يوفرها المفاعل الحيوي لنظام زراعة الخلايا الدوارة (RCCS) تفضل التوطين المكاني المشترك والتجميع ثلاثي الأبعاد للخلايا المفردة في مجاميع ^6,7.

أظهرت الدراسات السابقة مزايا المفاعل الحيوي الدوار لتجديد العظام⁸ ، وزراعة جرثومة الأسنان⁹ ، ولزراعة خلايا بصيلات الأسنان البشرية¹⁰. كان هناك أيضا تقرير يشير إلى أن RCCS يعزز تكاثر خلايا EOE والتمايز إلى الأرومات المينائية¹¹. ومع ذلك ، تم اعتبار الخلايا المتمايزة أرومات مينائية بناء على التألق المناعي للأميلوبلاستين و / أو تعبير الأميلوجينين وحده¹¹ دون النظر في مورفولوجيتها الممدودة أو شكل الخلية المستقطبة.

بالإضافة إلى المفاعل الحيوي لأوعية الجدار الدوار (RWV) الذي طورته وكالة ناسا ، تشمل التقنيات الأخرى لتوليد مجاميع 3D من الخلايا الرفع المغناطيسي ، وآلة تحديد المواقع العشوائية (RPM) و clinostat¹². لتحقيق الرفع المغناطيسي ، يتم رفع الخلايا الموسومة بجسيمات نانوية مغناطيسية باستخدام قوة مغناطيسية خارجية ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل ثلاثية الأبعاد خالية من السقالات تم استخدامها للتصنيع الحيوي لهياكل الخلايا الشحمية¹³،^14،15. هناك طريقة أخرى لمحاكاة الجاذبية الصغرى وهي توليد قوى G متعددة الاتجاهات عن طريق التحكم في الدوران المتزامن حول محورين مما يؤدي إلى إلغاء متجه الجاذبية التراكمي في مركز جهاز يسمى clinostat¹⁶. عندما تم استزراع الخلايا الجذعية لنخاع العظم في كلينستات ، تم تثبيط تكوين عظام جديدة من خلال قمع تمايز بانيات العظم ، مما يوضح أحد التأثيرات غير المتمايزة للجاذبية الصغرى¹⁶.

من شأن الأنظمة المختبرية لتسهيل الثقافة المخلصة للأرومات المينائية أن توفر خطوة كبيرة إلى الأمام نحو هندسة أنسجة مينا الأسنان¹⁷. لسوء الحظ ، حتى هذا التاريخ ، كانت ثقافة الأرومات المينائية مهمة صعبة^18,19. حتى الآن ، تم الإبلاغ عن خمسة خطوط خلايا مختلفة تشبه الأرومة المينائية ، بما في ذلك خط خلية سلالة الأرومة المينائية للفأر (ALC) ، وخط الخلايا الظهارية لأسنان الفئران (HAT-7) ، وخط خلية الفأر LS8 20 ، وخط خلية PABSo-E الخنازير²¹ وخط خلية الفئران SF2-24²². ومع ذلك ، فقد فقدت غالبية هذه الخلايا شكل الخلية المستقطبة المميزة في ثقافة 2D.

في هذه الدراسة ، لجأنا إلى نظام المفاعل الحيوي لثقافة الخلايا الدوارة (RCCS) لتسهيل نمو الخلايا الشبيهة بالأرومة المينائية من ظهارة عنق الرحم المستزرعة بالاشتراك مع أسلاف اللحمة المتوسطة وللتغلب على تحديات أنظمة الاستزراع 2D ، بما في ذلك انخفاض تدفق العناصر الغذائية والتغيرات الهيكلية الخلوية بسبب الجاذبية. بالإضافة إلى ذلك ، قدمت RCCS طرقا جديدة لدراسة تفاعلات الخلايا / السقالات المتعلقة بهندسة أنسجة اللثة وفحص آثار الوسطاء الالتهابيين على الأنسجة السنخية الرئوية في المختبر. وتسلط نتائج هذه الدراسات مجتمعة الضوء على فوائد نظم الاستزراع الدوار القائمة على الجاذبية الصغرى لتكاثر الظهارة المتمايزة ولتقييم الآثار البيئية على الخلايا المزروعة في المختبر، بما في ذلك تفاعلات الخلايا/السقالات واستجابة الأنسجة للحالات الالتهابية.

تم الحصول على جميع الموافقات المؤسسية اللازمة لضمان امتثال الدراسة للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوان في جامعة تكساس الطبية والصناعية.

1. تجميع المفاعل الحيوي والتعقيم

1. تعقيم أربع أوعية ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية (HARV) للمفاعل الحيوي في الأوتوكلاف على دورة الأدوات البلاستيكية لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
2. بعد التعقيم ، قم بتجميع الأوعية في غطاء زراعة الخلايا عن طريق شد البراغي المزودة بالمفاعل الحيوي وبعد ذلك تكون الأوعية جاهزة للاستخدام.

2. السقالات المستخدمة في تجربة الاستزراع المشترك للمفاعل الحيوي

1. احتضان السقالات مع الخلايا لتوفير الدعم لارتباط الخلية الضروري لمزيد من النمو.
2. اختر من بين السقالات القائمة على PGA ، وسقالات هيدروكسيباتيت ، وألواح الجرافين ، وأقراص الجيلاتين ، والسقالات القائمة على الكولاجين لدراسات الثقافة المشتركة.

3. تشريح حلقة عنق الرحم (CL) وإعداد خلية واحدة

1. التضحية الفئران عن طريق قطع الرأس بعد توقف التنفس عن طريق جرعة زائدة CO₂ .
   ملاحظة: تتوافق جميع الدراسات على الحيوانات مع إرشادات رعاية الحيوانات المؤسسية ل TAMU.
2. تشريح حلقات عنق الرحم من الفئران بعد الولادة لمدة 6 أيام (DPN) باتباع نسخة معدلة من البروتوكول²³ المنشور مسبقا.
   ملاحظة: في دراستنا ، يتم تضمين الجزء البعيد من حلقة عنق الرحم غير الموضح في البروتوكول المنشور مسبقا (الشكل 3).
   1. اغسل المنديل الذي تم تشريحه باستخدام PBS المعقم البارد قبل الهضم باستخدام كولاجيناز ديسباز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. مرر المحلول من خلال مصفاة خلية معقمة 70 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي إضافي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق.
4. تخلص من المادة الطافية. الطرد المركزي بيليه وغسل مرتين مع PBS الباردة في 800 × غرام. تخلص من المادة الطافية.
5. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وأضف 1 × 10⁵ خلايا لكل وعاء.

4. زراعة خلايا لب الأسنان وتوسيع خط الخلية

1. خلايا لب الأسنان الصفيحة في صفيحة زراعة الأنسجة 100 مم عند الممر 4 بتركيز 1 × 10⁵.
2. تحضير الوسائط للمزرعة التي تتكون من وسائط DMEM عالية الجلوكوز ، مكملة ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ مضاد حيوي / مضاد حيوي (P / S).
3. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 85-90٪ ، استنشق الوسط واغسل الألواح مرتين باستخدام PBS الذي تم تسخينه مسبقا.
4. بعد غسل PBS ، أضف محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.25٪ إلى اللوحة ، واحتضن الألواح المحتوية على خلايا لب الأسنان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
5. تأكد من انفصال الخلية عن طريق الفحص البصري باستخدام المجهر.
6. اجمع الوسائط مع الخلايا من لوحة الاستزراع وانقلها عبر ماصة سعة 25 مل إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
7. الطرد المركزي للخلايا في 800 × غرام لمدة 8 دقائق وتجاهل طاف . أعد تعليق الخلايا في وسائط جديدة وعد باستخدام مقياس الدم.
8. للاستزراع المشترك مع خلايا حلقة عنق الرحم ، قم بزرع خلايا لب الأسنان في المفاعل الحيوي بتركيز 1 × 10⁴ لكل وعاء.

5. الاستزراع المشترك لخلايا عنق الرحم / لب الأسنان على سقالة داخل المفاعل الحيوي RCCS

1. أضف كلا النوعين من الخلايا ، وحلقة عنق الرحم ، ولب الأسنان إلى وسط المزرعة الذي يحتوي على وسائط SFM للخلايا الكيراتينية مع عوامل نمو مكملة وبروتينات مصفوفة خارج الخلية وسقالات.
   ملاحظة: تضاف عوامل النمو بتركيز 0.03 ميكروغرام/مل من البروتين المورفوجيني العظمي 2 (BMP 2)، و0.03 ميكروغرام/مل من البروتين المورفوجيني العظمي 4 (BMP-4)، و10 نانوغرام/مل من عامل نمو الخلايا الليفية البشرية المؤتلفة (hFGF)، و15 نانوغرام/مل من عامل نمو البشرة (hEGF)، في حين شملت مكونات ECM 200 ميكروغرام/مل من ماتريجيل، و5 ميكروغرام/مل من اللامينين و5 ميكروغرام/مل من الفبرونيكتين.
2. قم بتغطية السقالات بمزيج من 500 ميكرولتر من هلام الكولاجين المخصب ب 1 مجم من ببتيد LRAP (ببتيد أميلوجينين الغني بالليوسين) ، 1 مجم من مصفوفة المينا المبكرة المجففة بالتجميد المحضرة من أسنان الخنازير²⁴ ، 5 ميكروغرام / مل لامينين و 5 ميكروغرام / مل من الفبرونيكتين.
   ملاحظة: كان هذا أفضل ما في تجاربنا.
3. بعد طلاء السقالة ، أضف كل من الخلايا والسقالة إلى المفاعل الحيوي ، واملأ المفاعل الحيوي بوسط 10 مل لكل وعاء.
4. أغلق غطاء منفذ التعبئة لوعاء المفاعل الحيوي بعد إضافة الوسائط والخلايا والسقالات.
5. قم بتوصيل الصمامات المعقمة بمنافذ المحاقن في بداية التجربة واحتفظ بها في مكانها بغطاء حتى نهاية التجربة.
6. بمجرد امتلاء الوعاء بنسبة 90٪ وإغلاق أغطية منفذ التعبئة وتشديدها ، افتح الصمامات المعقمة.
7. استخدم حقنتين معقمتين (3 مل) في كل مرة يلزم فيها تغيير الوسائط. املأ إحدى المحقنات بوسط جديد بينما تترك المحقنة الأخرى فارغة.
8. افتح كلا صمامي المحاقن وقم بمناورة الفقاعات برفق نحو منفذ المحقنة الفارغ.
9. بمجرد حقن الوسط الطازج من المحقنة الكاملة بعناية في الوعاء ، قم بإزالة الفقاعات من خلال منفذ المحقنة الفارغ.
   ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء حتى تتم إزالة جميع الفقاعات الدقيقة من الأوعية.
10. أغلق منافذ المحاقن بأغطية وتخلص من المحاقن في حاوية نفايات الأدوات الحادة.
11. قم بتوصيل كل وعاء بقاعدة الدوار وضع قاعدة الدوار في حاضنة بدرجة حرارة 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية.
12. قم بتشغيل الطاقة واضبط سرعة الدوران على 10.1 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: اضبط السرعة للتأكد من أن السقالات معلقة دون لمس جدار الوعاء.
13. لتغيير الوسائط ، ضع الأوعية في وضع رأسي لضمان استقرار الخلايا في الأسفل. افتح منافذ المحاقن وقم بتوصيل المحاقن المعقمة بالمنافذ.
14. اتبع نفس الإجراء عن طريق شفط 75٪ من الوسط المستنفد للتغذية وحقن وسط جديد عبر المنفذ الآخر.

6. إعداد أعضاء الرئة والثقافة القائمة على المفاعل الحيوي

ملاحظة: تم استخدام جراء الفئران البرية E15 لإعداد أعضاء الرئة.

1. تشريح أنسجة الرئة بعد القتل الرحيم لفأر حامل مصاب باختناق CO₂ .
   1. بمجرد تأكيد الوفاة بعد الاختناق عن طريق خلع عنق الرحم ، استخدم مشرطا لكشف التجويف الصدري. بعد ذلك ، قم بإزالة الجراء من الرحم والقتل الرحيم عن طريق قطع الرأس.
2. بعد القتل الرحيم ، قم بإعداد التجويف الصدري عن طريق فتحه بمشرط لتحديد موقع الرئتين. اغسل أجزاء صغيرة من أنسجة الرئة باستخدام PBS المعقم وضعه على غشاء معقم مسبقا لمدة ساعتين مع وسط زراعة الأعضاء في حاضنة تحتوي على 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية.
3. بمجرد أن تلتصق أنسجة الرئة بالغشاء في لوحة زراعة الأعضاء 2D ، انقل العينات إلى وعاء المفاعل الحيوي.
4. إعداد وسائل الإعلام للثقافة.
   ملاحظة: تحتوي وسائط التحكم DMEM عالية الجلوكوز على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، محلول مضاد حيوي 1٪ (P / S) (بنسلين ، 100 وحدة / مل ، ستربتومايسين ، 50 ميكروغرام / مل) و 100 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك (AA) ولتحريض الحالات الالتهابية ، يتم استكمال وسط التحكم ب 5 نانوغرام / مل بروتين IL-6.
5. قم بإجراء تجربة زراعة الرئة لمدة 10 أيام مع تغيير الوسائط كل 48 ساعة في المفاعل الحيوي كما هو موضح أعلاه.

7. سقالة مغلفة بزراعة خلايا الرباط اللثوي البشري (hPDL)

1. زراعة خلايا أربطة اللثة البشرية.
   ملاحظة: يتم عزل الخلايا وزراعتها في مختبرنا وفقا للبروتوكول المنشور سابقا²⁵.
2. قم بتغطية أقراص سقالة الكولاجين ب 30 ميكرولتر من PBS للمجموعة الضابطة و neuropeptide galanin (GAL) بتركيز ^10-8 بين عشية وضحاها.
3. بذور خلايا PDL البشرية على السيطرة والسقالة المغلفة GAL لمدة 2 ساعة عند 37 °C في لوحة الاستزراع ، ونقل السقالات المصنفة الخلية إلى وعاء مفاعل حيوي كما ذكر أعلاه.
4. استزرع السقالات البذرية الخلوية لمدة 14 يوما في المفاعل الحيوي قبل حصاد السقالات لتحليلها.

8. تنظيف وصيانة المفاعلات الحيوية

1. بعد حصاد السقالات / الخلايا من المفاعل الحيوي ، قم بإزالة منافذ المحاقن من الوعاء.
   ملاحظة: يتم خلع البراغي حول الأوعية ويتم غسل الوعاء برفق بالماء والصابون.
2. شطف الأوعية بالماء النظيف وشد البراغي مرة أخرى.
3. قم بتخزين الأوعية بعد التعقيم حتى الاستخدام التالي.

توفر الغرفة الداخلية للمفاعل الحيوي بيئة للخلايا للتكاثر والتمايز ، أو الالتصاق بسقالة أو التجمع لتشكيل أنسجة مثل التجميعات. تحتوي كل سفينة HARV على ما يصل إلى 10 مل من الوسط وتسهل الدوران المستمر للعناصر الغذائية بحيث تتمتع كل خلية بفرصة ممتازة للبقاء على قيد الحياة. يوضح الشكل 1A ربط منافذ المحاقن باللوحة الأمامية للوعاء حيث يتم توصيل صمامات وقفة واحدة معقمة. تعمل هذه الصمامات كحراس لغرفة الثقافة. يتطلب التغيير المتوسط فتح صمام القضيب الحابس لتسهيل توصيل حقنة معقمة تحتوي على وسط جديد. تسمح بيئة الجاذبية الصغرى داخل المفاعل الحيوي للخلايا بالالتصاق بالسقالة داخل الوعاء دون الحاجة إلى البذر المسبق على السقالات. تدور السقالة (الشكل 1B و 1C) الموضوعة في المفاعل الحيوي بشكل مستمر ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بأسطح السقالات وتشكيل شبكات هيكلية خلوية. يسمح غشاء المؤكسج الموجود أسفل صفيحة الوعاء الدموي (الشكل 1 ب) بالتبادل المستمر للغازات لتحسين بقاء الخلية وطول عمرها.

تم اختبار سقالات مختلفة لتحديد السقالة الأكثر توافقا مع الخلايا. السقالة في الشكل 2A و 2B عبارة عن ورقة جرافين تتكون من 75٪ جرافين و 25 ٪ PLG (جليكوليد متعدد اللبنات). كثيرا ما تستخدم هذه السقالة الموصلة كهربائيا للخلايا التي قد تتطلب تحفيزا كهربائيا ، مثل خلايا العضلات الهيكلية²⁶. في دراساتنا ، تجاوزت سقالة الكولاجين جميع الدراسات الأخرى التي تم اختبارها من حيث التوافق الحيوي ، وتعزيز نمو الأنسجة والتمايز الخلوي. يسمح السطح المسامي المتخصص لهذه السقالة القائمة على الكولاجين (الشكل 2C و 2D) للخلايا والمواد المغذية بالتدفق في جميع أنحاء السقالة ، مما يزيد من مساحة ارتباط الخلية وتكاثر الخلايا.

يوضح الشكل 3 أ و 3 ب موضع حلقة عنق الرحم فيما يتعلق بالفك السفلي للفأر. لإعداد خلايا حلقة عنق الرحم القاطعة للفأر ، تم تشريح الفك السفلي للفأر الهيكلي وكشف الجزء البعيد من قاطعة الفأر السفلية. يتم تحديد الموضع الدقيق لحلقة عنق الرحم المقطوعة في قاطعة الفأر بعد الولادة لمدة 6 أيام (الشكل 3 ب) ، بينما يتم توفير منطقة مماثلة في الفك السفلي للفأر البالغ الهيكل العظمي كمرجع في الشكل 3 أ لأغراض التوجيه. تم تأطير منطقة حلقة عنق الرحم المقابلة في الهيكل العظمي البالغ (الشكل 3 أ) وقاطعة الفأر المحضرة حديثا 6 dpn بخطين مكسورين (الشكل 3A و B). تتكون أسنان الفك السفلي من ثلاثة أضراس الفك السفلي وقاطعة تنمو باستمرار ، في حين تتكون مكانة خلية حلقة عنق الرحم من مجموعة خلايا مختلطة تشارك في تكوين المينا مثل ظهارة المينا الداخلية ، ظهارة المينا الخارجية ، الشبكة النجمية والطبقة البينية¹⁹.

يركز الشكل 4 على التمايز الناجح لخلايا حلقة عنق الرحم إلى بروتين مينا ممدود ومستقطب يفرز خلايا تشبه الأرومة المينائية. كشفت البيانات أن التمايز الناجح لبروتين المينا الممدود والمستقطب الذي يفرز الخلايا الشبيهة بالأرومة المينائية يتطلب الزراعة المشتركة لخلايا حلقة عنق الرحم مع الخلايا الجذعية الوسيطة مثل الخلايا الجذعية لب الأسنان. تم تزويد الخلايا المستزرعة ببيئة دقيقة مصممة خصيصا كما هو موضح في الخطوة 3 من البروتوكول ، مما أدى إلى تكوين خلايا مستقطبة مع النواة في أحد طرفيها وعملية خلوية طويلة في الطرف الآخر²⁷ ، وهي سمة نموذجية للأرومات المينائية (الشكل 4 أ). أدى تطبيق الوسائط وحدها وبدون عوامل نمو و / أو طلاء سقالة إلى خلايا حلقة عنق الرحم التي تفرز بروتينات المينا الرئيسية ولكنها لم تستطيل أو تستقطب (الشكل 4 ب).

تم وضع سقالات الكولاجين المغلفة وغير المطلية بالجالانين في مفاعل حيوي مع خلايا hPDL لمدة أربعة عشر يوما في مفاعل حيوي. نجت الخلايا من فترة استزراع لمدة أسبوعين في نظام الاستزراع ثلاثي الأبعاد وأظهرت مجموعة السقالات المطلية بالجالانين معدل انتشار أعلى بكثير (الشكل 5 ب) مقارنة بمجموعة التحكم التي تحتوي على سقالات غير مطلية (الشكل 5 أ). أظهرت الخلايا في المجموعة التجريبية أيضا مستوى أعلى بكثير من المصفوفة خارج الخلية التي تحتوي على ألياف النسيج الضام مقارنة بالمجموعة الضابطة.

أثبتت بيئة المفاعل الحيوي نجاحها في نمو قطاعات الرئة في بيئة الجاذبية الصغرى 3D (الشكل 6). في هذه الدراسة ، تم وضع شرائح أنسجة الرئة التي تم حصادها من الفئران E15 (الشكل 6C) على غشاء النيتروسليلوز في طبق زراعة الأعضاء لمدة ساعتين. بعد التعلق الأولي بالأنسجة بالغشاء ، تم وضع مركب أنسجة الرئة / الغشاء النيتروخلوي في وعاء المفاعل الحيوي وتم استزراعه بنجاح لمدة 10 أيام (الشكل 6 أ). لدراسة آثار الحالات الالتهابية على نمو أنسجة الرئة ، أدت إضافة IL-6 إلى وسط المزرعة إلى تغييرات نموذجية مرتبطة بالالتهاب في التشكل السنخي مماثلة لتلك التي شوهدت في الجسم الحي (الشكل 6B).

الشكل 1. مكونات وعاء المفاعل الحيوي. يوضح الشكل 1 المكونات الرئيسية لوعاء المفاعل الحيوي وموقعها في مرحلة ما قبل التجميع. (أ) الموضع النسبي لحجرة المفاعل ومنافذ المحاقن والسقالة. (ب) وضع نصف مفتوح للوحة الأمامية (غطاء شفاف) واللوحة الخلفية (صفيحة بيضاء مغطاة بغشاء الأكسجين). يتم وضع السقالة في الوسط بين اللوحة الأمامية والخلفية. توضح سقالة الجرافين ذات اللون الأسود (C) كيفية وضع سقالة داخل الوعاء واستخدامها كدعم للخلايا للتكاثر والتمايز وتشكيل شبكة خلوية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2. الرسوم التوضيحية التمثيلية للسقالات التي تم اختبارها في هذه الدراسة. تم اختبار خمس سقالات لدراساتنا حول المفاعلات الحيوية ، والتي يتم تقديم مثالين منها هنا. (A ، B) تمثل سقالة الجرافين التي تم اختبارها لنمو الخلايا الشبيهة بالأرومات المينائية ، بينما تمثل (C ، D) سقالة الكولاجين الأكثر نجاحا لدراساتنا القائمة على زراعة الخلايا القائمة على المفاعل الحيوي. لاحظ البنية المسامية لسقالة الكولاجين (C ، D) مقابل المجموعة المتوازية من النقوش السطحية في سقالة الجرافين (A ، B). (A ، C) هي مخططات ماكروغرافية مأخوذة من منظور عمودي بينما تم تصوير (B ، D) بزاوية 45 درجة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3. إعداد حلقة عنق الرحم. يوضح الفك السفلي للفأر البالغ الهيكلي في A منطقة حلقة عنق الرحم المستخدمة لإعداد مكانة الخلية لزراعة الخلايا الشبيهة بالأرومة المينائية والتمايز. يوضح هذا الرسم البياني أيضا موضع العلامات التشريحية ، بما في ذلك القاطعة المتنامية باستمرار (inc) التي تمتد تقريبا على طول الفك السفلي بالكامل ، وضرس الفك السفلي الأول (m₁) جنبا إلى جنب مع زاوية الفك السفلي ، وعملية الإكليل وموضع لقمة الفك السفلي. يعمل هذا المستحضر الهيكلي كاتجاه تشريحي لمنطقة حلقة عنق الرحم المعدة في (ب). تشمل النقاط المرجعية عظم الفك السفلي (mand) ، وأنسجة حليمة الأسنان (DP) ، وزاوية الفك السفلي (Angle) وموضع حلقة عنق الرحم (CL) التي تم حصاد الخلايا منها لدراسات المفاعل الحيوي ameloblast. يشير الخط المكسور إلى الجزء الأمامي والبعيد من نافذة الفك السفلي المهيأة لتشريح حلقة عنق الرحم في الفك السفلي البالغ الهيكلي (A) وفي الفك السفلي 6 dpn الذي تم تشريحه حديثا (B). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4. توليد خلايا تشبه الأرومة المينائية باستخدام نهج الاستزراع المشترك 3D. (أ) التمايز الناجح للخلايا الشبيهة بالخلايا الشريطية المينائية من خلايا العروة العنقية المستزرعة مع الخلايا الجذعية لب الأسنان في بيئة دقيقة مناسبة. كان عدد الخلايا الناتج يتألف من خلايا طويلة وممدودة ومستقطبة مع القدرة على إفراز بروتينات مصفوفة المينا. تتميز هذه الخلايا بنواة في أحد طرفيها (nucl) وعملية خلوية (proc) تشبه عملية Tomes كما لوحظ في الأرومات المينائية الحقيقية في الطرف الآخر (A). يوضح الخيار (ب) مجموعة من خلايا المجموعة الضابطة التي تعرضت أيضا لظروف زراعة مشتركة ولكن مع وسائط خالية من عوامل النمو أو عوامل التمايز، مما ينتج عنه خلايا مستديرة لا تمثل الأرومات المينائية النموذجية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5. ثقافة 3D طويلة الأجل لسلف اللثة أحادي الخلية (pdl) مع أسطح سقالة مطلية وغير مغلفة. أدى طلاء السقالة إلى زيادة معدل تكاثر خلايا hPDL في الخلايا المزروعة على السقالة المطلية بالجالانين (B) مقارنة بخلايا المجموعة الضابطة المعرضة لسقالة غير مغلفة (A). كما أفرزت خلايا المجموعة التجريبية المزيد من المصفوفة خارج الخلية التي تحتوي على ألياف النسيج الضام مقارنة بالمجموعة الضابطة (B مقابل A). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6. زراعة أنسجة الرئة في مفاعل حيوي. (أ) E15 أجزاء أنسجة الرئة المزروعة على غشاء النيتروسليلوز في مفاعل حيوي لمدة عشرة أيام. (ب) E15 أجزاء أنسجة الرئة مشابهة ل (A) ولكنها تتعرض لحالات التهابية عن طريق إضافة IL-6 إلى الوسائط (B). (C) مقطع البارافين من أنسجة الرئة E15 التي تم تشريحها حديثا والملطخة ب H&E. لاحظ أوجه التشابه في مورفولوجيا الخلايا السنخية من النوع الأول والنوع الثاني عند مقارنة (A) و (C). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تشمل الخطوات الحاسمة لبروتوكول نمو الخلايا في الجاذبية الصغرى المفاعل الحيوي ، والسقالة ، والخلايا المستخدمة في ثقافة 3D ، وطلاء السقالة كوسيلة للحث على تمايز الخلايا. يتكون نوع المفاعل الحيوي المستخدم في دراساتنا من المفاعل الحيوي RCCS-4 ، وهو تعديل حديث لجهاز زراعة الأنسجة الأسطوانية الدوارة الأصلي لنظام زراعة الخلايا الدوارة (RCCS) الذي طورته وكالة ناسا لزراعة الخلايا في محاكاة الجاذبية الصغرى. توفر بيئة RCCS-4 هذه ضغوط قص منخفضة للغاية ، مما يعزز نقل الكتلة ويحسن أداء الثقافة. سمح هذا الإصدار من المفاعل الحيوي بالاستخدام المتزامن لأربع أوعية لأربع تجارب مختلفة في نفس الوقت. تم تجهيز المفاعل الحيوي RCCS-4 بأوعية ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية (HARV) ، والتي ضمنت ظروف استزراع بسيطة ومباشرة مع عدد كاف من الخلايا لدراساتنا.

المكون الحاسم الثاني لنهجنا هو السقالات لأنها توفر قوالب للخلايا العائمة لإرفاق التجميعات وتشكيلها. في حين أن استخدام السقالات في ثقافة 2D محدود بسبب تكوين النوى الميتة ، فإن الانتشار المعزز والأكسجين وتدفق المغذيات في مفاعل حيوي دوار يحسن من قابلية تطبيق السقالات كناقلات لنشر مجموعات الخلايا^28،29. في هذه الدراسة ، استكشفنا فعالية خمسة أنواع من السقالات ، سقالات البولي (حمض اللاكتيك - كو - الجليكوليك (PLGA) ، سقالة كولاجينية ومسامية ، سقالة جرافين ، بالإضافة إلى قرص جيلاتيني وقرص هيدرودوكسيباتيت. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بنقل الغشاء من بيئة زراعة أعضاء الرئة إلى المفاعل الحيوي ، مع ربط جزء الرئة المستزرع به. من بين هؤلاء ، ظهرت سقالة الكولاجين باعتبارها السقالة الأكثر ملاءمة في دراساتنا ، ربما بسبب تكوينها الكولاجيني وهيكلها المسامي. تم إنتاج سقالة PLGA خلايا قابلة للحياة ، بينما كانت السقالات الثلاثة الأخرى أقل ملاءمة في أيدينا. أثبت غشاء النيتروسليلوز لنظام زراعة أعضاء الرئة الأصلي أنه سقالة فعالة أخرى لأنه نجح في الحفاظ على سلامة الرئة المستزرعة بعد النقل إلى بيئة المفاعل الحيوي 3D.

العنصر الثالث الحاسم في استراتيجيتنا هو أنواع الخلايا المستخدمة لزرع الوعاء. في دراساتنا حول تكوين النشوء ، اعتمدنا على خلايا حلقة عنق الرحم المحضرة من قواطع الفئران المتنامية باستمرار والتي تم استزراعها مع خلايا لب الأسنان. تم اختيار خلايا حلقة عنق الرحم كمصدر لأسلاف أعضاء المينا الأصلية التي يتم تجديدها باستمرار في قاطعة القوارض. قاطعة الفأر أو الجرذ هي مصدر رائع للخلايا الجذعية والسلفية التي تستمر في الوجود طوال حياة الحيوان بينما يتم تجديد خلايا عضو المينا من أجل الثوران المستمر وتكوين النشوء^23,30. تم استخدام كل من الخلايا السلفية اللثوية وخلايا لب الأسنان كمصادر لخلايا الاستزراع المشترك. إن استخدام مجموعات الخلايا المستزرعة المشتركة الوسيطة للثقافة الناجحة للخلايا الظهارية راسخ^31,32. في دراساتنا ، كانت خلايا لب الأسنان أكثر فعالية في إحداث تمايز الأرومة المينائية من أسلاف الأربطة اللثوية على الرغم من أنه بناء على خصائصها الوسيطة ، كلاهما مناسب كمرشحين للثقافة المشتركة السنية واللحمة المتوسطة. عند تطبيقها على تكوين النشوء ، قد تكون خلايا لب الأسنان كنظير طبيعي للظهارة السنية المنشأ أثناء نمو الأسنان قد تسببت في التفاعلات الظهارية المتوسطة المناسبة المناسبة لتحريض تمايز الأرومة المينائية الطرفية^33،34. ومع ذلك ، لدراسة تفاعلات السقالة لهندسة أنسجة اللثة ، كانت أسلاف اللثة مناسبة بشكل مثالي لأنها تؤدي إلى خلايا ليفية متمايزة تماما في أربطة اللثة^25,35. أخيرا ، بالنسبة لزراعة أعضاء الرئة في بيئة المفاعل الحيوي ، اعتمدنا على تشريح شرائح رئة الفئران الجنينية. تم وصف إجراءات زراعة أعضاء الرئة الجنينية في أطباق زراعة الأعضاء في وقت سابق³⁶ وتم استكشاف عدد من نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد التي تجمع بين الخلايا الظهارية الرئوية وخلايا العضلات الوعائية أو الملساء³⁷،^38،39. في الدراسة الحالية ، حافظ نموذج المفاعل الحيوي 3D على مستوى قوي من إفراز الفاعل بالسطح مع الحفاظ على سلامة جوهر كتلة الأنسجة المستزرعة ، مما يجعل هذا النموذج مناسبا لدراسة التأثيرات البيئية على سلامة أنسجة الرئة.

الجانب الرابع المهم لنموذجنا هو تطبيق طلاءات محددة من نوع الخلية على أسطح السقالات لتحفيز تمايز الخلايا الشبيهة بالأرومات المينائية. على وجه التحديد ، ظهرت مكونات مثل LRAP ومصفوفة المينا كعوامل مساهمة رئيسية في تمايز الخلايا الشبيهة بالأرومات المينائية حيث أن نقص الطلاء باستخدام LRAP ومصفوفة المينا الأولية يحظر تكوين خلايا ممدودة ومستقطبة. معا ، يوفر طلاء أسطح السقالات أداة قوية لتعزيز التمايز الخاص بالأنسجة للأعضاء المعقدة في المفاعلات الحيوية.

كان الجانب الأكثر أهمية في هذه الدراسة هو القدرة على استعادة شكل الخلية الممدود والمستقطب المميز للأرومات المينائية. هذه النتيجة هي فائدة فريدة من نوعها لنظام المفاعل الحيوي 3D على قيود أنظمة الثقافة 2D التي تقريب الخلايا المشتقة من أعضاء المينا بشكل كبير. توفر هذه النتيجة دليلا إضافيا على فائدة استخدام تقنيات المفاعلات الحيوية عند زراعة خلايا غير متوافقة مع تقنيات الاستزراع الأخرى⁴⁰. نعزو نجاح دراسات الاستزراع المشترك للأرومة المينائية إلى العديد من السمات الفريدة لنظام المفاعل الحيوي الدوار ، بما في ذلك الإمداد المستمر بالمغذيات وعوامل النمو والنسخ والأكسجين ، بالإضافة إلى قدرة الخلايا الفردية على تجميع وتشكيل تفاعلات اجتماعية بين الخلايا من مختلف السلالات ومراحل النمو. بينما نجحت الدراسات في زراعة خلايا ممدودة ومستقطبة وأميلوجينين تفرز خلايا تشبه الأرومة المينائية ، تظل الخلايا الشبيهة بالأرومة المينائية المزروعة هنا في عزلة ، وفقدت الاستمرارية الطبيعية لصف خلايا الأرومة المينائية. في التطبيقات المستقبلية، يمكن استخدام الخلايا الشبيهة بالأرومات المينائية المزروعة بهذه التقنية في تطبيقات هندسة أنسجة المينا أو كنموذج تجريبي لتلخيص جوانب تكوين النشوء في الأسنان.

في الختام ، ظهر المفاعل الحيوي 3D كبيئة ناجحة لانتشار الثقافات المشتركة لحلقة عنق الرحم / لب الأسنان في الأرومات المينائية ، لنمو أسلاف أربطة اللثة في السقالات المطلية ولزراعة أعضاء الرئة بأكملها. بناء على هذه البيانات ، من المرجح أن تظهر التقنيات القائمة على المفاعلات الحيوية كوسائل مهمة لهندسة الأنسجة المتقدمة أو استراتيجيات الاختبار في مجالات مثل مينا الأسنان واللثة وأبحاث الرئة.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

تم دعم الدراسات بسخاء بمنح من المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والقحف الوجهي (UG3-DE028869 و R01-DE027930).