Method Article
ניסוחים אבקה יבשה לשאיפה יש פוטנציאל גדול בטיפול במחלות בדרכי הנשימה. לפני הכניסה למחקרים בבני אדם, יש צורך להעריך את היעילות של ניסוח אבקה יבשה במחקרים פרה-קוליניים. מוצגת שיטה פשוטה ולא פולשנית לניהול אבקה יבשה בעכברים דרך המסלול התוך-מסלולי.
בהתפתחות של ניסוחים אבקה יבשה שאיפה, חיוני להעריך את הפעילות הביולוגית שלהם במודלים פרה-קוליניים של בעלי חיים. נייר זה מציג שיטה לא פולשנית של אספקה תוך-צדדית של ניסוח אבקה יבשה בעכברים. מוצג התקן טעינת אבקה יבשה המורכב מקצה פיפט לטעינת ג'ל 200 μL המחובר למזרק של 1 מ"ל באמצעות עצירה משולשת. כמות קטנה של אבקה יבשה (1-2 מ"ג) נטענת לתוך קצה פיפטה ומפוזר על ידי 0.6 מ"ל של אוויר במזרק. בגלל טיפים פיפטה הם חד פעמיים וזולים, ניסוחים אבקה יבשה שונים ניתן לטעון לתוך טיפים שונים מראש. ניסוחים שונים ניתן להעריך באותו ניסוי בעלי חיים ללא ניקוי המכשיר ומילוי מינון, ובכך לחסוך זמן ומבטל את הסיכון של זיהום צולב מאבקה שיורית. ניתן לבדוק את היקף פיזור האבקה על ידי כמות האבקה שנותרה בקצה פיפטה. פרוטוקול של אינטובציה בעכבר עם מקור אור בהתאמה אישית וקנולה מנחה כלול. אינטובציה נכונה היא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על האספקה התוך-סטרית של ניסוח אבקה יבשה לאזור הריאות העמוקות של העכבר.
מסלול הריאות של הממשל מציע יתרונות שונים באספקת טיפולים הן לפעולות מקומיות והן לפעולות מערכתיות. לטיפול במחלות ריאה, ריכוז תרופות מקומי גבוה יכול להיות מושגת על ידי משלוח ריאתי, ובכך להפחית את המינון הנדרש ולהוריד את השכיחות של תופעות לוואי מערכתיות. יתר על כן, פעילות אנזימטית נמוכה יחסית בריאה יכולה להפחית את חילוף החומרים של תרופות מוקדמות. הריאות יעילות גם לספיגת תרופות לפעולה מערכתית בשל שטח הפנים הגדול והחדור היטב, שכבת תאי האפיתל הדקה ביותר ונפח הדם הגבוה בנימים ריאתי1.
פורמולציות אבקה יבשה בשאיפה נחקרו בהרחבה למניעה וטיפול במחלות שונות כגון אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, סוכרת וחיסון ריאתי2,3,4. תרופות במצב מוצק הם בדרך כלל יציבים יותר מאשר בצורה נוזלית, משאפי אבקה יבשה הם ניידים יותר וידידותי למשתמש מאשר nebulizers5,6. בהתפתחות של ניסוחים אבקה יבשה בשאיפה, הבטיחות, הפרופיל הפרמקוקינטי ואת היעילות הטיפולית צריך להיות מוערך במודלים פרה-קוליניים בעלי חיים לאחר מתן ריאתי7. שלא כמו בני אדם שיכולים לשאוף אבקה יבשה באופן פעיל, משלוח ריאתי של אבקה יבשה לבעלי חיים קטנים הוא מאתגר. יש צורך לקבוע פרוטוקול יעיל של אספקת אבקה יבשה לריאות של בעלי חיים.
עכברים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים של בעלי חיים מחקר כי הם חסכוניים והם מתרבים היטב. הם גם קלים לטיפול ומודלים רבים של מחלות מבוססים היטב. ישנן שתי גישות עיקריות לניהול אבקה יבשה לריאה של העכבר: שאיפה וניהול תוך-כיווני. לשאיפה, העכבר ממוקם בתא גוף שלם או אף בלבד שבו אבקה יבשה הוא אירוסול ובעלי החיים לנשום בתרסיס ללא סם8,9. ציוד יקר נדרש ויעילות אספקת הסמים נמוכה. בעוד תא כל הגוף עשוי להיות מבחינה טכנית פחות מאתגר, תא החשיפה לאף בלבד יכול למזער את החשיפה של תרופות לפני השטח של הגוף. ללא קשר, עדיין קשה לשלוט במדויק ולקבוע את המינון המועבר לריאות. האבקה היבשה מופקדת בעיקר באזור nasopharynx שבו סיווג רירי בולט10. יתר על כן, עכברים בתוך התא נמצאים תחת לחץ משמעותי במהלך תהליך הממשל כי הם מוגבלים מקופחים של אספקת מזון ומים11. עבור ניהול תוך-סחיר, זה בדרך כלל מתייחס המבוא של החומר ישירות לתוך קנה הנשימה. ישנן שתי טכניקות שונות כדי להשיג זאת: קנה הנשימה ו אינטובציה orotracheal. הראשון דורש הליך כירורגי שעושה חתך בקנה הנשימה, שהוא פולשני ולעתים רחוקות משמש לניהול אבקה. רק הטכניקה השנייה מתוארת כאן. בהשוואה לשיטת השאיפה, ניהול תוך-סחווי הוא השיטה הנפוצה יותר לאספקה ריאתי בעכבר בגלל יעילות המסירה הגבוהה שלו עם אובדן סמים מינימלי12,13. זוהי שיטה פשוטה ומהירה כדי לספק בדיוק כמות קטנה של אבקה בתוך כמה מיליגרם לעכבר. למרות שהעכבר נבדל אנטומית ופיזיולוגית לבני אדם וההרדמה נדרשת במהלך תהליך הצנרור, ניהול תוך-סחווי עוקף את דרכי הנשימה העליונות ומציע דרך יעילה יותר להעריך את הפעילות הביולוגית של ניסוח האבקה היבשה כגון ספיגת הריאות, הזמינות הביולוגית והאפקטים הטיפוליים14,15.
כדי לנהל אבקה יבשה תוך-אופן, העכבר צריך להיות צנרור, אשר יכול להיות מאתגר. בנייר זה מתואר ייצור של אבקה יבשה בהזמנה אישית ומכשיר אינטובציה. ההליכים של אינטובציה ו insufflation של אבקה יבשה בריאה של העכבר הם הפגינו.
הניסויים שנערכו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לשימוש בבעלי חיים להוראה ומחקר (CULATR), אוניברסיטת הונג קונג. ניסוחים אבקה יבשה שהוכנו על ידי ייבוש הקפאת ספריי (SFD) המכיל 0.5% של RNA שליח לוציפראז (mRNA), 5% פפטיד סינתטי PEG12KL4 ו 94.5% של מניטול (w / w) משמשים במחקר זה כדי להדגים ביטוי mRNA בריאה16. הקוטר האווירודינמי החציוני ההמוני (MMAD) של אבקת SFD הוא 2.4 מיקרומטר. אבקת מניטול מיובשת ספריי (SD) משמשים כדי לחקור את ההשפעה של נפח האוויר המשמש פיזור אבקה16. MMAD של אבקת SD הוא 1.5 מיקרומטר.
1. ייצור של אבקה יבשה אינזלטור והעמסה של אבקה יבשה
2. ייצור של מכשיר אינטובציה
3. אינטובציה
4. ניהול אבקה
כאשר אבקה יבשה insufflator משמש כדי לספק תרסיס אבקה לריאה של בעל חיים, נפח האוויר בשימוש הוא קריטי כפי שהוא משפיע על הבטיחות, כמו גם את יעילות פיזור האבקה. כדי לייעל את השיטה, כמויות שונות של אוויר (0.3 מ"ל, 0.6 מ"ל ו 1.0 מ"ל) שימשו כדי לפזר את האבקה היבשה (1 מ"ג של מניטול מיובש ספריי) ומשקל העכברים היה במעקב במשך 48 שעות לאחר מתן (איור 6). השימוש 0.3 מ"ל ו 0.6 מ"ל של אוויר לא לגרום לירידה במשקל של העכברים עד 48 שעות לאחר הממשל. פיזור האבקה עם 1 מ"ל של אוויר הביא מעל 5% של ירידה במשקל בתוך 24 שעות, אשר לא התאושש באופן מלא לאחר 48 שעות. בפרוטוקול זה, עכברי BALB / c של 7-9 שבועות שימשו. בהתאם למין, המתח והגיל של בעלי החיים, תכונות האבקה (למשל, חלוקת גודל החלקיקים, הלכידות והצפיפות) ומסת האבקה שיש לתת, נפח האוויר שישמש לפיזור אבקה יעיל וסובלנות לבעלי חיים עשויים לדרוש אופטימיזציה על ידי חוקרים למודלים שונים של בעלי חיים.
נוסחת אבקה יבשה שהוכנה על ידי ייבוש הקפאת ספריי (SFD) נמסרה לעכברים בשיטה המתוארת לעיל. ניסוח SFD הכיל 0.5% של mRNA המבטא חלבון לוציפראז, 5% של פפטיד סינתטי כמו וקטור משלוח ו 94.5% של מניטול16. עכברי BALB/c נוהלו תוך-טרה-צ'יאלית עם 1 מ"ג אבקת SFD המכילה 5 מיקרוגרם של mRNA והביטוי לוציפראז בריאות הוערך ב-24 שעות לאחר הניהול באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS)(איור 7). אבקת SFD פוזרו בריאה העמוקה וביטוי לוציפראז נצפתה. לשם השוואה, אבקת SFD הוקמו מחדש ב- PBS (לנפח סופי של 75 μL) ומנוהלים לעכברים כנוזל עם אותו הליך אינטובציה, אך במקום זאת נעשה שימוש במיקרוספרייר כדי ליצור תרסיס נוזלי16. הביטוי לוציפראז של ניסוח מחדש היה גבוה משמעותית מאשר ניסוח אבקה יבשה, אשר יכול להיות בגלל הבעיה פירוק אבקה או פרופיל פרמקוקינטי שונה בין אבקה לצורה נוזלית. המאפיינים ההיסטולוגיים של הריאות שטופלו בתרסיס אבקה יבשה mRNA הושוו עם שליטה לא מטופלת ו lipopolysaccharide (LPS) קבוצות שטופלו (איור 8). הריאות ללא כל טיפול המחישו מצגת בריאה בעוד הריאה שטופלה ב -10 מיקרוגרם של LPS תוך-תאי הראתה התפלגות לא סדירה של מרחב האוויר וחדירת תאים דלקתיים לחללים הבין-כוכביים והמכתשיים. הריאות שטופלו באבקת SFD לא הראו סימנים לדלקת.
איור 1: מחסן אבקה יבשה בהזמנה אישית.
(A)אבקה ארוזה ליד הקצה הצר של הקצה. (B)קצה פיפטה לטעינת ג'ל מחובר למזרק של 1 מ"ל באמצעות עצירה משולשת. הדמות מותאמת מ ליאו ואח '21. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מקור אור בהזמנה אישית עבור אינטובציה.
סיב אופטי גמיש מחובר לפיד LED על ידי יצירת חור קטן על העדשה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הצינורית המנחה.
(A)פיפט פסטר פלסטיק 1 מ"ל משמש להכנת צינורית מנחה. (B)פיפטה מרוככת על ידי חימום. (ג)פיפטה מחוממת נמתחת וחתוכה. (ד)חלק א' של הפיפט משמש כ-pipette עדין. (E&F) חלק ב' של הפיפט משמש כקנולה מנחה. מסגרת משופעת נוצרת כדי להקל על פרוצדורת אינטובציה. פתח קטן (אופציונלי) יכול להתבצע כדי להגדיל את הגמישות של הצינורית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פלטפורמת אינטובציה.
(A)הפלטפורמה לצנרור מורכבת מלוח פרספקס המותקן על מעמד. (B)עכבר מורדם ממוקם על הרציף בתנוחה סופית, מושעה על ידי חיבור החותכות שלו עם חוט ניילון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דיאגרמה סכמטית הממחישה את פרוצדורת הצנרור.
(A) שפוע הצינורית המנחה מיושר עם קו האמצע של פתח קנה הנשימה. (B)הצינורית המנחה מוכנסת לקנה הנשימה ומוכנה לניהול אבקה. (C)הקצה טעון האבקה (מחובר למזרק דרך עצירה משולשת) מוכנס לתוך הצינור המנחה שכבר הונח בקנה הנשימה של העכבר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניהול תוך-סחירי של אבקה יבשה עם נפח אוויר שונה.
עכברי BALB/c נוהלו תוך-סחיר עם אבקת מניטול מיובשת ספריי (SD) מפוזרת על ידי 0.3 מ"ל, 0.6 מ"ל ו 1.0 מ"ל של אוויר. משקל הגוף של העכברים היה במעקב לפני הממשל וב 18 שעות, 24 שעות ו 48 שעות לאחר הממשל. הנתונים הוצגו כערך ממוצע של אחוז שינוי המשקל (n = 2). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניהול תוך-סחיר של ניסוח mRNA כאבקה יבשה ותרסיס נוזלי משוחזר.
עכברי BALB/c נוהלו תוך-סחיר עם תרסיס להקפיא מיובש (SFD) 0.5% mRNA (לוציפראז) ניסוח כמו תרסיס אבקה (1 מ"ג) באמצעות תרסיס אבקה יבשה בהתאמה אישית או תרסיס נוזלי מחדש (1 מ"ג ב 75 μL PBS) באמצעות microsprayer. כל עכבר קיבל מנה של 5 מיקרוגרם של mRNA. PBS (75 μL) שימש כפקד. בשעה 24 שעות לאחר הממשל (A) הריאות היו מבודדות להדמיית ביולומינציה; (B) נמדד ביטוי חלבון לוציפראז של רקמות הריאה. הנתונים באו לידי ביטוי כערך הממוצע של יחידת אור יחסית (RLU) לכל מ"ג חלבון, שנותחה על ידי ANOVA חד כיווני ואחריו הבדיקה שלאחר הוק של Tukey, ***p < 0.001 (n = 4). הדמות מותאמת מ- Qiu et al.16. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: היסטולוגיה של הריאות של עכברים בעקבות ניהול תוך-טראציאלי של ניסוח אבקה יבשה mRNA.
(A)שליטה לא מטופלת; עכברים היו מנוהלים תוך-סחיר עם (B) LPS (10 מ"ג ב 25 μL PBS), ו - (C) להקפיא אבקת mRNA מיובש (1 מ"ג). שקופיות נצפו באמצעות מיקרוסקופ זקוף בהגדלה של פי 20 (סרגל קנה מידה = 100 מ"מ). הדמות מותאמת מ- Qiu et al.16. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בנייר זה, מכשירים בהתאמה אישית עבור זלוף אבקה יבשה אינטובציה תוך-צ'יאלי מוצגים. בשלב טעינת האבקה, אבקה יבשה נטענת לקצה פיפטה 200 μL טעינת ג'ל. חשוב להקיש בעדינות על הקצה כדי לאפשר אריזה רופפת של אבקה בקצה הצר של הקצה. עם זאת, אם האבקה ארוזה חזק מדי, הם ייתקעו בקצה ולא ניתן לפזר כראוי. מומלץ לנטרל את הטעינה הסטטית של האבקה ואת קצה פיפטה על מנת להקל על טעינת אבקה, במיוחד עבור אבקה עם צפיפות נמוכה ולחות יחסית נמוכה. הצינורית המנחה היא מרכיב קריטי בהתקן. הוא משמש כדי להקל על הצנרור של קצה פיפטה טעון אבקה לתוך קנה הנשימה של העכבר. קוטר הצינורית המנחה לא צריך להיות רחב מדי; אחרת יהיה קשה להכניס אותו לקנה הנשימה ועלול לפגוע בעכבר. קוטר הצינורית המנחה צריך להיות רחב מספיק כדי להתאים לסיבים האופטיים ולטיפה פיפטה טעונה אבקה, ואת קצה פיפטה צריך לבלוט את הצינור המנחה על ידי כ 1-2 מ"מ.
היכולת לדמיין את פתיחת קנה הנשימה היא חיונית בתהליך הצנרור, ומאפשרת להכניס את הצינורית המנחה כראוי. פתח קנה הנשימה מורכב סחוס אריטנואיד לבן עם פתיחה קבועה ותנועת סגירה בחלק האחורי של הגרון. עם תאורת הסיבים האופטיים, ניתן היה לדמיין בקלות את פתיחת קנה הנשימה. על ידי נשיפת נפח זעיר של אוויר דרך פיפטה פלסטיק קצה דק, אינפלציה בחזה מצביע על צנרור נאות. אם האינפלציה בחזה אינה נצפית או שההתנגדות מורגשת במהלך הכניסה, חזור בו מהקנולה המנחה במהירות וחזור על השלבים שוב.
היה בשימוש נרחב מסחרית אבקה יבשה insufflator12,17,18 (שולחן החומרים;מכשיר זה הופסק כעת). האבקה היבשה נטענת לתא הדגימה של המכשיר ומפוזרת באוויר ממזרק אוויר מפלסטיק 3 מ"ל או משאבת אוויר. כדי למדוד את המינון הנפלט, המכשיר צריך להיות שקל לפני ואחרי ניהול אבקה, מה שמוביל לאי דיוק בהתחשב במינון של אבקה הוא בדרך כלל קטן מאוד (יחסית למסה של המכשיר). בהשוואה לאי ספיקה מסחרית, היתרון הגדול ביותר של המכשיר בהתאמה אישית הוא כי ההצלחה של פיזור אבקה ניתן לראות על ידי היעדר אבקה טיפים פיפטה טעינת ג'ל שקוף. מאז קצה פיפטה הוא אור, זה יכול גם להישקל במדויק לפני ואחרי הממשל כדי למדוד את המינון הנפלט. קצה פיפטה מוכנס לתוך הצינור המנחה במקום להיחשף לקנה הנשימה של החיה. קיים סיכון מינימלי לזיהום הקצה בלחות או בהפרשה בקנה הנשימה (מה שעלול להשפיע על הדיוק של מדידת המינון הנפלט). כמו טיפים פיפטה הם חד פעמיים וזולים, ניסוחים שונים אבקה יבשה ניתן לטעון לתוך טיפים שונים מראש. ניסוחים שונים ניתן להעריך באותו ניסוי בעלי חיים ללא צורך ניקוי המכשיר ומילוי מינון, ובכך לחסוך זמן ומבטל את הסיכון של זיהום צולב מאבקה שיורית. יתר על כן, דפוס פיזור האבקה שנוצר על ידי insufflator מסחרי השתנה בין ניסוחים שונים. מספר מחקרים דיווחו כי אבקה יבשה מפוזרת על ידי insufflator מסחרי היו בקלות agglomerated ולא הצליחו להגיע לריאה העמוקה על הממשל19,20. לעומת זאת, ניסוחים אחרים מפוזרים על ידי מכשירים דומים לשלנו מדווחים יש תצהיר ריאות גבוה15,21,22.
ישנם מכשירים דומים אחרים בהתאמה אישית שדווחו בספרות לניהול תרסיס אבקה לריאה של בעלי חיים. לדוגמה, Chaurasiya et al. תיאר את השימוש בצינור קנולה לצנרור, כמו גם טעינת אבקה, עם מזרק המחובר לצינור הצינור קנולה לאחר צנרור לפיזור אבקה23. בעוד הגישה שלהם משתמשת בציוד סטנדרטי וחומר (למשל, אוטוסקופ, קנולה ומזרק) עם פחות התאמה אישית, השיטה כאן מציעה כמה יתרונות ברורים. ראשית, זה מאפשר אישור של אינטובציה נכונה לפני מתן תרופות. שלב זה שימושי במיוחד עבור משתמשים פחות מנוסים. שנית, הצינורית המנחה יכולה לשמש כמגן הגנה כדי למנוע כל הפרשה או לחות בקנה הנשימה מלזהם את קצה פיפטה טעינת הג'ל, המאפשר מדידת מינון פולט מדויקת יותר על ידי שקילה. לבסוף, הצינורית המנחה הגמישה יותר יחד עם הסיב האופטי עשויה לאפשר צנרור קל יותר.
לסיכום, אבקה יבשה בהתאמה אישית insufflator שהוא זול, חד פעמי, לשחזור ויעיל בפיזור כמות קטנה של אבקה בדיוק הוא הציג בנייר זה. תהליך הצנרור שהוזכר אינו פולשני, מהיר ויכול לספק ניסוחים אבקה לעכברים בבטחה ובדייקנות. זה יכול גם להיות מאומץ כדי לנהל ניסוח נוזלי עבור משלוח ריאתי.
המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
המחברים רוצים להודות למר ריי לי, מר HC ליונג ומר וואלאס אז על עזרתם האדיבה בהפיכת מקור האור ואבקת insufflator; ומתקן הליבה של הפקולטה לסיוע בהדמיה של בעלי חיים. העבודה נתמכה על ידי מועצת מענק המחקר, הונג קונג (17300319).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BALB/c mouse | Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g | ||
CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
Dry Powder Insufflator | PennCentury | Model DP-4M | |
Ketamine 10% | Alfasan International B.V. | NA | |
Light emitting diode (LED) torch | Unilite Internation | PS-K1 | |
Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL) | Labcon | 1034-800-000 | |
Nylon floss | Reach | 30017050 | |
One milliliter syringe without needle | Terumo | SS-01T | |
Optical fibre | Fibre Data | OMPF1000 | |
PEG12KL4 peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
Plastic Pasteur fine tip pipette | Alpha Labotatories | LW4061 | |
Three-way stopcock | Braun | D201 | |
Xylazine 2% | Alfasan International B.V. | NA | |
Zerostat 3 anti-static gun | MILTY | 5036694022153 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved