שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

הכלאה פלואורסצנטית באתרו (באנגלית: Fluorescent in situ hybridization, בקיצור FISH) היא טכניקה מולקולרית המזהה נוכחות והתפלגות מרחבית של תעתיקי רנ"א ספציפיים בתוך תאים. פנוטיפ נוירוכימי של נוירונים המזוהים פונקציונלית דורש בדרך כלל תיוג מקביל עם נוגדנים מרובים (חלבון מטרה) באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ואופטימיזציה של הכלאה באתרו (RNA ממוקד), במקביל. ניתן להשיג "חתימה נוירוכימית" כדי לאפיין נוירונים מסוימים, אולם גורמים מסובכים כוללים את הצורך לאמת מטרות FISH ו-IHC לפני שילוב השיטות, והמספר המוגבל של רנ"א וחלבונים שניתן לכוון בו זמנית באותו מקטע רקמה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול, המשתמש הן בתכשירים טריים קפואים והן בתכשירי מוח קבועים של עכברים, אשר מזהה מספר mRNA וחלבונים באותו אזור במוח באמצעות RNAscope FISH ואחריו פלואורסצנטיות immunostaining, בהתאמה. אנו משתמשים בשיטה המשולבת כדי לתאר את דפוס הביטוי של mRNA בשפע נמוך (למשל, קולטן גלנין 1) ו-mRNA בשפע גבוה (למשל, טרנספורטר גליצין 2), בגרעיני גזע המוח המזוהים אימונוהיסטוכימית.

שיקולים מרכזיים לסימון חלבונים במורד הזרם של בדיקת FISH מתרחבים מעבר להכנת רקמות ואופטימיזציה של תיוג בדיקת FISH. לדוגמה, מצאנו כי קשירת נוגדנים וספציפיות התיוג יכולים להיות מושפעים לרעה על ידי שלב פרוטאז בתוך בדיקת FISH. פרוטאזות מזרזות פיצול הידרוליטי של קשרים פפטידיים, ומקלות על כניסת גשושיות FISH לתאים, אולם הן עשויות גם לעכל את החלבון הממוקד על ידי בדיקת IHC שלאחר מכן, ולייצר קשירת מטרה. המיקום התת-תאי של חלבון המטרה הוא גורם נוסף התורם להצלחת IHC לאחר בדיקת FISH. ראינו שספציפיות IHC נשמרת כאשר חלבון המטרה קשור לממברנה, בעוד שהתמקדות IHC בחלבון ציטופלזמי דרשה פתרון בעיות נרחב. לבסוף, מצאנו שהטיפול ברקמה קפואה קבועה המותקנת במגלשה מאתגר יותר מרקמה קפואה טרייה, אולם איכות IHC הייתה בסך הכל טובה יותר עם רקמה קפואה קבועה, בשילוב עם RNAscope.

חלבונים ו-mRNA המגדירים באופן נוירוכימי תת-אוכלוסיות של תאי עצב מזוהים בדרך כלל עם שילוב של אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו/או הכלאה באתרו (ISH), בהתאמה. שילוב ISH עם טכניקות IHC מאפשר אפיון של דפוסי קולוקליזציה ייחודיים לנוירונים פונקציונליים (קידוד נוירוכימי) על ידי מקסום יכולת התיוג המרובה.

שיטות ISH פלואורסצנטיות (FISH), כולל RNAscope, הן בעלות רגישות וספציפיות גבוהות יותר בהשוואה לשיטות גילוי RNA מוקדמות יותר כגון ISH רדיואקטיבי ו- ISH כרומוגני לא רדיואקטיבי. FISH מאפשר הדמיה של תעתיקי mRNA בודדים ככתמים מוכתמים מנוקבים¹. יתר על כן, בדיקת RNAscope מאפשרת לסמן מספר גדל יותר של מטרות RNA בכל פעם, באמצעות תגי פלואורופור שונים. למרות יתרונות אלה, מגבלות טכניות עשויות להשפיע על מספר הפלואורופורים/כרומוגנים שניתן להשתמש בהם בניסוי יחיד. אלה כוללים זמינות של ערכות מסנני מיקרוסקופ; שיקולים אלה מתעצמים כאשר זיהוי נוירוכימי משתמש בשילוב FISH ו-IHC, בהשוואה לשימוש בכל טכניקה בנפרד, שכן צעדים אינהרנטיים אופטימליים לשיטה אחת עלולים להזיק לאחרת.

יישום קודם של FISH בשילוב עם IHC הדגים ביטוי של מטרות תאיות ספציפיות בלימפומות של תאי B אנושיים², עוברי אפרוחים³, עוברי דגי זברה⁴, רשתית עכבר⁵ ותאי אוזן פנימית^{של עכבר 6}. במחקרים אלה, הכנת רקמות הייתה או פרפין קבוע פורמלין משובץ (FFPE) ^2,3,5 או הר שלם טרי ^4,6. מחקרים אחרים יישמו רנ"א כרומוגני על תכשירי מוח קבועים^של עכברים וחולדות ^7,8,9. בפרט, Baleriola et al.⁸ תיאר שתי תכשירי רקמות שונים עבור ISH-IHC משולב; קטעי מוח קבועים של עכבר ומקטעי מוח אנושיים מסוג FFPE. בפרסום שפורסם לאחרונה, שילבנו FISH ו-IHC פלואורסצנטי על מקטעים קפואים טריים, כדי להמחיש בו זמנית mRNA בשפע נמוך (קולטן גלנין 1, GalR1), mRNA בשפע גבוה (גליצין טרנספורטר 2, GlyT2) וחלבון טרנספורטר אצטילכולין שלפוחית (vAChT)¹⁰ במבנה הרשתית של גזע המוח.

גרעין מערכת הבידוד (באנגלית: Nucleus of the Solitary tract או NTS) הוא אזור מרכזי במוח המעורב בתפקוד אוטונומי. אוכלוסייה הטרוגנית זו של תאי עצב, הממוקמת במוח האחורי, מקבלת ומשלבת מספר עצום של אותות אוטונומיים, כולל אלה המווסתים את הנשימה. ה-NTS מכיל מספר אוכלוסיות נוירונים, אשר עשויות להיות מאופיינות פנוטיפית על ידי דפוס הביטוי של מטרות mRNA כולל GalR1 ו-GlyT2 וסמנים חלבוניים עבור האנזים טירוזין הידרוקסילאז (TH) וגורם השעתוק Paired-like homeobox 2b (Phox2b).

הבעלים של RNAscope ממליץ על תכשירים טריים של רקמות קפואות, אך רקמות שהוכנו על ידי קיבוע זילוח טרנסקרדיאלי של בעלי חיים שלמים, יחד עם הגנה קריוגנת לטווח ארוך (אחסון ב -20 מעלות צלזיוס) של חלקי רקמות קפואות קבועות, נפוצים במעבדות רבות. לפיכך, ביקשנו לקבוע פרוטוקולים עבור FISH בשילוב עם IHC באמצעות תכשירי רקמות קפואות טריות וקבועות. כאן, אנו מספקים חלקי מוח קפואים וקבועים טריים: (1) פרוטוקול לשילוב של FISH ו- IHC פלואורסצנטי (2) תיאור של איכות mRNA ותיוג חלבונים המיוצרים, בעת שימוש בכל תכשיר (3) תיאור של ביטוי GalR1 ו- GlyT2 ב- NTS.

המחקר שלנו גילה כי בשילוב עם מתודולוגיית RNAscope, הצלחת IHC השתנתה בתכשירים טריים קפואים וקבועים מוקפאים, והייתה תלויה בלוקליזציה של חלבוני המטרה בתוך התא. בידינו, תיוג חלבונים הקשורים לממברנה היה תמיד מוצלח. לעומת זאת, IHC עבור חלבון ציטופלזמי דרש פתרון בעיות גם במקרים שבהם החלבון הציטופלזמי בא לידי ביטוי יתר בחיה טרנסגנית (Phox2b-GFP)¹¹. לבסוף, בעוד GalR1 מבוטא בנוירונים שאינם קטכולמינרגיים ב-NTS, ביטוי GlyT2 נעדר ב-NTS.

סיכום של שלבי קדם-עיבוד רקמות ניתן למצוא באיור 1. כל ההליכים בוצעו בהתאם לוועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת ניו סאות 'ויילס בהתאם להנחיות לשימוש וטיפול בבעלי חיים למטרות מדעיות (המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי באוסטרליה).

1. הכנת דגימה של רקמת מוח קפואה טרייה

1. זילוח Transcardial
   1. הכינו חיץ פוספט 0.1 M (PB) 0.1 M (2500 U/L), pH 7.5. הפוך קרח יבש אתנול slurry על ידי ערבוב קרח יבש עם אתנול. זו תהיה טמפרטורה של כ -72 מעלות צלזיוס ותשמש להקפאה מיידית של הרקמה שנקטפה.
   2. המתת חסד של עכברים בוגרים C57BL/6 ו- Phox2b-GFP¹¹ (מזהה מסד נתונים של גנום עכבר MGI:5776545) על ידי הרדמה עם נתרן pentobarbital (70 מ"ג / ק"ג, כלומר באמצעות מד מחט 27.5 אינץ '.
      זהירות: Pentobarbital הוא barbiturate. הוא רעיל מאוד במינונים גבוהים ועלול לגרום למוות בדום נשימה. יש להיוועץ בהנחיות בטיחות מקומיות, משפטיות וחומריות לפני השימוש.
   3. לחשוף את הלב ו cannulate החדר השמאלי עם מחט ציור (23 אינץ 'מד). בצע זילוח transcardial עם heparinized 0.1 M PB עד הדם לנקות (2-3 דקות) בקצב זרימה של 11-13 מ"ל / דקה. לקבוע את ניקוי הדם על ידי ניטור צבע הכבד ואת effusate מן אטריום ימין¹².
   4. בודדו את המוח מחלל הגולגולת, הטמיעו אותו מיד בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בנייר אלומיניום או קריומולד והניחו אותו על אמבט אתנול קרח יבש. אחסן את הרקמה המוטבעת הקפואה במיכל אטום ב - 80 ° C למשך עד 3 חודשים.
2. חתך של רקמה קפואה טרייה
   1. הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ל -20 מעלות צלזיוס. השאירו את הרקמה המשובצת OCT וצ'אק קריוסטט בהקפאה למשך ~30 דקות כדי לאפשר שיווי משקל לטמפרטורה החדשה.
      הערה: שמור את הרקמה קפואה בכל עת; להעביר את הרקמה מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס להקפאה על קרח יבש.
   2. הצמידו את הרקמה לצ'אק הקריוסטט המצונן מראש באמצעות תרכובת OCT. בפרוטוקול זה, גושי רקמות הותקנו על הצ'אק במישור העטרה.
      הערה: יש לחתוך עודפי OCT מהרקמה, באמצעות סכין גילוח, כדי למזער את כמות ה-OCT שנחתכת על ידי ההקפאה ולאחר מכן מועברת למגלשת הזכוכית.
   3. חתכו קטעי קורונל בעובי 14 מיקרומטר והרכיבו אותם על שקופיות מיקרוסקופיית זכוכית טעונה.
      1. חממו את המגלשות לטמפרטורת החדר לפני הרכבת המקטעים. לאחר התקנת המקטע, שמור את השקופיות בתיבת שקופיות בהקפאה.
      2. אם יש צורך להרכיב יותר ממקטע אחד בשקופית אחת, חממו את האזור עבור המקטע השני על ידי הנחת אצבע בצד הנגדי של השקופית למשך 5-10 שניות כדי לסייע בהיצמדות המקטע לשקופית. מקטע רקמה קרה לא יתחבר לשקופית קרה. הקטעים צריכים לדבוק בשקופיות שטוחות; קיפול יגרום להם ליפול מהמגלשות במהלך שלבי השטיפה.
      3. אם סדקים הם שם לב בסעיפים, להגדיל את טמפרטורת cryostat על ידי 1-5 °C (75 °F) כדי למנוע זאת. חשוב במיוחד למקם מקטעי רקמות בסמיכות זה לזה באותה שקופית. זה ימנע בזבוז של בדיקות FISH ריאגנטים במהלך הבדיקה.
   4. יש לאחסן חלקי רקמות המותקנים על מגלשות זכוכית במיכל אטום לאוויר בטמפרטורה של -80°C למשך עד 6 חודשים.
      הערה: יש לשמור את המקטעים קפואים בכל עת ולהימנע ממחזורי הפשרה בהקפאה, כדי למנוע התפרקות RNA. העבירו את קופסת המגלשה מתוך ההקפאה למקפיא בטמפרטורה של -80°C על קרח יבש.
3. קיבוע של רקמה קפואה טרייה
   1. ביום ביצוע בדיקת FISH, הכינו 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-0.1 M PB, pH 7.5 (תמיסת 4% PFA). סינון על ידי מעבר דרך נייר סינון (דרגה 1: 11 מיקרומטר, רשימת חומרים) במשפך Buchner או כור היתוך.
      אזהרה: PFA מזיק ורעיל במגע עם העור או בשאיפה. כל ההליכים עם פתרון PFA צריכים להתבצע בארון מכסה אדים. יש להשליך את פסולת פתרונות PFA בקפידה בהתאם לפרוטוקולי בטיחות מוסדיים.
   2. מצננים את תמיסת ה-4% PFA ל-4°C. העבירו את הרקמה המותקנת במגלשה מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C בקרח יבש וטבלו אותה מיד בקיבוע המצונן מראש למשך 15 דקות.
      הערה: חשוב ששלב קיבוע זה לא יעלה על 15 דקות מכיוון שקיבוע יתר יגרום לתיוג רקע לא ספציפי.
4. התייבשות של רקמה קפואה טרייה
   1. יש לייבש את חלקי הרקמה על ידי טבילת השקופיות בריכוזים מדורגים של אתנול. בצנצנת קופלין טובלים תחילה ב-50%, לאחר מכן ב-70% ולבסוף באתנול מוחלט, למשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. חזור על הדגירה המוחלטת הסופית של אתנול פעם נוספת.
   2. מגלשות יבשות באוויר ושרטט את קבוצת המקטעים באמצעות עט מחסום הידרופובי, תוך הקפדה על מינימום שמירה על האזור הפנימי.
      הערה: ודא שמגלשת הזכוכית יבשה לחלוטין לפני ציור המחסום ההידרופובי. המחסום ההידרופובי צריך להקיף את חלקי הרקמה לחלוטין ללא רווחים וחייב להיות יבש לפני עיבוד נוסף.

2. הכנת דגימה של רקמת מוח קפואה קבועה

1. קיבוע זילוח קרום הלב
   1. המתת חסד עכברים על ידי הרדמה עם נתרן pentobarbital (70 מ"ג / ק"ג, כלומר i.p) ולאחר מכן זילוח transcardial, תחילה עם 0.1 M PB ולאחר מכן 4% PFA פתרון. תקן עם 10 דקות של זילוח ב 11-13 מ"ל / דקה.
   2. בודדו את המוח מחלל הגולגולת לאחר קיבוע זילוח ושקעו למשך הלילה בתמיסת 4% PFA, בטמפרטורה של 4°C.
2. חתך רקמות של רקמה קבועה
   1. שטפו את המוח במי מלח סטריליים חוצצים פוספט 0.1M (PBS) לפני הסרת שכבות קרום המוח, בעזרת מיקרוסקופ נתיח, באמצעות מלקחיים עדינים.
   2. חתכו את המוח באופן מדויק לבלוקים (הפרידו את גזע המוח מהמוח הקדמי לפני חיתוך הוויברטום) באמצעות מטריצה מוחית (Table of Materials). באופן ספציפי, חתכו את גזע המוח באופן קאודלי בדיון הפירמידלי ונתחו את המוח הקטן. באופן דומה, לחתוך את המוח הקדמי מיד rostral לכיאזמה אופטית.
   3. הצמידו את הרקמה לצ'אק מיקרוטום רוטט באמצעות ציאנואקרילט והטמיעו בתמיסת אגר 2%.
   4. חתכו קטעי רקמה בעובי 30 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום רוטט ואחסנו חלקים חתוכים בתמיסה קריופרוטקנטית (30% סוכרוז ללא RNase, 30% אתילן גליקול, 1% פוליוויניל פירולידון (PVP-40), ב-0.1 M PB, pH 7.4). ניתן לאחסן חלקי רקמות בהגנה קריופרוטקטורית בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.
3. הכנת מקטעים קבועים לפני FISH
   1. ביום של FISH, לשטוף חלקים צפים חינם שלוש פעמים, במשך 10 דקות לכל שטיפה, כדי להסיר את הפתרון cryoprotectant. כדי לשטוף, מניחים חלקים ב 0.1 M PBS בצלחת תרבית תאים 12 באר ולהתסיס על שייקר פלטפורמה מסתובב (90 - 100 סל"ד).
   2. לאחר השטיפה, השתמשו במברשת צבע כדי להרכיב חלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית וייבשו באוויר למשך שעתיים לפחות.
      הערה: החלקים צריכים להיצמד שטוחים לשקופיות מכיוון שכל קיפול בולט יגרום להן להתנתק במהלך הכביסה.
   3. באמצעות עט מחסום הידרופובי, צייר מחסום סביב החלקים כדי להגביל את ריאגנטים FISH לחלקים. שוב, חשוב למזער את השטח הפנימי של קווי המתאר המשורטטים בעט המחסום.
      נקודת שבירה אפשרית: ניתן לאחסן את המקטעים בטמפרטורת החדר, למשך הלילה, כדי להמשיך את הבדיקה למחרת.

3. בדיקת דגים

הערה: שאר הפרוטוקול חל הן על רקמות קפואות טריות והן על רקמות קפואות קבועות.

1. הכינו את הריאגנטים והמכשירים לשלבי הכלאה והגברה.
   1. הגדר אינקובטור ספסל ואמבט מים ל -40 מעלות צלזיוס.
   2. הכינו תא לח ומוגן אור לדגירת שקופיות. לחות מונעת התייבשות של רקמות - שקופיות ממוקמות היטב מעל מאגר לח. באופן אידיאלי, התא עשוי פוליסטירן כבד, הוא עמיד לאור ואטום, כדי לשמור על אווירת אדי מים רוויים. סגירת התא מסתמכת על חיכוך מינימלי כדי למנוע תנועה. השתמשנו בקופסת שקופיות מרופדת במגבוני מעבדה לחים (טבלת חומרים) בתחתית. הניחו את קופסת השקופיות בתוך האינקובטור כדי לחמם אותה מראש ל -40 מעלות צלזיוס.
   3. חממו את חיץ הכביסה 50x (טבלת חומרים) ואת הבדיקות ל-40°C למשך 10 דקות, באמצעות אמבט המים, ולאחר מכן קררו לטמפרטורת החדר.
   4. הכינו 1 ליטר של 1x Wash Buffer מריכוז מלאי של 50x.
   5. הכנת תערובת בדיקה (טבלת חומרים): הגשושית C1 מוכנה לשימוש בריכוז במלאי, בעוד שגשושיות C2 ו-C3 נשלחות בריכוז פי 50 ודורשות דילול עם המדלל המסופק בערכה.
      הערה: ניתן לאחסן תערובות בדיקה בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים.
2. טיפול בפרוטאז
   1. יש לדגור על חלקים עם פרוטאז III (טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      הערה: ודא כי פרוטאז III וריאגנטים דגירה בתהליכים במורד הזרם (תערובת בדיקה, פתרונות הגברה, חיץ חוסם וסרא נוגדנים) מכסים את החלקים לחלוטין. ניתן להשתמש בקצה פיפט כדי להפיץ את המגיב על החלק כדי לכסות את כל השטח בתוך המחסום ההידרופובי.
   2. שטפו את המגלשות פעמיים עם 0.1 M PBS, למשך 2 דקות בכל פעם, בצלחת פטרי מרובעת גדולה מפלסטיק. כאן נעשה שימוש בצלחת ביו-אסאי מרובעת בגודל 245 מ"מ x 245 מ"מ (טבלת חומרים). מחזיקים מצד אחד של הכלי ומטים בעדינות 3-5 פעמים. לאחר השטיפה, החלק עודף 0.1 M PBS מהשקופית ומיד להוסיף את מגיב הבא. אין לתת לחלקי רקמות להתייבש.
      הערה: במהלך כל כביסה, המגלשות שקועות בתמיסה בטמפרטורת החדר. זהו תהליך העבודה עבור כל שלבי הכביסה הבאים. החלקים הקבועים בעובי 30 מיקרומטר נעקרים מהמגלשות בקלות רבה יותר מאשר מקטעים בעובי 14 מיקרומטר, היו עדינים במהלך השטיפות.
3. הכלאה והגברה
   1. לאחר שטיפת תמיסת הפרוטאז, הניחו את המגלשות בתא לח שחומם מראש. לדגור חלקים עם תערובת בדיקה (טבלה של חומרים) במשך 2 שעות ב 40 ° C בתוך אינקובטור benchtop.
      הערה: ודא שיש לפחות 2 חלקים שהוקצו לבדיקות בקרה חיוביות ושליליות כדי להעריך את איכות הרנ"א הדגימה וחדירה אופטימלית. בדיקות בקרה חיוביות מכוונות לגנים של תחזוקת הבית; כאן, אלה היו קוקטייל של RNA המכוון ליוביקוויטין C (UBC; שפע גבוה), פפטידילפרופיל איזומראז B (PPIB; שפע בינוני) ו-RNA פולימראז 2a (POLR2A; שפע נמוך). בדיקות בקרה שליליות מכוונות לגן החיידק 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase (DapB), אשר בדרך כלל נעדר בדגימות מוח של עכברים. אות DapB חיובי מצביע על אות לא ספציפי ו/או זיהום חיידקי של הדגימה.
   2. לאחר הכלאה עם תערובת הגשושית, שלבי הגברת האות מורכבים מדגירה עם Amp 1-FL (30 דקות), לאחר מכן עם Amp 2-FL (15 דקות), אחריו Amp 3-FL (30 דקות) ולבסוף Amp 4-FL (15 דקות) - כל אחד ב-40°C. באמצעות בקבוקי הטפטפת המסופקים, מכסים את חלקי הרקמה בתמיסת הגברה. המשך לבדיקת IHC לאחר שלב ההגברה האחרון.
   3. שטפו שקופיות עם Wash Buffer פעמיים במשך 2 דקות בין הכלאת הבדיקה לכל שלב הגברה.

4. בדיקת IHC

1. צעד החסימה של IHC
   1. כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים, יש לדגור על המקטעים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם תמיסת חסימה המכילה 10% נסיוב סוסים רגיל, 0.3% Tween20 in 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% merthiolate) לאחר בדיקת FISH. הכינו נוגדנים ראשוניים במאגר דילול המכיל 1x TBSm, 5% סרום סוס רגיל ו-0.1% Tween20. ספקי נוגדנים ראשוניים מפורטים בטבלת החומרים.
2. אימונוהיסטוכימיה
   1. הסר את מאגר חסימת העודפים על ידי הזזת המגלשה ודגר על חלקים עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס.
   2. יש לשטוף את המגלשות 3 פעמים (5 דקות כל אחת) עם 1x TBSm ולדגור עם נוגדן משני בחומר מדלל המכיל 1x TBSm, 1% סרום סוס רגיל ו-0.1% Tween20 למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. נוגדנים משניים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.
   3. שטפו שקופיות 3 פעמים עם 1x TBSm (5 דקות כל אחת) לפני החלקה באמצעי הרכבה עם או בלי DAPI (Table of Materials).

5. הדמיה

1. יש לבחון את הצביעה החיסונית תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמה (ראו פירוט בטבלת חומרים ). קבל תמונות מייצגות בהגדלה של 20x ושמור כקובצי TIFF.
2. ייצוא תמונות מייצגות לתוכנת עיבוד תמונה (Table of Materials) להתאמת בהירות/ניגודיות כדי להגביר את הבהירות ולשקף עיבוד אמיתי.

6. אופציונלי: ניתוח כמותי של תמלילי היעד

הערה: זהו מאמר שיטות ותוצאות כמותיות אינן מסופקות. שיטת הכימות המוצגת כאן לקוחה מדרלי ואחרים.¹⁰.

1. קבל תמונות מאזורי העניין כפי שמוסבר ב- 5.1 והחל את אותן הגדרות מיקרוסקופ ומצלמה (כגון זמן חשיפה ועוצמת אור) על כל התמונות של אותו פלואורופור.
2. שרטט את הפרופילים העצביים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות (Table of Materials).
3. יישרו את הקטעים עם התייחסות לרמת ברגמה על פי אטלס מוח סטריאוטקסי¹³.
4. החל את אותה בהירות וניגודיות על כל התמונות של אותו פלואורופור. קחו בחשבון רק את תאי העצב עם גרעינים מוכתמים ב-DAPI.
5. ספירה ידנית של מספר mRNA, ביטוי חלבונים, mRNA/mRNA, חלבון/חלבון ותאי mRNA/חלבון המבטאים יחד את האזור המעניין.
6. כדי להפחית את ההטיה בתוצאות הניסוי, בקשו מהאדם המכמת את תוצאות הניסוי להיות עיוור לקבוצות הניסוי.
7. החל תיקון אברקרומבי¹⁴ על ספירת התאים הכוללת באמצעות משוואת אברקומבי הבאה:
   ספירת תאים מתוקנת = ספירת תאים ידנית x עובי מקטע / (עובי מקטע + גודל גרעיני)
   לדוגמה, עבור חתכים בעובי 14 מיקרומטר, הרוחב הגרעיני הממוצע מחושב להיות 7.7 ± 0.3 מיקרומטר ועובי החתך הממוצע הוא 14 ± 1 מיקרומטר בהתבסס על 30 תאים ו-10 חתכים בהתאמה ב-5 בעלי חיים¹⁰. על פי משוואת אברקרומבי, ספירת תאים מתוקנת תהיה ספירת תאים ידנית x 14/(14+7.7).

איור 1: זרימת עבודה מקבילה של שלבי עיבוד מקדים של רקמות הן עבור רקמה קפואה טרייה והן עבור רקמה קבועה פרפורמלדהיד. שלבי עיבוד עבור רקמה טרייה קפואה מוצגים בתיבות המתאר האדומות, ואילו אלה עבור רקמות קבועות של פרפורמלדהיד (PFA) מוצגים בתיבות המתאר הכחולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סיכום של בדיקה משולבת של FISH והליך אימונוהיסטוכימי. לאחר עיבוד מקדים של הרקמה, הרקמה המותקנת במגלשה מוקפת באמצעות עט מחסום הידרופובי, כפי שניתן לראות בפריים הראשון, ומודגרת בתמיסת פרוטאז בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה, הרקמה מועברת לאינקובטור benchtop להכלאה למשך שעתיים לפני שלבי הגברה עוקבים. מערכת ההכלאה באתרה משתמשת בעיצוב 'Z probe' קנייני, קדם-מגברים ומגברים כפי שניתן לראות במסגרות 3-6⁶. לאחר שהרקמה עברה עיבוד בדיקת FISH, היא נשטפת לפני חסימה עם נסיוב סוס רגיל. הדגירה הראשונית של הנוגדנים מתבצעת במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למקסם את קשירת הנוגדנים-אנטיגן. דגירה משנית של נוגדנים (שעתיים) בוצעה בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כאן, אנו מתארים שיטה לשילוב FISH מרובה עם IHC פלואורסצנטי כדי למקם ביטוי mRNA עבור GalR1 ו- GlyT2 באמצעות רקמות קבועות קפואות טריות ופרפורמלדהיד בהתאמה ב- NTS של העכבר. צנרת של תהליכי עיבוד הרקמות, FISH ו-IHC המתוארים בשיטות מוצגת באיור 1 ובאיור 2. טבלה 1 מספקת סיכום של בדיקת FISH ושילובי נוגדנים המשמשים בכל איור.

בדיקות בקרה נבדקות באופן שגרתי במקביל לבדיקת המטרה, כדי להבטיח את שלמות זרימת העבודה ולאשר את איכות הדגימה. היעדר תיוג DapB מאשר את האיכות והשלמות של רקמת הקול, ואת היעדר זיהום חיידקי (איור 3A). תיוג מבדיקות בקרה חיוביות המכוונות ליוביקוויטין C (UBC, שפע גבוה), פפטידילפרופיל איזומראז B (PPIB, שפע בינוני) ו-RNA פולימראז 2a (POLR2A, שפע נמוך) mRNA מאשר את שלמות הרנ"א, והאות שנצפה בין הבדיקות עשוי לשמש לכיול השונות בין הבדיקות (איור 3B). כדי לאמת את ביטוי בדיקת FISH, השתמשנו ברקמות בקרה שתוארו בעבר כדי לבטא את תעתיק ה-mRNA. לדוגמה, ביטוי mRNA GalR1, אושר כחיובי בתלמוס כפי שתואר קודם לכן^10,15. התפלגות Phox2b mRNA אומתה בנוסף על ידי תיוג משותף עם נוגדן Phox2b; אישרנו שתיוג FISH היה קיים רק בתאי עצב שגם הם הוכתמו באופן חיובי באמצעות נוגדן Phox2b (איור 5).

כדי להבחין בין תאי עצב GalR1+ ב-NTS לבין גרעינים שכנים, השתמשנו בסמנים נוירוכימיים נוספים. תגובתיות חיסונית של TH, Phox2b או Phox2b-GFP (איור 4-6), ו-Phox2b FISH (איור 5 ואיור 6) הבדילו את ה-NTS מגרעינים אחרים בגזע המוח הגבי, מאחר שתאי עצב מסוג NTS דווחו בעבר כמבטאים את Phox2b ו-TH ^16,17. מאחר שה-NTS שוכן על-ידי גרעינים כולינרגיים – הוא נמצא גבי לגרעין ההיפוגלוסלי ולגרעין המוטורי הגבי של הואגוס (DMNX), וגחון לגרעין שיווי המשקל – תייגנו יחד עם הסמן הכולינרגי vAChT¹⁸ (איור 4). לכן, הביטוי של GalR1 בתוך NTS הוערך ביחס ל-TH ו-Phox2b, בעוד שתיוג vAChT סייע להתמצאות מרחבית ביחס לקואורדינטות רוסטרוקאודליות, דורסו-ונטרליות ובינוניות. מצאנו שכל תאי העצב החיוביים ל-TH immunoreactive ו-GalR1 mRNA חיוביים ב-NTS היו Phox2b-GFP immunoreactive, אולם לא כל תאי העצב האימונוריאקטיביים Phox2b-GFP ב-NTS היו חיוביים ל-TH immunoreactive או ל-GalR1 mRNA חיובי (איור 4). כמו כן, הדגמנו כי mRNA עבור קולטן השפע הנמוך GalR1 נעדר בתאי עצב אימונוריאקטיביים TH ו-vAChT.

בתכשירים קפואים טריים, בשילוב עם בדיקת FISH, הצלחת IHC הייתה תלויה במיקום התת-תאי של חלבון המטרה. לדוגמה, vAChT (חלבון סינפטי הקשור לקרום השלפוחית) היה בבירור מסומן כחיסון ואילו TH ו-GFP (חלבונים ציטופלזמיים) סומנו ללא הגבלת זמן ונצפו באופן חלש בלבד (איור 4). אנו מתארים את התיוג הבלתי מוגדר הזה כ"פלוקולנטי" מכיוון שלתאים לא היה מתאר ברור והיה קשה להבחין ביניהם לבין הרקע. באותו מקטע של רקמה קפואה טרייה, תיוג הגשושית GalR1 FISH של mRNA ציטופלזמי GalR1 היה מנוקב ונצפה בבירור (איור 4).

יתר על כן, מכיוון שהנוגדנים TH ו- vAChT מועלים באותו פונדקאי, שני החלבונים סומנו באמצעות אותו נוגדן משני ולכן אותו צבע פלואורופור (אור עירור: 594). קל להבחין ביניהם משתי סיבות: הם אף פעם לא מתויגים יחד באותם נוירונים, והלוקליזציה התת-תאית שונה עבור חלבונים אלה; vAChT בשלפוחיות המציגות מראה מנוקב, ו-TH בציטופלסמה ובתהליכים עצביים.

כדי לתמוך בהשערה שלנו שאיכות IHC (בתכשירים טריים קפואים) תלויה בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים, השווינו תיוג עבור Phox2b mRNA (הממוקם בציטופלסמה), GFP (מבוטא יתר על המידה בציטופלסמה) וחלבון Phox2b (המצוי בעיקר בגרעין) בתאי עצב. כצפוי, התוצאות שלנו מראות חפיפה של תיוג נוגדנים Phox2b mRNA, GFP ו-Phox2b בתאי עצב בודדים של NTS (איור 5). תאים עם תיוג mRNA ציטופלזמי התאימו לתאים המציגים תיוג גרעיני של חלבון Phox2b המספק אימות של שיטת FISH-IHC המשולבת. למרות של-Phox2b-GFP ציטופלזמי היה מראה פלוקולנטי, אות חלבון Phox2b גרעיני היה ברור וספציפי. לסיכום, בשילוב עם FISH על תכשירים קפואים טריים, חלבונים הקשורים לקרום, כולל vAChT ו-Phox2B, מציגים תיוג חיסוני באיכות גבוהה יותר מאשר חלבונים ציטופלזמיים.

לעומת זאת, IHC היה אמין ללא קשר ללוקליזציה תת-תאית, כאשר בוצע על מקטעים קפואים קבועים בשילוב עם FISH. Multiplex FISH עבור GlyT2 mRNA ו-Phox2b mRNA היה מוצלח, כפי שניתן לראות באיור 6. תאי עצב חיוביים ל-GlyT2 mRNA היו ממוקמים בגחון ל-NTS ולא בתוך ה-NTS. תאי העצב GlyT2+ ו-Phox2b+ לא עברו לוקליזציה. תת-אוכלוסייה של תאי עצב Phox2b+ NTS הייתה תגובתית ל-TH ואף אחת מהן לא הכילה GlyT2 mRNA. תאי עצב אימונוריאקטיביים מסוג TH נראים באותו אזור רקמה, ומציגים סומא ותהליכים עצביים בעלי תווית חיובית (איור 6). זאת בניגוד למראה ה"פלוקולנטי" של תאי עצב אימונוריאקטיביים מסוג TH בקטעי רקמה קפואים טריים. לפיכך, התכשיר הקפוא הקבוע המתואר כאן הוא שיטה חלופית להכנת רקמות המאפשרת מיקוד אמין של חלבונים ציטופלזמיים באופן אימונוהיסטוכימי, בשילוב עם RNAscope.

איור 3: תמונות מיקרוסקופיות מייצגות מאזורי המוח הקדמי של עכבר העטרה ברמת המחיצה הצידית (Bregma 1.1 עד -0.1) המראות תיוג של בדיקות בקרה חיוביות ושליליות . (A) חוסר אות בעקבות ISH עם 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase חיידקי (DapB) מאשר את היעדר אותות הרקע. (B) תיוג עם בדיקות בקרה חיוביות המכוונות ליוביקוויטין C (UBC), פפטידילפרופיל איזומראז B (PPIB) ו-RNA פולימראז 2a (POLR2A) ממחיש את האות שיש לצפות לו ממטרות שפע גבוה, בינוני ונמוך בהתאמה. מוטות קנה מידה הם 50 מיקרומטר. כל התמונות נרכשו עם מטרה 20x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של חתך גזע מוח טרי מוקפא מעכבר Phox2b-GFP המראות תיוג משולב של GalR1 mRNA (FISH) ו-3 חלבונים (IHC) בגרעין של מערכת העיכול הבודדת (NTS). כניסות ב-A מוגדלות ב-B. GalR1 mRNA מסומן על ידי סימון סימני FISH (ראשי חץ). נוגדנים המכוונים לחלבונים הציטופלזמיים GFP וטירוזין הידרוקסילאז (TH) הציגו תיוג "פלוקולנטי" (חיצים). הודגמה תגובתיות חיסונית של טרנספורטר אצטילכולין שלפוחית (vAChT) בגרעין ההיפוגלוסלי (XII). מוטות קנה המידה הם 100 מיקרומטר ב-A ו-25 מיקרומטר ב-B. כל התמונות נרכשו עם מטרה 20x. קיצורים אחרים: אזור postrema (AP), גרעין שיווי משקל מדיאלי (MVe). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של חתך גזע מוח טרי קפוא של העטרה מעכבר Phox2b-GFP, הממחישות את המיקוד של Phox2b בגרעין מערכת הבידוד (NTS) באמצעות שלוש גישות שונות: Phox2b mRNA (FISH), GFP (IHC) וחלבון Phox2b (IHC). חלבון Phox2b ממוקם בגרעין. כניסות ב-A מוגדלות ב-B. חצים מציינים תאי עצב המסומנים משולשת עם בדיקת Phox2b (כתום-550), נוגדן GFP (ירוק-488) ונוגדן Phox2b (אדום-647). מוטות קנה המידה הם 100 מיקרומטר ב-A ו-25 מיקרומטר ב-B. כל התמונות נרכשות עם מטרה של פי 20. קיצורים אחרים: area postrema (AP). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תמונות מייצגות ממקטעי גזע מוח קפואים קבועים המדגימים FISH מוצלח בשילוב עם תיוג חיסוני אמין של חלבונים ציטופלזמיים (טירוזין הידרוקסילאז [TH]). דג כפול מראה טרנספורטר גליצין 2 (GlyT2-red-647, ראשי חץ מלאים) ו-Phox2b (צהוב-550, חצים) תיוג mRNA בגרעין אזור מערכת הבידוד (NTS). FISH שולב עם IHC עבור חלבון TH (כחול-346, ראשי חץ ריקים). כניסות ב- A מוגדלות ב- B. פסי קנה מידה הם 25 מיקרומטר. כל התמונות נרכשו במטרה של פי 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: בדיקת FISH, נוגדנים ושילובי פלורופורים תואמים המשמשים באיורים 3-6.

במדעי המוח, FISH ו-IHC משמשים באופן שגרתי לחקר הארגון המרחבי והמשמעות התפקודית של mRNA או חלבונים בתוך תת-אוכלוסיות עצביות. הפרוטוקול המתואר במחקר זה משפר את היכולת לזיהוי סימולטני של mRNA וחלבונים במקטעי מוח. בדיקת FISH-IHC המשולבת שלנו אפשרה זיהוי פנוטיפי של תת-אוכלוסיות עצביות מובחנות ב-NTS הן בתכשירים טריים קפואים והן בתכשירים קבועים במוח. FISH-IHC בתכשירי רקמות קפואות קבועות הניבו תוצאות IHC אמינות. לדוגמה, מולטיפלקס FISH עבור mRNA בשפע נמוך וגבוה (GalR1 ו-GlyT2 בהתאמה) ו-IHC (המכוון לטירוזין הידרוקסילאז) גילו כי GalR1 ו-GlyT2 מתבטאים בתאי עצב NTS שאינם קטכולמינרגיים. IHC for TH לא הצליח ברקמות קפואות טריות, מה שהדגיש את היכולת המוגבלת של FISH-IHC בתכשירים קפואים טריים.

ISH עשוי להיות מתאים יותר מאשר IHC במגוון תרחישים. ראשית, IHC עשוי שלא לתפקד היטב בעת גילוי חלבונים בשפע נמוך, כגון קולטנים. שימוש ב-ISH כדי לכוון ל-mRNA בשפע גבוה יחסית עבור חלבונים אלה משפר את יכולת הגילוי¹. שנית, חלבונים כגון נוירופפטידים מועברים לעתים קרובות אל הטרמינלים האקסונליים לאחר תרגומם בתא סומא¹⁹. כאשר נוירופפטידים ממוקדים ב-IHC, התהליכים האקסונליים והטרמינלים של התאים מסומנים עם הנוגדן, אך לא עם הסומה, מה שמקטין את היכולת לזהות את תא המקור או לבצע ניתוח כמותי של מספר התאים. עם זאת, מכיוון ש-mRNA המקודד לכל החלבונים נמצא מקומי לסומה, טכניקת ISH היא יתרון. לבסוף, נוגדנים אינם זמינים עבור מיני חלבונים מסוימים, או שהנוגדנים הזמינים מתאימים לטכניקות פרוטאומיקה אחרות (למשל, כתם מערבי) אך לא IHC. בנסיבות אלה, שיטות תיוג mRNA הוכיחו את יעילותן. אזהרה היא כי mRNA לא תמיד יכול להיות מתורגם לחלבון, ולכן הם רק לספק פרוקסי לזיהוי חלבון. מכיוון שערכות FISH מסחריות יכולות להיות יקרות ובדיקות ISH נוטות פחות להיות זמינות מסחרית בהשוואה לנוגדנים, שילוב FISH עם IHC מציג אסטרטגיה חסכונית וזמן להגדלת מספר המטרות שניתן לתייג בו זמנית.

הכנת רקמות טריות קפואות לעומת רקמות קבועות הייתה גורם שהעניק IHC מוצלח לאחר בדיקת FISH. בדקנו את IHC באמצעות נוגדנים המכוונים לחלבונים גרעיניים, שלפוחיתיים וציטופלזמיים, ומצאנו תיוג אמין של חלבונים הקשורים לקרום (vAChT ו-Phox2b) על דגימות קפואות טריות, אך לא חלבונים ציטופלזמיים (TH ו-GFP). ביטוי משותף של חלבון Phox2b ו-mRNA עם תיוג Phox2b-GFP "פלוקולנטי" אימת שתאי עצב המבטאים את התעתיק ביטאו גם את החלבון הקשור, ואישרו את הזהות הנוירוכימית של תאי העצב (איור 5). לעומת זאת, תכשירי רקמות קפואות קבועות הניבו תיוג IHC אמין ללא קשר ללוקליזציה תת-תאית של האנטיגן. מחקרים קודמים הראו כי פרוטאז (למשל, pronase ^8,20) טיפול מקדים יכול להיות בעל השפעה מזיקה על IHC. תכולת תמיסת הפרוטאז המשמשת בפרוטוקול RNAscope היא קניינית, וחדירה על ידי פרוטאז מומלצת לגישה של בדיקת RNAscope לתאים. תיוג של חלבונים ציטופלזמיים באמצעות הנוגדנים המתוארים כאן אומת בעבר על חלקי מוח עכבר קפואים קבועים של 30 מיקרומטר^צפים חופשיים 10,21,22. הרכבנו דגימות קבועות בעובי 30 מיקרומטר וביצענו את פרוטוקול FISH-IHC, בניגוד למקטעים הקפואים הטריים בעובי 14 מיקרומטר המומלצים על ידי היצרן. בהיעדר שינויים בבדיקה, או שינוי של משתנים אחרים (שליפת אנטיגן, ריכוז נוגדנים גבוה יותר, שינוי פרוטאז), IHC אמין הושג על דגימות עבות וקבועות עם תיוג מוכח של הציטופלסמה ותהליכים אקסונליים יחד עם תיוג בדיקת FISH (איור 6). בעוד שגישות דומות ננקטו על ידי קבוצות מחקר אחרות ^7,8,9, המחקר הנוכחי השיג ISH-IHC משולב על נוירונים ובמערך פלואורסצנטי.

היו שורה של צעדים קריטיים בשיטות שיש לשים לב אליהן. עבור הכנה קפואה טרייה, זמן הקיבוע לא יעלה על 15 דקות; זמני קיבוע ארוכים יותר גרמו לתיוג רקע גבוה יותר. שלב הפרוטאז עבר אופטימיזציה מכיוון שרקמות בעובי שונה ומאיברים שונים דורשות סוגים שונים של פרוטאז כדי להשיג חלחול. חלקים קפואים קבועים נצמדים פחות למגלשות זכוכית ונעקרים בקלות רבה יותר במהלך שלבי השטיפה. לפיכך, יש לנקוט משנה זהירות בטיפול ידני במקטעים קפואים קבועים, כדי למנוע אובדן או נזק לרקמות.

למרות שמצאנו ששילוב של FISH ו- IHC הוא אסטרטגיה יעילה, החסרונות כוללים עלות ובדיקה תובענית מבחינה טכנית בעת שילוב שתי השיטות. מגבלה אחת של המחקר היא שלא בוצעה השוואה זו לצד זו של שני פרוטוקולי הכנת הרקמות. כמו כן, הערכת התוצאות שלנו הוגבלה על ידי מספר הערוצים שהמיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי יכול להכיל; ההתקנה אפשרה מקסימום 4 ערוצים בזמן נתון: 346, 488, 550 ו 647 ננומטר (אור עירור). הצלחנו להשיג תיוג מולטיפלקס של 5 מטרות על-ידי תיוג שני חלבונים עם לוקליזציה תת-תאית שונה באמצעות אותו פלורופור (איור 4, טבלה 1). על ידי שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי, עירור בדיד של פלואורופורים רבים נוספים יכול לשמש לתיוג חלבונים בודדים באמצעות IHC, או להדמיה של מולקולות פלואורסצנטיות המבוטאות על ידי טרנסגנים.

שילוב של FISH ו-IHC פלואורסצנטי יכול להפחית את האמינות של כל טכניקה בנפרד. בעתיד, אנו שואפים לשפר את תיוג החלבון הציטופלזמי על רקמה קפואה טרייה באמצעות טיפול לשליפת אנטיגן²³. מחקרים קודמים הראו כי שליפת אנטיגן המושרה בחום מגדילה את הנגישות של אפיטופ החלבון^24,25,26. טיפול בחום חותך את קבוצות ההצלבות והמתילול של החלבון ופותח את האנטיגנים ברקמות, וחושף אפיטופים שאחרת היו מוסתרים במבנה החלבון השלישוני בתנאים ביולוגיים. נגישות זו עשויה לשפר את ההצלחה של סימון חלבונים^26,27. בנוסף, נתמקד באפיטופים שונים של אותו חלבון ציטופלזמי כדי לקבוע אם ההצלחה של תיוג נוגדנים חלבונים תלויה בשיבוטים הספציפיים של נוגדנים שבהם נעשה שימוש.

לסיכום, שילוב של FISH ו-IHC שימושי לזיהוי נוירוכימי של אוכלוסיות הטרוגניות של תאים במוח, כמו אלה שב-NTS. מחקר זה מציג שני פרוטוקולים הבוחנים תכשירים שונים של רקמת גזע המוח של העכבר - טריים, קפואים או קבועים - לתיוג פלואורסצנטי מולטיפלקס סימולטני של mRNA וחלבונים באתרם. שני הפרוטוקולים עשויים להיות מיושמים באופן נרחב כדי לזהות את דפוס הביטוי של mRNA בשפע נמוך, כגון GalR1. תכשירים קפואים קבועים ועבים (30 מיקרומטר) החדירים בפרוטאז העניקו זיהוי חלבון ציטופלזמי אמין יותר ואתגרים רבים יותר בטיפול ברקמות, בהשוואה לתכשירים קפואים טריים דקים (14 מיקרומטר).

עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט דיסקברי של מועצת המחקר האוסטרלית DP180101890 ומענק פרויקט קרן המחקר הרפואי רבקה ל. קופר PG2018110