3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים

3d-DNA דגים ססגוניות מייצג כלי להמחיש המקום גנומית מרובים בתוך גרעיני תלת-ממד משומרים, חד משמעית הגדרת אינטראקציות הדדית שלהם לוקליזציה בתוך החלל הגרעיני ברמת תא בודד. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור קשת רחבה של תאים ראשוניים אנושיים.

השאלה העיקרית בביולוגיה התא הוא ארגון גנומית בתוך החלל הגרעיני וכיצד אדריכלות כרומטין יכול להשפיע על תהליכים כגון ביטוי גנים, זהות תא ובידול. גישות רבות שפותחו כדי ללמוד את ארכיטקטורת 3D של הגנום ניתן לחלק לשתי קטגוריות משלימות: לכידת כרומוזום טכנולוגיות מבוססות לכידה (C-טכנולוגיות) והדמיה. בעוד הראשון מבוסס על לכידת קונפורמציה כרומוזום ואינטראקציות DNA האבובית באוכלוסייה של תאים קבועים, האחרון, מבוסס על הזריחה DNA באתרו היברידיזציה (דג) על גרעיני תלת-ממד, מאפשר הדמיה עכשווית של הילה מרובים ברמת תא בודד (ססגוניות), בחינת האינטראקציות שלהם והפצה בתוך הגרעין (3d דג DNA מרובה צבעים). הטכניקה של 3D דג ה-DNA מרובת צבעים יש מגבלה של המחשה רק כמה מראש מראש, לא מאפשר ניתוח מקיף של האדריכלות הגרעינית. עם זאת, בהינתן את החוסן של תוצאותיה, 3D מרובת צבעים דג DNA בשילוב עם 3D-מיקרוסקופיה ושחזור תמונה היא שיטה אפשרית כדי לאמת את התוצאות C-טכנולוגיה מבוססת לחקור באופן משמעי את המיקום והארגון של המקום המסוים ברמת תא בודדת. כאן, אנו מציעים צעד אחר צעד שיטה של 3D מרובת צבעים דג DNA מתאים למגוון רחב של תאים הראשי האדם ולדון בכל הפעולות המעשיות, צעדים מכריעים, מושגים של 3D הדמיה וניתוח נתונים הדרושים כדי להשיג מוצלח אינפורמטיבי 3D תלת-צבעי דגי דנ א בתוך הקשרים ביולוגיים שונים.

Eukaryotes גבוה יותר צריך לדחוס באופן שיטתי וקומפקטי כמות עצומה של מידע גנטי ברגע 3d החלל של הגרעין^1,2,3,4. היום, אנו יודעים כי הגנום הוא מרחב הורה בתאים ותחומים הקשורים טופולוגית⁵ וכי רמות מרובות של קיפול DNA ליצור קשרים בין אזורים גנומית שונים שעשויים לכלול לולאה כרומטין היווצרות^6,7. הלולאה הדינמית 3d של כרומטין יכול להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים שונים כגון שעתוק^8,9, בידול ופיתוח^10,11, DNA תיקון^12,13, בעוד רטבאליות שלה מעורבים במחלות שונות^14,15,16 ופגמים התפתחותיים^15,17,18.

גישות רבות פותחו כדי ללמוד את ארגון הגנום 3D. היווצרות כרומוזום טכנולוגיות מבוססות לכידת (C-טכנולוגיות, 3c, 4c, 5c, היי-C ונגזרים) פותחו כדי ללמוד ארגון הגנום בתאים קבועים^3,4,19,20. גישות כאלה מבוססות על היכולת ללכוד את תדרי המגע בין הרוח גנומית בסמיכות פיזית. C-טכנולוגיות, בהתאם למורכבות שלהם, לתפוס את הארגון הגלובלי 3d הגנום וטופולוגיה גרעינית של אוכלוסייה תא^3,4,19,20. עם זאת, אינטראקציות תלת מימד הן דינמיות בזמן ובמרחב, משתנה מאוד בין תאים בודדים המורכב מאינטראקציות של מולטיפלקס, והן הטרודוגני בהרחבה^21,22.

3D מרובה הקרינה הפלואורסצנטית DNA באתרו היברידיזציה (דג) היא טכניקה המאפשרת ויזואליזציה של גנומית ספציפיים ברמת תא בודד, המאפשר חקירה ישירה של האדריכלות הגרעינית 3D בצורה משלימה C-טכנולוגיות. היא מייצגת טכנולוגיה המשמשת כיום לאימות בלתי משמעי של תוצאות C. 3D-DNA דגים מרובי צבעים משתמש בדיקות באמצעות פלואורוסקופים המשלימים את הרוח גנומית של אינטרסים. השימוש fluorophores שונים וציוד מיקרוסקופ מתאים לאפשר הדמיה עכשווית של מטרות מרובות בתוך החלל הגרעיני^23,24. בשנים האחרונות, הדגים שולבו עם פיתוחים טכנולוגיים במיקרוסקופיה כדי להשיג את ההדמיה של מבנים בקנה מידה משובח ברזולוציה גבוהה^25,26 או עם הגישות crispr-Cas עבור ההדמיה של חומצות גרעין ב הדמיה חיה^27,28. למרות אימוץ רחב, 3D מרובת צבעים הגישה דג DNA הוא עדיין נחשב קשה במעבדות רבות כי החומר הביולוגי המשמש חייב להיות מותאם.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף עבור 3D דג ה-DNA דגים (מתא/בדיקה הכנה לניתוח נתונים) החלים על מגוון רחב של תאים ראשוניים אנושיים, המאפשר ויזואליזציה של גנומית מרובים ושמירה על מבנה 3D של גרעינים. כדי ללמוד אדריכלות גרעינית, המבנה התלת-ממדי של גרעיני חייב להישמר. מסיבה זו, מנוגד פרוטוקולים קיימים אחרים^29,30,31, אנו נמנעים מהשימוש במעבר אלכוהול ואחסון של שמיכות באלכוהול שיכולים להשפיע על מבנה כרומתין³². השיטה מותאמת מפני שנשמרו 3d DNA הפרוטוקולים דגים^24,33 להיות מוחל על מגוון רחב של תאים ראשוניים אנושיים, הן מבודדות לשעבר vivo או תרבותי בתחום החוץ. יש החדירות ואת הפרמטרים הדפרוטמולוגיה עבור המאפיינים הגרעיניים שונים ומאפיינים ציטולוגיים (למשל, דרגות שונות של דחיסה גרעינית, שפע השלד ציטומה)³⁴. פרמטרים אלה מתוארים בדרך כלל בפרוטוקולים אחרים^24,33, מבלי לספק אפליה ברורה של ההליך בתוך סוגי תאים שונים. יתר על כן, פיתחנו כלי ספציפי בשם NuCLεD (מאתר הקשר הגרעיני ב 3D)¹⁶, מתן עקרונות לניתוח נתונים שישפרו את הקירבה 3d בין המקום האחר ואת התפלגות טופולוגית הגרעינית שלהם בתוך החלל הגרעיני באופן אוטומטי.

1. הכנה לבדיקת דנ א והליכי תיוג עם ניק תרגום

1. לטהר ולנקות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACs), פלמידים או מוצרי PCR עם ערכות ספציפיות (טבלה של חומרים), להשעות מחדש ב ddh₂O, בדוק על ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose וככמת.
2. לבצע את התרגום ניק על 1.5 ליטר 2 μg של ה-DNA משלב 1.1 בנפח הסופי של 50 μL על ידי ערבוב כל ריאגנטים ב 0.5 mL מחייב נמוך שפופרת DNA לפי לוח 1.
   הערה: בדיקה מתויג ישירה יכולה לשפר את האות ליחס הרעש. ערכות לייצר בעקיפין ובאופן ישיר מתויג בדיקה עם מגוון fluorochromes אלקסה על ידי ניק תרגום הם מסחרית זמין.
3. שילוב התרגום ניק במיקסר תרמית ב -16 ° c במשך זמן תלוי באורך של חומר ה-DNA המתחיל: 45 דקות עבור מוצרי PCR (בריכה של מוצרי PCR של 2,000 bp כל אחד) ועד 4 h עבור ה-DNA BAC ו פלמידים.
4. בדוק את הגודל של הגששים המיוצרים בשלב 1.3 על ידי אלקטרופורזה ב 2.2% agarose ג'ל.
   הערה: גודל הבדיקה האופטימלי הוא < 200 bp (איור 1א).
   1. אם ה-DNA לא מתעכל מספיק, להוסיף 5 U של ה-DNA פולימראז I ו 0.05 U של DNase אני לתגובה ואת הדגירה עבור 1-2 על 16 ° c ולאחר מכן לבדוק מחדש. להפסיק את התגובה עם 0.5 mM EDTA (הריכוז הסופי). החנות חוקרת ב-20 ° c.
5. עבור כל ניסוי ה-DNA דגים, מזרז את הכמויות הבאות של הגששים בהתאם החומר ההתחלתי DNA שממנו הבדיקות מיוצרות: 200 ng מתוך ניק מתורגם מוצרים PCR, 100 ng מתורגם על ידי ניק, או 300 ng מתורגם ניק באמצע. הוסף ddH₂O עד 150 μl, 20 ΜG של דנ א ללא התווית של זרע סלמון, 3.5 μg של מינים ספציפיים עריסה-1 dna, 3 כרכים של 100% אטוח, ו 1/10 נפח של 3 M סודיום אצטט pH 5.2. שייט בגובה-80 ° c.
6. צנטריפוגה במהירות מקסימלית עבור 1 h ב 4 ° c ולמחוק את הסופרנטאנט. רחץ את הגלולה פעמיים עם 70% אטוח.
7. השהה מחדש את הגלולה ב 2 μL של 100% מתוך מערך pH 7.0, לנער ב-40 ° צ' עבור 30 דקות (יכול להימשך עד כמה שעות) ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של 4x מלוחים-נתרן ציטראט (למעלה)/20% דקטרן סולפט.
   1. הכינו 20 x למטה על ידי ערבוב 175.3 g של נרוג ו 88.2 g של נתרן ציטראט בנפח הסופי של 1 L של H₂O. אוטוקלב, לסנן ולהכין.
      הערה: עבור דג ה-DNA ססגוניות, הבדיקות השונות יכול להיות זירז יחד למעט בדיקות כי יכול להיות אחד עם השני. במקרים ספציפיים אלה, התייחס אליהם בנפרד, מזרז ומשהה את הבדיקות המופרשות את הריאגנטים המוזכר בצעדים 1.5-כ-1.7 ביחס למספר הבדיקות. מאגר הבדיקות רק לאחר. השעיה מחדש בטופסיית אם שמיכות זכוכית גדול יותר מ 10 מ"מ או פחות מ 10 מ"מ משמשים, למעלה/למטה את עוצמת הקול של הריאגנטים המשמשים בשלבים 1.5 ל-1.7 באופן פרופורציונלי לגודל השקופית. ניתן לאחסן בדיקה היברידיזציה ב-20 ° c למשך פרק זמן ארוך (עד חודשיים).

2. קיבוע תא, טרום טיפול וחדירות

הערה: הפרדעת ומעברים באמצעות המלחה הם צעדים קריטיים. הזמן של התגובה והריכוז של הריאגנטים תלוי מאוד בסוג התא, שפע הציטופלסמה, ואת המבנה הגרעיני.

1. קיבוע התא, טרום טיפול וחדירות לימפוציטים האדם העיקרי T
   הערה: פרוטוקול זה מתאים לתאים קטנים, עם גרעינים קטנים וכמות נמוכה של ציטופלסמה.
   1. השימוש שמיכות זכוכית (10 מ"מ, עובי לא 1.5 H).
   2. שטוף את הזכוכית עם ddH₂O, ואז עם 70% אטוח ולתת להם להתייבש. השתמש בזכוכית אחת לכל טוב של צלחת 24 שעות ביממה.
   3. הוסף 200 μL של 0.1% פולי-L-ליזין (w/v) (טבלת חומרים) ישירות על הזכוכית כדי ליצור טיפה. שים לב כאשר הירידה חייבת להישאר על פני הזכוכית מבלי לגעת היטב עבור 2-5 דקות. לעזוב את הירידה בזהירות, ולתת את הזכוכית יבש 30 דקות.
   4. בצע את השלב 2.1.3 פעמיים יותר.
   5. שים 200 μL של תאים ההשעיה (2 x 10⁶/mL, השעיית PBS של לימפוציטים vivo לשעבר הראשי T) ישירות על הזכוכית, לאפשר את התאים לזרעים בטמפרטורת החדר (RT) עבור 30 דקות.
   6. הסר במהירות את המסירה. הוסף טרי שנעשו 4% בכיוון הבית (הוכן ב PBS/0.1% הרצף 20, pH 7.0, מסונן) עבור 10 דקות ולתקן את התאים הנזרע ב RT.
   7. כביסה שלוש פעמים עבור 5 דקות כל אחד עם 0.05% טריטון X-100/PBS (TPBS) ב-RT. החדירות עם 0.5% TPBS עבור 10 דקות ב RT.
   8. ביצוע טיפול RNase על-ידי הוספת 2.5 μL של קוקטייל RNase (טבלת חומרים) ב 250 ΜL של PBS/ובכן בצלחת 24-הטוב עבור 1 h ב 37 ° c.
   9. לשטוף ב-PBS, להוסיף 20% גליצרול/PBS, ו דגירה לילה (ב) ב 4 ° c.
      הערה: שלב זה יכול לנוע בין 1 h ל-ON. שקופיות ניתן לשמור ב 20% גליצרול/PBS ב -4 ° c עד 7 ימים.
   10. תוכלו להקפיא את הקרח היבש (15-30), להפשיר בהדרגה ב-RT, ולטבול ב -20% גליצרול/PBS. חזור על השלב 2.1.9 עוד שלוש פעמים.
   11. לשטוף ב 0.5% TPBS עבור 5 דקות ב-RT. לשטוף ב 0.05% TPBS, פעמיים עבור 5 דקות ב RT. מודרט ב 0.1 N HCl עבור 12 דקות ב-RT. שטוף ב-2x המטה.
   12. מודטה ב 50% מתוך למעלה pH 7.0/2x בבית המלון בשעה RT.
       הערה: זמן הדגירה יכול להיות אופטימיזציה ובסופו של דבר מופחת. ניתן לשמור על שקופיות ב-50% בטופסיום מספר ימים.
2. קיבוע התא, טרום טיפול והפריית לאורך החיים הראשי של האדם
   הערה: פרוטוקול זה מתאים לתאים גדולים, עם כמות גבוהה של ציטופלסמה.
   1. הגדל האדם העיקרי myoblasts חזיקה ישירות על משקפי שמיכות ב 24-טוב צלחות בינונית צמיחה (מדיום הנשר שונה של דולבco (DMEM), 20% סרום עוברי העובר (FBS), 25 ng/mL פיברופיצוץ גורם גידול (FBS), 10 ng/mL מקדם גידול באפידרמיס (EGF), 10 μg/mL אינסולין אנושי, 1x גלוטמין, סטרפטומיצין x פניצילין/משחק) עבור לפחות 24 h (להגיע 50-70% של המפגש).
      הערה: כדי להקל על הדבקה, ג'לטין או קולגן או פולי-L-ליזין ניתן להשתמש כדי לחלוק את הכיסויים לפני הזריעה.
   2. לשטוף את התאים 2-3 שינויים של PBS. להוסיף טרי שנעשו 4% כלגון ולתקן את התאים עבור 10 דקות ב RT.
   3. כביסה שלוש פעמים עבור 3 דקות כל אחד ב 0.01% TPBS ב RT. החדירות ב 0.5% TPBS עבור 10 דקות ב RT.
   4. ביצוע טיפול RNase על-ידי הוספת 2.5 μL של קוקטייל RNase (טבלת חומרים) ב 250 ΜL של PBS/ובכן בצלחת 24-הטוב עבור 1 h ב 37 ° c.
   5. לשטוף ב-PBS, להוסיף 20% גליצרול/PBS, ו דגירה ב RT.
      הערה: שלב זה יכול לנוע בין 1 h ל-ON. שקופיות ניתן לשמור ב 20% גליצרול/PBS ב -4 ° c עד 7 ימים.
   6. תוכלו להקפיא את הקרח היבש (15-30), להפשיר בהדרגה ב-RT, ולטבול ב -20% גליצרול/PBS. . חזור על השלב הזה שלוש פעמים
   7. לרחוץ שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד ב-PBS. מודטה ב 0.1 N HCl עבור 5 דקות ב RT. לשטוף ב-2x מהאס.
   8. מודטה ב 50% מתוך למעלה pH 7.0/2x בבית המלון בשעה RT.
      הערה: הזמן של דגירה יכול להיות אופטימיזציה ובסופו של דבר מופחת. ניתן לשמור על שקופיות ב-50% בטופסיום מספר ימים.
   9. שקופיות שמיתיות (מוחזקים ב-50% למעלה/2x) ב-2 לדקה ואז, באמצעות שיווי משקל. בערוץ הPBS במשך 3 דקות
   10. התייחס עם 0.01 N HCl/0.0025% פפסין ממספר שניות עד 5 דקות, בהתאם לסוג התא. במהלך שלב זה, להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ אופטי להפסיק את התגובה (שלב 2.2.11) ברגע הגרעינים הם חופשיים מן הציטופלסמה, תוך שמירה על המבנה שלהם ללא פגע (למשל, נוקלאופולי עדיין גלויים ושלמים).
   11. הפוך את פפסין על ידי שטיפת פעמיים עבור 5 דקות כל אחד 50 mM mgcl₂/PBS.
   12. לאחר התיקון ב 1% בכיוון הערוץ/PBS עבור 1 דקות. לשטוף עבור 5 דקות ב-PBS. כביסה פעמיים עבור 5 דקות כל אחד ב-2 x למטה, ולאחר מכן להוסיף 50% מתוך הטופס2 לפחות 30 דקות.

3.3D היברידיזציה דג ה-DNA דגים

1. . ולאחר מכן לשים במהירות על קרח 80
2. העמיסו את הגששים. במיקרוסקופ נקי הפוך את הכיסויים עם התאים למטה על טיפת בדיקה היברידיזציה.
3. . אטום את הסרבל עם מלט גומי הרשו לבטון הגומי להתייבש לחלוטין. לאחר מכן הניחו שקופיות על בלוק חימום והטמפרטורה ב-75 ° c עבור 4 דקות.
   הערה: העיתוי של הדנטורציה והטמפרטורה של הדנטורציה יכול להיות מוגבר, עד 80 ° c.
4. Hybridize ב 37 ° c על בקופסה מתכתית צף באמבט מים.
   הערה: כדי לשפר את יחס הרעש, טמפרטורת ההכלאה יכולה לעלות עד 42 ° c.
5. לקלף את מלט גומי, לטבול את השקופיות ב-2x SCC, להסיר את שמיכות הזכוכית ולהעביר אותו 2x למטה למטה ב 6-טוב צלחת.
6. כביסה ב-2 מעלות למטה השנייה 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד ב 37 ° c, רועד ב 90 סל ד בשייקר חממה. לשטוף ב 0.1 x למטה המידע שלוש פעמים עבור 5 דקות כל אחד ב 60 ° c, רועד ב 90 סל ד בשייקר חממה. שטפו בקצרה ב-4% מהאס.

4.3D מרובת צבעים זיהוי דגים DNA

הערה: לבדיקות המסומנת באופן ישיר, דלג על שלבים 4.1 ו-4.2.

1. בלוק ב-4 x למעלה/0.2% ה20/4% סרום (BSA) במשך 20 דקות ב 37 ° c בצלחת 24-באר, רועד ב 20 סל ד בתוך שייקר חממה.
2. דגירה עם הריכוז המתאים של anti-digoxygenin (1:150), ו/או streptavidin (1:1000) (הטבלה של חומרים) מדולל ב-4x למטה/0.2% הרצף 20/4% bsa עבור 35 דקות בחדר חשוך ורטוב בשעה 37 ° c.
3. לשטוף ב 4x למטה ליבריס/0.2% רצף 20 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד ב 37 ° c, רועד ב 90 rpm בצלחת 6-היטב ב שייקר חממה.
4. השפה ב-PBS ו לאחר תיקון ב 2% פורמלדהיד/PBS עבור 2 דקות ב RT בצלחת 24-באר.
   הערה: הבדיקות המסומנת באופן ישיר אינן זקוקות ללאחר קיבוע.
5. לשטוף בקצרה 5x ב-PBS. כתם עם 1 ng/mL DAPI (4, 6-diamidino-2-פניינילידול)/PBS עבור 5 דקות ב RT.
6. לשטוף בקצרה 5x ב-PBS. הר עם פתרון לדעוך (טבלת חומרים).

5.3D מיקרוסקופיה וניתוח דגי DNA מרובי צבעים

1. לרכוש תמונות תלת-ממד עם מערכת מיקרוסקופ.
   הערה: כאן משתמשים במיקרוסקופ רחב עם מרחק של 0.2-0.25 יקרומטר בין מקטעים רציפים (איור 1ב).
2. ניתוח אוספי תמונות תלת-ממדיים באמצעות תוכנה וכלים שונים (כאן, NuCLεD או מאתר אנשי קשר גרעיניים ב-3D).
   הערה: הכלי NuCLεD פותחה כדי לנתח באופן אוטומטי 3D בצבעי DNA דגים בתמונה תא הזריחה z-ערימות. NuCLεD משחזר את הגרעינים מערימות התמונה התא ב-3D, כמו גם מזהה ולוקליזציה כתמים 3D פלורסנט. הוא מודד את המיקום היחסי של נקודות בגרעין (למשל, מרחק מן הסנטאיד של הגרעינים ו/או הפריפריה של הגרעינים) ואת הרדיוס המקסימלי עבור כל גרעין ומרחקים בין-מקומות. הכלי והאלגוריתם המשמשים מתוארים במלואו ב-Cortesi et al.¹⁶.
3. לנתח את הנתונים (למשל, מרחקים 3D בין הדרך הגנומית שצוין לבין הסנטאיד הגרעינית תדרי המגע) שאוחזרו על ידי NuCLεD.
   הערה: למרחקים תלת-ממדיים בין האזור הגנומי שצוין לבין הסנטאיד הגרעיני, לנרמל את המרחקים על הרדיוס המקסימלי עבור כל גרעין ולייצג נתונים אלה כהפצות תדירות של מרחקים מנורמלת מסנטאיד הגרעיני. למחקרים ארוכי טווח של אינטראקציות, תדרי מגע אמורים להיות בטווח של 10-20%²¹ עם מרחק הסף שיכול להשתנות וניתן לשים סביב 2 יקרומטר³⁵.
   1. כדי לבצע ניתוח סטטיסטי, לנתח כ 100 גרעינים לכל שכפול ביולוגי. מייצגים מרחקים תלת-ממדיים בין הבית הגנומי שצוין לבין הפצות תדר מצטבר של מרחקים הנמצאים מתחת לטווח הרחוק של הסף שנבחרו ומשתמשים במבחן tכדי להעריך את משמעות ההבדלים בהפצות. כמו כן, חשב את אחוז הגרעין החיובי עבור האינטראקציות הנמצאות מתחת לטווח הסף שנבחר, והשתמש במבחן המדויק של פישר כדי להעריך את משמעות ההבדלים באחוזים.

השיטה של 3D דג ה-DNA דגים תיאר במאמר זה מאפשר הדמיה עכשווית של הרוח גנומית שונים בתוך שנשמרו גרעיני תלת-ממד (איור 1B). פרוטוקול זה מתיר את מדידת המרחקים בין האללים, ובין גנומית שונים כדי להעריך את קרבתו המרחבית, ולאמוד את מיקומם בתוך החלל הגרעיני (למשל, מרחק המקום מן הסנטאיד או הפריפריה של הגרעין)¹⁶. עם זאת, ישנם שלבים קריטיים רבים שחייבים להיות מוגדרים במדויק ובמיוחד עבור כל סוג תא המשמש; מומלץ מאוד להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלבים הבאים להצלחה של 3D דג ה-DNA מרובה צבעים.

עבור הכנה לבדיקת דנ א, בדוק כי גודל בדיקה הוא < 200 bp (איור 1א). גודל זה מבטיח הליך מוצלח של 3D דג DNA רב צבעי (איור 1B). דנ א אופטימלית דגים בדיקותהמיוצרעל ידי ניק תרגום יכול להיות מתעכל חלקית (איור 2A) או מעל מתעכל (איור 2B). עם בדיקה מתעכל חלקית, ההליך לא יהיה אות בתאים, בשל חוסר היכולת של החללית להיכנס גרעינים כראוי hybridize לתוך הרוח גנומית משלימה. על הבדיקות מתעכל יגרום לאות לא ספציפי, עקב אובדן של ספציפיות היברידיזציה ועלייה התוצאה של הרקע. דוגמה ייצוגית של מעל בדיקה מתעכל מוצג באיור 3A בהשוואה למחקר מתעכל מיטבי באיור 3ב.

לגבי הדפרוטזציה והפנצ, עקבו אחר הצעדים הבאים בהתאם לסוג התא. בפרט, לקחת בחשבון את הגודל הגרעיני ושפע הציטופלסמה. עבור האדם הראשי ex vivo מבודדים T לימפוציטים ותאים עם קטן, גרעיני מאוד דחוס בשפע ציטופלסמה נמוכה, HCl deproteinization המלחה הוא קריטי. טיפול עם 0.1 N HCl עבור 5 דקות אינו מספיק עבור הדמיה של דג DNA. 0.1 N הטיפול HCl עבור 12 דקות מומלץ לקדם את הנגישות גרעינים לבדיקות DNA ולשמר את השלמות הגרעינית (איור 4א). העיכול pepsin של הציטופלסמה אינו נדרש כדי לקבל אות טובה של דגי DNA (איור 4ב).

עבור מכשולים הראשי האדם ותאים בעלי גרעינים גדולים וציטופלסמה שופע, שלב הפפסיזציה הוא בסיסי. פפסיזציה קצרה ואופטימלית של שלד התא יהיה לעכב את הכניסה של החללית בגרעין (איור 4ג), המסתיים בהיעדר אות ה-DNA דג. עם זאת, אם התאים הם מעל pepsinized, הגרעינים לא יישארו שלמים (איור 4ד), אובדן מבנה תלת-ממד שלהם. דוגמה של מוצלח 3D דג DNA דגים מסופק באיור 4E.

במהלך היברידיזציה, אטום את הכיסויים במדויק; אחרת, המכשיר יפזר ויתייבש. הדנטורציה ושלבי היברידיזציה חייבים להתבצע במהירות כגון ה-DNA הבדיקה ו גנומית לא לחדש. ניתן להגדיל את משך הדנטורציה.

איור 1: בדיקות דנ א מייצגים ו-3D דג dna מרובה צבעים. (א) ניק מתורגם בדיקות DNA של גודל אופטימלי לרוץ על 2.2% agarose ג'ל (ליין1, 2), 50 bp סמן (ז). (ב) נציג תלת-ממד הגרעין דג ה-DNA דגים באמצעות מיפוי רגשים כדי 3d 11.2 אזור (ירוק), 10q 26.3 אזור (אדום) ו 8q 24.13 אזור (מגנטה) ב האדם העיקרי myoblasts חזיק. גרעינים מוכתם נגד DAPI (כחול). הגדלה של 63 x. סרגל קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמאות של בדיקות לא מתעכלים DNA דגים. (א) לא מתעכל (ליין 1, 2) או מתעכל חלקית (ליין3) ניק מתורגם בדיקות DNA לרוץ על 2.2% agarose ג'ל, 2log סמן (M). (ב) מעל ניק מתעכל מתורגם בדיקות DNA לרוץ על 2.2% agarose ג'ל, 2log סמן (M). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השוואה של 3D דג ה-dna מרובת צבעים באמצעות הבדיקות האופטימליות או האופטימלי של דנ א דגים. (A) הנציג3D של מרובת צבעים דג ה-DNA דגים באמצעות מיפוי בדיקה מתעכל לאזור 8q 24.13 (מגנטה) ב-myoblasts חזיק האדם העיקרי. גרעינים מוכתם נגד DAPI (כחול). הגדלה של 63 x. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ב) נציג 3d הגרעין דג ה-DNA דגים באמצעות מיפוי בדיקה אופטימלית מתעכל כדי 8q 24.13 אזור (מגנטה) ב האדם הראשי myoblasts חזיק. גרעינים מוכתם נגד DAPI (כחול). הגדלה של 63 x. סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: התוצאות האפשריות של שלבי הדפרוטזציה והפנצ ב תלת-ממד מרובי-DNA לתוצאות. (א) נציג 3D של רב צבעי DNA דגים הגרעין של לימפוציטים האדם הראשי T שטופלו עבור 5 דקות (שמאל) או 12 דקות (מימין) עם 0.1 N HCl, באמצעות מיפוי בדיקה כדי 8q 24.13 אזור (ירוק). גרעינים מוכתם נגד DAPI (כחול). הגדלה של 100x. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ב) נציג 3d מרובת צבעים דגי DNA דגים של לימפוציטים האדם הראשי T טיפל עבור 12 דקות עם 0.1 n hcl (שמאל) או בשילוב עם 0.01 n hcl/0.0025% פפסין עבור 2 דקות (מימין), באמצעות מיפוי בדיקה לאזור 8q 24.13 (ירוק). גרעינים מוכתם נגד DAPI (כחול). הגדלה של 100x. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ג) נציג 3d מרובת צבעים ה-DNA דגים גרעיני של האדם העיקרי myoblasts טופלים עם pepsinization קצרה ואופטימלית, באמצעות מיפוי בדיקה לאזור 8q 24.13 (מגנטה). גרעינים מוכתם נגד DAPI (כחול). הגדלה של 63 x. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ד) נציג 3d מרובת צבעי ה-DNA דגים גרעיני של האדם העיקרי myoblasts טופלים עם צעד pepsinization ממושכת, באמצעות מיפוי בדיקה כדי 8q 24.13 אזור (מגנטה). גרעינים מוכתם נגד DAPI (כחול). הגדלה של 63 x. סרגל בקנה מידה = 5 μm. (E) נציג 3d מרובת צבעים ה-DNA דגים גרעיני של האדם העיקרי myoblasts טופלים עם התנאים האופטימליים HCl/pepsin באמצעות מיפוי בדיקה לאזור 8q 24.13 (מגנטה). גרעינים מוכתם נגד DAPI (כחול). הגדלה של 63 x. סרגל קנה מידה = 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שולחן 1: ניק תרגום. טבלה המתארת את כל הריאגנטים, הריכוז שלהם והציע תזמון לתגובת ניק תרגום.

השיטה הנוכחית מתארת את הפרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע דג DNA תלת-צבעי תלת-ממדי על מגוון רחב של תאים ראשיים אנושיים. למרות שדגי ה-dna הוא טכנולוגיה בשימוש רחב, 3d דג ה-dna דגים על שנשמרו גרעיני interphase תלת-ממד עדיין קשה לבצע במעבדות רבות, בעיקר בשל המאפיינים של דגימות בשימוש^23,24.

בדיקה ניק תרגום הוא צעד בסיסי עבור מוצלח 3D-DNA דג מרובה צבעים; מצעים שונים רבים (BAC, fosmid, פלאמיד, PCR מוצרים) ניתן להשתמש בתגובה זו, ואת העיתוי של התגובה ריכוז האנזים יכול להיות מותאם בהתאם לאורך המצע. העיכול התקין הוא בסיסי (איור 1), כאשר הבדיקות הלא אופטימליות (איור 2) יגרמו לאין אות או אות לא ספציפי (איור 3א). שלבי הפרפיקציה, הדפרוטליזציה והפפסיזציה הם קטעים קריטיים התלויים באופן חזק בסוג התא המשמש. תאים עם גרעינים קטנים ושפע השלד נמוך, כגון vivo ex מבודד לימפוציטים T, דורשים deפרוטהמלחה עם טיפול ממושך 0.1 N HCl. כמו כן, שוטף ב-PBS עם אחוזים גבוהים יותר של טריטון X-100 יכול לעזור להיכנס למכשיר הגרעין של תאים אלה. להיפך, בתוך מתורבת תרבותית האנושית הראשי העיקרי הנוכחי גרעין גדול, עם תוכן גבוה של שלד ציטומי, צריך עיכול של מבנים ציטוסולג עם pepsin. תפקידים כלליים אלה ניתן להחיל על מגוון רחב של תאים, בסופו של דבר שילוב השלבים השונים בהתאם למאפיינים הסלולריים הספציפיים.

השימוש בחומר ביולוגי טרי ומוכן, פתרונות טריים (בפתרונות מיוחדים עם חומרי ניקוי), וריאגנטים פלורסנט מוצעים בחריפות: מסוננים ב-pH 7.0; המלון מסונן ב-pH 7.0; מסוננים הטופסב pH 7.0; הכרה מים חינם; וחד פעמי של UTP שונה. דגירה ממושכת עם 20% גליצרול/PBS, או 50% בטופסלהאס. אס. או 2x יכולים להקל על הכלאה הטיפול HCl ו/או פפסין ניתן להגדיל עוד. העיתוי של היברידיזציה, כמות הגששים, ריכוז ותזמון של דגירה של אנטי digoxigenin ו streptavidin יכול להיות מותאם עוד יותר כדי לשפר את האות ליחס הרעש.

3D-DNA דג מרובת צבעים מייצג כלי משלים C-טכנולוגיות, את השיטה הסטנדרטית לאמת תוצאות מבוססות C. אם בשילוב עם מיקרוסקופ תלת-ממד וניתוח, 3D מרובת צבעים דג DNA יכול לפקח על הקירבה בין המקום גנומית התפלגות טופולוגית שלהם בתוך החלל הגרעיני ברמת תא בודד. 3D-DNA דגים מרובי צבעים יכול להיות משולב עוד יותר עם מתודולוגיות אחרות כגון ה-RNA FISH ו immunofluorescence עבור סקירה מקיפה של הדינמיקה ואינטראקציות בין הבית גנומית, RNAs (שליח RNA או הרגולציה ללא קידוד RNA) ומגוון רחב של חלבונים, מתן הזדמנות ייחודית להמחיש את המבנה הגרעיני ולחקור את המנגנונים האפיגנטיים כי משנה זהות סלולרית.

למרות השיפור העצום של טכנולוגיות דגים עם רזולוציה סופר^25,26, לחיות הדמיה של תאים^27,28,36, מולקולה אחת זיהוי³⁷, והדמיה עכשווית של מטרות מרובות עם מערכים olig, מערכי הגאות כגון Oligopaint^37,38 עם 3d בתפוקה גבוהה גישות³⁹, מגבלה של הטכנולוגיה נשאר המספר הדיסקרטי של ה היות מדמיינו. זה מונע ניתוח רחב טווח של אדריכלות גרעינית. מספר מחקרים תיארו לאחרונה שיטות סדרתית של הכלאה כדי לטפל בארגון הגנום בתאים בודדים כגון ברקוד DNA דגים^40,41,42,43. מאמצים נוספים יהיה צורך לזוג את הטבע התא היחיד של 3D מרובת צבעים דג DNA לתכונות הגנום רחב להמחיש בהרחבה אדריכלות גרעינית טרוגניות עם טכנולוגיות הדמיה, כמספר המקום שניתן לבדוק בזמן יגדל.

. למחברים אין מה לגלות

המחברים מכירים בסיוע הטכני של מתקן הדימות INGM (המכון הפוליטכני של המרכז הטכנולוגי "רומיאו אד אנריקה" (INGM), מילאנו, איטליה), במיוחד C. Cordiglieri, לקבלת סיוע במהלך 3D תמונות דג DNA מרובת צבעים רכישת. עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים כדי לבי: התוכנית הדגל האיטלקי epigen, האגודה הצרפתית דשנה Myopathies (afm-שידור, גרנט nr 18754) ו ג'ובאני ricercatori, משרד הבריאות האיטלקי (GR-2011-02349383). עבודה זו נתמכת על ידי המענק הבא פ: Fondazione קאריפלו (באנדו ג'ובאני, גרנט nr 2018-0321).