בידוד כימי, כימות, הפרדת שומנים בעור של זוחלים

ב זוחלים, ליפידים העור של בני מינו הינן קריטיות לצורך איתות מינית, עם פוטנציאל השימוש בניהול מין פולש. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים עבור חילוץ העור ליפידים מן המחסן עור או כל בעלי החיים, קביעת ניתוח המסה סה כ שומנים בדם ואת המפריד בין ליפידים באמצעות כרומטוגרפיה fractionation באמצעות העמודה.

זוחלים של אות בני מינו באמצעות שומנים בעור שלהם, בעיקר כדי לאפשר חבר מעקב והערכה. בידודו של שומנים אלה יש כלי המחקר התמקד אבולוציונית דפוסים ומנגנונים של תקשורת כימית, בנוסף להבין את התפקיד איטום של ליפידים באבולוציה של החיים הארציים. בגישה יישומית, רמזים כזה המבוסס על העור יש שימוש פוטנציאלי למנהלים חיות בר התמודדות עם מינים פולשניים. השלבים העיקריים לכימות זוחלים שומנים בעור בפרוטוקול המובאת כאן כוללים חילוץ, נחישות השומנים הכולל fractionation באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, התהליך האחרון וכתוצאה מכך מטוהרים eluates של תרכובות אשר יכול אז גם להיות מנותח להקצאת מתחם ההזדהויות (למשל, גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית [GC-MS]) ו/או משתמשים בו ישירות בתוך bioassays מעודנת יותר. שומנים בעור יכול להיות מופק העור המגורים, לשפוך את העור, או מת כל בעלי חיים, שימוש בממסים אורגניים פולרי (למשל, הקסאן, בנזן, טולואן). חילוץ solubilizes ליפידים ו, אז, הממס יכול להיות התאדו להניב תמצית ליפידים בלבד מדיד. Fractionation כרוך ההפרדה של תמצית השומנים הכולל לתוך eluates ספציפי באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. תמצית ליפידים הכולל קודם מאוגד לעמודה מבוססת על המצע (למשל, אלומינה), לאחר מכן, בודדים eluates ("שברים") של הממס בעוצמות ספציפיים מועברים ברצף באמצעות העמודה כדי elute קבוצות של תרכובות מעירוב השומנים מבוסס על קוטביות נפוצות. ההתקדמות שברים קוטביות על רצף סטנדרטית על ידי הגדלת הכמות היחסית של הממס קוטביים (למשל, דיאתיל אתר) ממס פולרי. כתב יד זה, אנחנו מתארים מספר שיטות לחילוץ שומנים בעור של זוחלים ומספקים, ואז, פרוטוקול תקני לבידוד סטים שונים של תרכובות בהתבסס על קוטביות, באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. כל השומנים תמציות או שברים ספציפיים, לאחר מכן, ניתן להשתמש ב- bioassays כדי לקבוע כל פעילות ביולוגית שהפיק את תרכובות ובזה.

זוחלים לייצר ליפידים האפידרמיס, ישירות מתוך תאי העור או מכל בלוטות בדידים הנמצאים בשימוש בתקשורת חברתית, כגון הערכת חבר, מעקב, הטריטוריאליות, ואינטרה - זיהוי interspecific^{1,2 3, ,4}. בידודו של שומנים אלה העור יש כלי המחקר התמקד אבולוציונית דפוסים ומנגנונים של תקשורת כימית, בנוסף להבין את התפקיד איטום של ליפידים באבולוציה של החיים הארציים^{2,3 ,4}. יתר על כן, זוחלים רבים, במיוחד squamates (לטאות, נחשים), הן מין פולש של דאגה, מערכות אקולוגיות רגיש, התפתחות מבוסס-פרומון פתיונות לשיפור והסרה של השמנה הוא שוטף^5,6. אטימות של עורות של זוחלים מקלה על החילוץ של ליפידים הנוכחי כדי להשיג עקירות יחסית טהורה של מקור שעשויות להיות חזקים של אותות כימיים. השלבים עיקרון לכימות זוחלים שומנים בעור בפרוטוקול שתואר כוללים חילוץ, השומנים הכולל קביעת fractionation באמצעות העמודה כרומטוגרפיה^1,6,7. השיטות שימשו באופן שגרתי כמו הם תשואה מבודד ביואקטיביות להסביר הרבה על חבר הבחירה ואת הבחירה, במיוחד נחשים².

שומנים בעור יכול להיות מופק או חי העור, העור המחסן, או זוחלים כל מת, באמצעות פולרי או ממיסים אורגניים קוטבית^1,7,8,9. יצוין כי דגימות מוזיאון המאוחסן ממיסים כגון אתנול אינם מיטביים על החילוץ של שומנים בעור, פגרי רק טרי או קפוא טרי צריך להיחשב כמקורות אפשריים עבור החילוץ. שומנים בעור שהם מבינים, מה שהופך אותם יציבה על פני השטח של העור, כדי לחלץ⁷. תפקידיהם איתות זוחלים אקולוגיה, העור השומנים רמזים מופקדים לרוב בסביבות קשות, אך בשל תכונותיהם כימיים חזקים, רמזים כאלה יכולים לשמור על ערכם מידע על פני תקופות ארוכות של זמן^{10,11 , 12}. תהליך החילוץ solubilizes ליפידים, שימוש של ממס פולרי (למשל, הקסאן, בנזן, טולואן) מעל להשרות שעות-לונג, ואחריו האידוי של הממס, לעזוב מסה למדידה של תמצית ליפידים^{7 , 8}. עור שומנים miscible מאוד בממיסים פולרי, מגוון רחב של פחמימנים יכול להיות מופק מערך דומה מגוון של מקורות.

Fractionation היא יותר מאשר חילוץ מפרך אבל מגישה כדי להפריד את תמצית ליפידים הכולל לתוך שברים ספציפי באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, כדי לסייע בזיהוי האפשר וטיהור של תרכובות ובזה^{1, 6 , 7 , 8}. תמצית ליפידים הכולל מאוגד לעמודה מבוססת על המצע, ואז, בודדים eluates ("שברים") של הממס בעוצמות ספציפיים מועברים ברצף באמצעות העמודה כדי elute קבוצות של תרכובות מעירוב השומנים בעלות משותפת קוטביות^6,7,8. הכרומטוגרפיה השומנים, ההתקדמות שברים קוטביות בחלק סטנדרטית רצף על ידי הגדלת הכמות היחסית של הממס קוטביים (למשל, דיאתיל אתר) בממס פולרי (בדרך כלל מבוטא כאחוז: 0%, 2% 4% אתר, ועוד. )^6,7,8. על פי שיטות כמו דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC) יכול לשמש כדי להפריד בין ליפידים תערובת, הם פשוטים יותר, כרומטוגרפיה עמודה הוא מועדף בגלל שהוא משתמש מערכת סגורה, קל לשלוט, יכול עוד נפרד התרכז תערובות ולאחר תואם ריבוב ליעילות. כתב יד זה, אנחנו מתארים מספר שיטות לחילוץ שומנים בעור של זוחלים ומספקים, ואז, פרוטוקול תקני לבידוד סטים שונים של תרכובות בהתבסס על קוטביות, באמצעות כרומטוגרפיה טור מסורתיים. במיזמי מחקר רבים המערבים את ניתוקה של סימנים כימיים, המטרה הסופית היא ליצור שינוי ב הקולטים נחשפים רמזים אלה. כל השומנים תמציות או שברים ספציפיים, לאחר מכן, ניתן להשתמש ב- bioassays כדי לקבוע שכל פעילות ביולוגית שהפיק תרכובות ובזה^1,2,6,7. במחקר ביולוגי בסיסי, לדוגמה, bioassays באמצעות שברים ספציפי יכול לחשוף לחוקרים כי מקור מטוהרים של פרומונים היה מבודד, אז יכול להיות נרדף שיטות הזיהוי של תרכובות היעד. מנקודת מבט ניהול חיות הבר, זיהוי לא יכול להיות המטרה, במקום זאת, השבר הפעילים יכול לשמש בשטח כדי למשוך בני מינו למלכודות או לעכב את חבר מעקב ב^13,גידול הכוללים¹⁴.

כל הפרוצדורות הכרוכות של חולייתנים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו להשתמש הוועדה של ג'יימס מדיסון אוניברסיטת.

1. חילוץ

1. לשפוך העור החילוץ
   1. אוספות כ 30 ס מ² של המחסן זוחל יחיד, הסרת את הראש ואת קטעי cloacal יכול לזהם את הדגימות. יש ללבוש כפפות chloroprene ולנקות את המחסן של פסולת.
   2. להקרע האיזון עם שקית או לשקול את הסירה ולשקול את המחסן (± 0.01 גרם).
      הערה: דיוק מסת נקבעת לפי מידת הדיוק של האיזון. המחסן העור מסה היא הגורם סטנדרטיזציה עבור העור שחולצו השומנים מסה (ראו להלן), covaries באופן משמעותי עם השומנים שחולצו מסה.
   3. להפריד את המחסן לחתיכות קטנות יותר (5 ס מ²) ולהוסיף אותם במיכל sealable זכוכית עם מכסה תואם הקסאן (למשל, צנצנת זכוכית עם מכסה מתכת או בקבוקון מעבדה עם מכסה PTFE). Decant מספיק הקסאן לתוך המיכל מלא ומטביעים את חתיכות עור המחסן. חותם את המכולה.
      התראה: הקסאן הוא דליק, מגרה מערכת הנשימה, והיא קשורה עם מספר קצר - ארוכת הבריאותיות. נהלים הקשורים הקסאן מבוצעות fume הוד (מעבדה) או בחוץ (שדה) תוך כדי ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי) (למשל, splash משקפי מגן, כפפות chloroprene, שרוולים ארוכים, פאיתאי).
   4. תווית של container(s) עם עיפרון או עט עמיד הממס. להשאיר את container(s) בשכונה fume ב h לילה או עד 24 שעות בטמפרטורת החדר.
   5. להסיר את החלקים המחסן באמצעות מלקחיים מתכת נקייה או מלקחיים. לנער את החלקים כדי לשמור על כל הקסאן שנותרו בתוך המיכל. לאפשר את חתיכות עור יבש על נייר; לאחר מכן, נפטר מהם אם מתבצע עקירות מרובות, נקה מלקחיים/המלקחיים בין כל דגימה. כדי לנקות את מלקחיים/המלקחיים, לשטוף אותם ב ~ 50 מיליליטר הקסאן בתוך.
   6. אם התמצית לא אמור לשמש מיד, decant או pipette את התמצית לתוך בקבוקון זכוכית של אמצעי האחסון המתאים, לאטום אותו עם כובע מרופדת PTFE, באותיות, ואחסן אותו ב-20 ° C.
      התראה: כי התמצית מכיל הקסאן, לאחסן את הבקבוקונים במקפיא קילוואט.
2. חילוץ בעלי חיים מתים לגמרי
   1. תעדו את מימדיו החוטם-אוורור (SVL; בסנטימטרים) מסת (בגרמים) של החיה. אם סה כ שומנים בדם או פרומון לייצור ליחידת שטח העור הוא שיקבע, השתמש מדידה של חייט כדי להשיג את מקסימום הצרת היקפים (בסנטימטרים).
   2. על החילוץ, לבחור מיכל בעל קוטר זה 1/3 אורך של החיה. מקם את הגווייה בצורה מאובטחת בתחתית המיכל בעלת ראש קלואקה למעלה. Decant מספקת הקסאן לתוך המיכל על מנת למקסם את פני השטח המשוקע של הגוף.
      הערה: אם בראש או קלואקה להיות מוסתר עבור כל כמות של זמן החילוץ, שים לב.
   3. לאבטח את המכסה, תווית המיכל, לספוג אותו ברדס fume ב h לילה או עד 24 שעות בטמפרטורת החדר.
   4. בעת הסרת את הגווייה, להשתמש מלקחיים מתכת נקייה או מלקחיים. שומרים את הקסאן שיורית על הגופה בתוך המיכל על ידי ולאפשר לו לטפטף מהגוף, לא מן הראש או זנב. חותם את המכולה.
   5. אם התמצית לא אמור לשמש מיד, decant את התמצית או pipette אותו לתוך בקבוקון זכוכית של אמצעי האחסון המתאים, לאטום אותו עם כובע מרופדת PTFE, באותיות, ואחסן אותו ב-20 ° C.

2. שומנים מסה נחישות

הערה: השומנים שחולצו מסה יכול להיקבע באחת משתי דרכים: עם בקבוקון זכוכית או עם בקבוקון סיבוב למטה, באמצעות המאדה.

1. לקבוע את השומנים שחולצו המונית באמצעות השיטה בקבוקון זכוכית.
   1. השתמש בקבוקון preweighed בגודל הרצוי (7 mL, 22 mL, 50 מ ל, וכו '). לכלול את הכובע והתווית המסה הכוללת, או תמיד לשקול את המבחנה ללא והמעיל תווית (סימנים על התווית גם להוסיף מסה). הצב את התווית על הצוואר + בקבוקי שתייה צידניות להימנע ממגע המים.
      הערה: אידוי, צלוחיות זכוכית יעיל אם החוקר יש גישה למערכת סעפת גז איפה בקבוקונים מרובים יכולים להיות התאדו בו זמנית תחת זרם₂ N.
   2. להעביר את התמצית המבחנה, באמצעות פיפטה מזכוכית עם דרך הנורה גומי או עבור נפח גדול תמציות, לקונטרולר פיפטה אלקטרונית עם פיפטה מזכוכית חד פעמית 10 מ"ל. לשטוף את המיכל עם ~ 3 מ"ל של הקסאן והעברת למבחנה גם כן.
   3. להתנדף הדגימה תחת זרם₂ N עדין. להטות את המבחנה בזווית כדי לאפשר המרבי בשטח הממס. מעובה יהוו מבחוץ של הבקבוקון כפי הקסאן מתאדה.
      הערה: טבעות של השומנים יהוו בבקבוקון כפי הקסאן מתאדה, אז מעת לעת מערבולת החילוץ.
   4. להתאדות המדגם ליובש; אז, reweigh. להקליט את התשואה הכוללת שומנים בדם.
      הערה: לצורך ניתוח על פני קבוצות שונות, לתקנן את השומנים המונית, או לשפוך מסה (מסה השומנים [בגרמים] מחולק במאסה המחסן [בגרמים] x 100 התשואות המסה אחוז השומנים של המחסן) או SVL של החיה (השומנים המוני [במיליגרמים] מחולק SVL [ב ס מ]; התשואות המסה השומנים עבור אורך יחידה). חיות גדולות לייצר יותר שומנים, ויש מינים רבים dimorphic בחום מינית, אשר מטיל הטיה משמעותית בנתונים.
2. לקבוע את השומנים שחולצו המונית באמצעות המאדה סובב.
   1. אידוי מהיר יותר עבור דגימה בודדת, להעביר את התמצית בקבוקון סיבוב המדרגה preweighed, מתאדים אותו באמצעות המאדה.
      1. אם החלקיקים מורגש תמצית, לסנן את הדגימה על-ידי הצבת קונוס נייר סינון בצוואר + בקבוקי שתייה צידניות; לאחר מכן, להעביר את התמצית הבקבוקון ולאפשר למסנן הכבידה. תשליך נייר הסינון, אחרי התמצית המלא מועבר.
         הערה: להעביר את אמצעי האחסון מדגם (עד נפח הבקבוק ~ 80%) לפני אידוי רוטרי. כל מבעבעים של התמצית לתוך מעבה של המאדה גורם זיהום ודורש את מעבה המנוקה. ניתן להציב מלכודת בליטה בין את הבקבוקון ואת צווארה של מעבה אם בועות או "הקפצת" מתרחשות רוב דגימות.
   2. להפעיל את הכוח לאמבטיה המאייד ואת מים צנטריפוגליות (50 ° C; נמוך יותר מאשר נקודת הרתיחה ממס). הפעל את זרימת מים קרים אל מעבה.
      הערה: הקבל של המאדה מחובר chiller במחזור או spigot בלי מים חמים אוורור לניקוז. קצב הזרימה יכול להיות איטי אם המים הוא קריר יותר תאורת הסביבה, כדי לדחוס את האדים הממס עוזב את הבקבוקון והזנת את הקבל.
   3. הפעל את מקור ואקום (מים ואקום או משאבה). ודא שהלחץ ואקום מספיקה להחזיק את הבקבוק עד צוואר מעבה. פתח האוורור בסוף מעבה לפני שתחבר את הבקבוקון. להחליק את הבקבוקון אל צווארה של מעבה, קרוב האוורור כדי לאטום, ולהבטיח שאת הבקבוק. לא יכול לנתק הקבל הבקבוקון ישוחרר.
   4. . תוריד את הבקבוק עד ~ 50% שקוע באמבטיה. להתחיל את הסיבוב של הבקבוק במהירות בינונית. אם ואקום, מהירות, מעבה הזרימה ואת אמבט טמפרטורה אופטימלית, האדים הממס עוזב את הבקבוקון לדחוס על הסליל, לטפטף לתוך הבקבוק השחזור.
      1. אם המדגם שחין (לדוגמה, בועות גדולות, ההמתה מהירה), להקטין באופן מיידי את אבק ו/או מהירות המאדה. אם הרתיחה נמשכת, לבטל את סיבוב הבקבוק, לבטל את שואב האבק, להעלות את הבקבוקון מן האמבטיה, ולשחרר הואקום. חזור על שלבים 2.2.3 ו 2.2.4.
         הערה: אם אין הממס הוא איסוף בתוך הבקבוק התאוששות, אך התמצית הולכת ונמוגה ללא ספק, הואקום סביר nonoptimal, חייב להיות והשתלב.
   5. להתאדות הדגימה תחת שואב האבק עד ~ 2 מ"ל שרידי ממס ב הבקבוק (תמציות נפח גדול), או, אם בקבוקון preweighed נמצא בשימוש, מתאדים עד חרוז של נוזל עם < בקוטר 1 ס מ מוצגת בתחתית הבקבוק. כבה את הסיבוב ואת ואקום; לאחר מכן, הרימו את הבקבוקון מהאמבטיה.
   6. בצוואר הבקבוק כמו שואב האבק החותם הוא שוחרר; לאחר מכן, לסובב את הצוואר כדי להחליקו הקבל. אם נעשה שימוש בקבוקון נפח גדול, מערבולת תמצית מרוכז בתוך הבקבוק כדי להמיס שומנים גלוי; לאחר מכן, להעביר פתרון באמצעות פיפטה בקבוקון קטן יותר בנפח, preweighed. להוסיף 3 מ"ל של הקסאן לשטוף את הבקבוקון גדולים, מערבולת זה, pipette אותה כדי. הבקבוק קטן יותר של להתאדות שוב (שלבים 2.2.3 - 2.2.5).
   7. החרוז של נוזל תמצית יחזק כפי הקסאן מתאדה. ברגע יבש, לאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר. ליפידים יהוו לבן שקוף, כדי שעווה צהובה ב הבקבוק (~ 5 דקות). שוקלים את הבקבוק כדי להשיג את המסה הסופית.
      הערה: בהתאם לאופי ליפידים חילוץ, יהיה להם מוצק (למשל, שעווה) או מאפייני חצי קשות (למשל, נפט גולמי), במיוחד כאשר שומנים fractionated הם התאדו (ראה להלן).
3. Solubilize ליפידים בהיקף מוקלטות הקסאן להניב ≥1 מ"ג של השומנים לכל 1 מ"ל של הקסאן. ~ 5 מ"ל שאמצעי האחסון לעבוד עבור ומתחזקים כרומטוגרפיה. אם העברת את הבקבוק כדי בקבוקון, שומרים על 2 מ"ל מהנפח הכולל לשטוף את הבקבוקון לאחר העברת רוב התמצית למבחנה.
4. תווית הבקבוקונים, לאטום אותם עם אותיות מצופה PTFE, ואחסן אותם ב-20 ° C.

3. עמודות כרומטוגרפיה

הערה: כדי להפריד תרכובות לא ידוע המבוסס על קוטביות לתוך שברים ספציפיים, השומנים שחולצו בנפח גדול יכול להיות עמודות שנוספו מוכן כרומטוגרפיה נוזלית, fractionated באמצעות • תנאי סטנדרטי.

1. הכנה של העמודה
   1. בהתאם המסה השומנים ב התמצית, להשתמש או גדול - או עמודה כרומטוגרפיה זכוכית בנפח מצומצם עם צימוד טפלון. העמודה מצויד או דבוקה מאגר בנפח קבוע (500 mL עבור עמודה גדול; 250 מ עבור עמודה קטן). מעתה ואילך, פרוטוקול זה רק מפנה לעמודה בנפח גדול כרומטוגרפיה דבוקה מאגר. ניקוי יסודי של כל כלי זכוכית חדשה, חלקים כדי לשמש הכרומטוגרפיה כמתואר בסעיף 4; לאחר מכן, לשטוף אותם עם הקסאן או אחר ממס פולרי.
   2. מקפלים פיסת פיברגלס צמר (~ 14 ס מ אורך [L] x 4 ס"מ רוחב [W]) מספר פעמים עד נוצר ריבוע של ~ 4 ס"מ על 4 ס"מ. השתמש מוט עץ פינים יותר העמודה למיקום של פיברגלס בחלק התחתון של העמודה.
   3. אבטח את העמודה ברדס אל דוכן טבעת רגילה עם שני תופסנים (למשל, סיבוב או מודולרי), האחד מעל צימוד ואחד מתחת לצוואר של המאגר. רמת העמודה. מקם את העמודה בגובה כדי לאפשר ומרחק עבודה מספקת עבור כשהספל 500 מ"ל להתאים בקלות תחת העמודה. פתח את צימוד.
   4. יציקת ונייבש חול לתוך העמודה, עד ~ 3 ס מ של חול מונח מעל פיברגלס. מניחים נייר שחור או כהה תחת העמודה והקש אותו בעדינות. אם חול נופל מן העמודה עם כל ברז, המכשול פיברגלס אינה מספיקה. חזור על שלבים 3.1.2 - 3.1.4.
      הערה: השתמש של מהדק פרש מודבק בסוף מוט פינים להביא את פיברגלס מלמטה.
   5. מקם את הספל 500 מ"ל תחת העמודה. לאט לאט decant ~ 25 מ ל הקסאן גביע 100 מ ל או משורה לתוך המאגר עמודה להרטיב את החול. סגור את צימוד כאשר יש ~0.5 ס מ הקסאן מעל החול.
   6. שוקלים לצאת אלומינה נייטרלי. עבור כל עמודה קטנות, השתמש ~ 50 גרם; ~ 175 g עבור כל עמודה גדול. שופכים את אלומינה לתוך בקבוקון Erlenmeyer 1 ליטר. מגבלת 400 גרם של אלומינה לכל בקבוק 1 ליטר.
   7. כדי להפעיל את אלומינה (פעילות השלישי), פיפטה מים יונים של אמצעי אחסון שווה ל- 6% אלומינה מסה (כלומר, עבור 100 גרם של אלומינה, להוסיף 6 מ של מים). להוסיף את המים כמו טיפות לאורך אלומינה.
   8. מכסים את הבקבוק עם רדיד אלומיניום או פקק. נמרצות מערבולת (אל תלחץ) להתפזר באופן אחיד את המטען. ממשיכים עד אין גושים גלוי להישאר.
      הערה: הבקבוקון חם, כמו המים מגיב אלומינה, אשר היה צפוי.
   9. הוסף הקסאן עד אלומינה מכוסה לגמרי, עם ~0.5 ס מ הקסאן מעל אלומינה. מערבולת את הבקבוק כדי ליצור של slurry.
   10. מניחים משפך פרקו במאגר המים העמודה ואת גביע זכוכית 500 מ"ל מתחת לעמודה. פתח את צימוד. מערבולת של אלומינה, בהתמדה ותשפכי לתוך העמודה. ודא אלומינה יורדת באופן שווה את העמודה, אין בועות גדולות או סדקים יוצרים בעמודה אלומינה. טפח בעדינות את הצד של העמודה להתיישב באופן שווה את אלומינה.
       הערה: יש להוסיף הקסאן נוספים עבור נשפך נוספים, כדי לשמר את slurry. הקסאן איסוף במיכל תחת העמודה חוזר אם כשהספל זכוכית נקי בתחילתו.
   11. העמודה נוצר כאשר החלק העליון של אלומינה קשה ויציב ~ 4 ס מ מתחת לצוואר של העמודה בבסיס של המאגר. השתמש פיפטה כדי לשטוף את החלק הפנימי של המאגר עם הקסאן לקבלת אלומינה שיורית. באמצעות משפך, להוסיף בעדינות שכבה נוספת של חול על גבי התרכובת אלומינה, ~ 1 ס מ מתחת למאגר.
       הערה: הקסאן יזרום מן העמודה צימוד נותרת פתוחה. אל תתנו את העמודה להתייבש. אם העמודה תתייבש התהליך חייבת להתחיל שוב, מתחיל שלב 3.1.2. הפרוטוקול ניתן לעצור כאן אם העמודות מוכנים יום לפני fractionation. בחוזקה למקם פקק בחלק העליון של המאגר או לכסות את זה היטב עם נייר כסף. למלא את האגם ~ 100 מיליליטר הקסאן. להדק את צימוד.
2. Fractionation של תמצית ליפידים
   הערה: ללא קשר לגודל העמודה, שברים של תמצית ליפידים ניתן לאסוף באופן אינדיבידואלי ולהשתמש איחדו מבוסס על הקוטביות שלהן שבר או שנמחקו לחלוטין אם הם אינם מכילים תרכובות היעד מזוהה/ידוע לכל. סבבי • תנאי שכפל (n = 3 כרכים) עברו את העמודה כדי להבטיח את • תנאי מספיק של ליפידים. לפי טבלה 1 עבור עמודות גדולות • תנאי (עם תמצית מסה > 30 מ"ג) או עמודות קטן • תנאי (עם תמצית המוני < 30 מ"ג). פרוטוקול • תנאי המותאמים לבידוד רק מתיל קטונים הוא בטבלה מס ' 2.
   1. הסר את הקסאן שנותרו בחלק העליון של העמודה, באמצעות פיפטה נפח גדול, או לאפשר את הקסאן לטפטף החוצה לתוך גביע נקי. השאר ~ 3 מ"ל של הקסאן מעל החול בחלק העליון של העמודה.
      הערה: הקסאן שנאספו הוא טהור, אם זה רק יצר קשר עם כלי זכוכית נקי ולא ניתן למחזר ב השבר הראשון.
   2. להעביר את תמצית ליפידים העמודה, באמצעות פיפטה מזכוכית ארוכה. לאט לאט pipette את תמצית כדי שלא להפריע למטופלים שכבת חול. לשטוף את בקבוקון תמצית או הבקבוק עם ~ 5 מיליליטר הקסאן והעברתה לעמודה.
      הערה: אם התמצית היה מאוחסן ב-20 ° C, ליפידים להיות זירז. לחמם את הצנצנת עד אין יותר התמיסה יהיה גלוי.
   3. לפתוח את צימוד ולאפשר את הדגימה לטעון לתוך העמודה. אם התמצית יש גידול גדול (> 30 מ"ג), להקה צהבהב עשויים להיות גלויים באלומינה, מתחת החול בחלק העליון. לאסוף את הזרימה בתוך פסולת ככל הקסאן הזה כבר לא נקי. סגור את צימוד כאשר ~ 3 מ"ל נשאר על גבי החול.
      התראה: השומנים בהתמצית, עכשיו קשור את אלומינה והעמודה, לא יכול להתייבש, או הדגימה יאבדו.
   4. הצב preweighed ומתויגים סיבוב המדרגה בקבוקון (100 מ ל, 250 מ ל או 500 מ"ל) מתחת לעמודה לפני לשפוך את השבר הראשון. שברים להימחק ניתן לאסוף בתוך מיכל זכוכית.
   5. להכין את השבר הראשון (100% הקסאן: 0% דיאתיל אתר [עד כה, "אתר"]) ב משורה. אם מכינים שברים מראש, לכסות עם נייר כסף או פקק עם הפקק.
      הערה: שברים התקדמות קוטביות; לכן, הצילינדר לא צריך לשטוף בין שברים.
   6. הוסף השבר הראשון למאגר המים על ידי שפיכת באמצעות משפך זכוכית פרקו מופנות לצד של המאגר כדי למנוע הפרעה שכבת חול. פתח את צימוד להתחיל את • תנאי. סגור את צימוד כאשר ~ 3 מ"ל של הקסאן נשאר מעל החול בחלק העליון של העמודה.
      הערה: לעולם לא תפסיק של • תנאי בתוך שבר בודדים על-ידי סגירת של צימוד לפני הנאספים את רוב eluate- בין שברים, אין להשאיר את צימוד סגור יותר מ ~ 1 h בגלל עיכובים יכול לשנות את האיכות ואת הדיר של • תנאי.
   7. חזור על שלבים 3.2.4 - 3.2.6 לשברים 2 ו- 3. לאסוף את השברים במבחנות בגודל מתאים לאפשר קראוון על אידוי סיבוביים, במיוחד אם הם להיות איחדו את השברים.
   8. להכין שבריר הרביעי (2% אתר) והוספתו למאגר המים. למקם את הבקבוק הבא תחת העמודה, לפתוח את צימוד, ולאסוף את השבר הרביעי. להכין שבריר החמישי; לאחר מכן, המשיכו לפי הצורך.
      הערה: זה אפשרי מתמוססות הראשון fraction(s) באמצעות רוטרי אידוי תוך איסוף השברים רצופים.
   9. להכנת שברים לשימוש ב- GC-MS ניתוחים, להשיג מסה שבר באמצעות איזון דיוק 0.01 או 0.1 מ ג. Solubilize שברים השומנים להניב 1 מ ג של השומנים לכל 1 מ"ל של הקסאן.

4. ניקוי

1. להשאיר את צימוד פתוח, היפוך העמודה כשהספל פסולת. אלומיניום אוקסיד והחול יפעל מתוך הטור; לחלופין, לנער כדי לזרז את התהליך. השתמש מוט פינים להביא את הצמר פיברגלס אם זה תקוע (להימנע מגרד זכוכית) או מכבים אותה עם זרם₂ N.
2. Dissemble ולנקות כל כלי זכוכית, באמצעות מעבדה-כיתה דטרגנט במים חמים באמבטיה פלסטיק עם מברשת כלי זכוכית (עם השיער או זיפים פלסטיק). רחץ 3 x. לשטוף היטב עם הרבה מים חמים עד הכוס היא כבר לא סליק למגע.
3. לשטוף את כלי זכוכית וכלים 3 x עם מים יונים. למקם אותם על מתלה כדי מילה נהדרת... כדי להאיץ הייבוש, להוסיף נפח קטן של אצטון (3 מ ל) את כלי הזכוכית, מערבולת, ולאפשר לו מילה נהדרת או לבדוק את זה תחת זרם₂ N.

מיצוי הבאים, את השומנים סה כ המסה הוא הסוג הראשון של נתונים שניתן לרכשה באמצעות פרוטוקול המובאת כאן. עם זאת, ערכי המונים השומנים הכולל צריך מעולם לא ניתח בלי קצת ניסיון כדי לתקנן את הערכים שהושג. מספר גישות יכול לשמש, אך אנו ממליצים גם אחידות המסה השומנים שחולצו SVL של החיה (בסנטימטרים) או המסה של העור המחסן שהופק. בתוצאות לשעבר ערך השומנים-מסה-לכל-אורך, והשני יהיה שיעור של מקור המוני. הסיבה התקינה זה כי חיות גדולות באופן טבעי לייצר יותר שומנים בעור כי יש אזור רחב יותר של פני שטח העור הכולל. איור 1A מדגימה את הקשר הזה, איפה לשפוך שחולצו בעור השומנים מסת המשקל באופן ליניארי עם המסה של העור שחולצו. ברגע סטנדרטית המחסן הכולל העור למסה, הקשר הליניארי הזה הוא לגמרי הוסר (איור 1B).

בעקבות fractionation, אותה גישה התקינה יכולה לשמש עם ההמונים שברים בודדים (איור 2). זה מוגדר נתונים לדוגמה, כל שבר לא תורמת באופן שווה השומנים שחולצו סה כ המסה: ליפידים נייטרלי (שברים 1-3) הם הקבוצה הדומיננטית של תרכובות על ידי המוני פרופורציה בהשוואה לכל קבוצה של ליפידים קוטביים יותר (שברים 4-6 7-9, 10-12).

איור 1: קשרי הגומלין בין חילוץ השומנים מסה ו קלט חומר. (א), זוחלים, היחסים בין הצריף הכולל עור מסה ו את השומנים שחולצו בעור מסה בקורלציה (P < 0.001). (B) כאשר השומנים שחולצו בעור מסה יתוקנן הכולל לשפוך מסה (השומנים המוני מחולק לצריף המונית), הקשר הזה כבר לא קיים (P = 0.46). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: סטנדרטית ההמונים שבר בעקבות • תנאי. באמצעות העמודה כרומטוגרפיה, תמציות השומנים העור יכול להיות eluted לתוך שברים, המבוססת על תרכובת קוטביות. השבר בנפח גדול, ואז, מתבטא ביחס של התמצית סה כ שומנים בדם (שבר המוני [במיליגרמים] מחולק במאסה תמצית ליפידים הכולל [במיליגרמים) כדי לקבוע את ההבדלים בין שברים או ניסיוני קבוצות⁸. העמודות מסמנות את האמצעים. השגיאה העליון הוא SEM; השגיאה התחתון הוא 95% CI. נקודות נתונים נפרדים ניתנים עבור בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: נציג כרומטוגרפי גז מתיל קטון שברים. (א) עם • נאות תנאי, מתיל קטונים הם תרכובות הנפוץ ביותר של שבר 7 בטבלה 2, ניתן לראות זוגות מחורזים של פסגות (זמן השמירה = 24-34 דקות). שבר (B) 6 בטבלה 2, עם זאת, רק התשואות תרכובות nontarget. זו אותה תוצאה יכולה להתרחש כאשר הממס קוטביים בשימוש בשלב ניידים שפג תוקפו או אם העמודה מופסק במשך פרקי זמן ארוכים (> 1 h) בין שברים. שים לב להבדל בשפע מולקולרי בין שתי העיקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: אמצעי אחסון • תנאי סטנדרטי עבור העור השומנים fractionation. אמצעי אחסון הממס ואחוזים ניתנות-נפח גדול (למשל, 250 מ ל) וגם [בנפח מצומצם] (למשל, 100 מ ל) כרומטוגרפיה עמודות באמצעות אלומינה (פעילות השלישי). הקסאן הוא הממס המוביל; דיאתיל אתר הוא השלב ניידים.

בטבלה 2: • תנאי ששונתה שיטת נחש בירית מתיל קטונים. אמצעי אחסון אלה מיועדים לשימוש עם עמודה בקבוקים בנפח מצומצם, עם המותג של אלומינה זמין כרגע. השבר eluted חיובי עבור מתיל קטונים יש bioactivity חזקה של מבחני שדה עם פראי, החיזור הזכר בירית נחשים^1,7. כדי לאשר את הנוכחות של מתיל קטונים שברים היעד, דוגמאות ניתן לדלל כדי 1 מ"ג/מ"ל וניתח באמצעות GC-גב' איור 3 מספק chromatograms נציג לקבלת תוצאות חיוביות וגם שליליות בעקבות • תנאי.

ניתן להחיל החילוץ של העור שומנים ב זוחלים העור חי או מת, בנוסף המחסן העור, אשר מציע צדדיות ביישום ניסיוני של טכניקה זו. יתרה מזאת, עקירות של שומנים בעור יכול להיעשות בשטח, כדי לאפשר יישום דינמי של השיטה למגוון רחב של ביולוגים^2,13. מיצוי של שומנים בעור היא פשוטה; לכן, זה קל לשנות את קנה המידה עקירות כנדרש לכל ניסוי או עיצוב, המתרגלים לא צריך מומחיות משמעותי לביצוע השיטות. מקדמי המגביל היחיד אולם שינוי קנה המידה הם הזמינות של fume הוד שטח, שפע של כלי זכוכית נקי, sealable, ושטח אחסון הממס.

העור השומנים תמצית fractionation יכולים להיות מותאמים לצרכים של חוקר ו, לכן, יש גמישות דומה שאיבת שומנים בדם. לדוגמה, ליפידים ניטראלי יכול להיות eluted, ואז נמחק, כתוצאה מכך בחלקים למטרה לטהר תרכובות של עניין או לפשט bioassays. Fractionation יכול להתבצע על קשקשים מרובות בתוך ועל -פני השומנים דגימות. לדוגמה, עמודות מרובות ניתן להפעיל בו זמנית כדי לייעל את התהליך. או, רק על חלק תמצית ליפידים הכולל יכול להיות fractionated על עמודה קטן לחוס, לפיכך, ריאגנטים וזמן. Fractionation מוגבל בעיקר על-ידי המסה של תמצית ליפידים הכולל את מידת הדיוק של הציוד לרשות החוקר. לדוגמה, אם החוקר יש איזון עם דיוק 10.0 מ ג, הקביעה של השבר מסה ו, לכן, הדיוק של הכנת דגימה לניתוח GC-MS באופן משמעותי, אם לא לגמרי, מופרעת. אותו דבר נכון גם לגבי כלי הזכוכית. אם החוקר יש עמודה בנפח גדול עבור fractionation אבל יש מסה השומנים הכולל קטן כדי להפריד, • תנאי או הפרדה של תרכובות יתפתחו אך ידרוש בזבוז משמעותית של ממיסים, ריאגנטים, זמן, באופן פוטנציאלי, המטרה תרכובות עצמם.

מומלץ לבצע בדיקה בקרת איכות לפני שתקבעו את ערכת • תנאי, כפי שניתן לראות בטבלה מס ' 2, ולהחליט מה שברים ייתכן ימחקו. כדי לאשר את • תנאי של ליפידים הרצוי, עמודה יכול להיות בניהול איפה כל שבר, 1-15, הוא אסף בנפרד ולאחר מכן נותחו באמצעות GC-MS. איור 3, נציג שמוצאים עקבות להראות מתיל קטונים מ בירית נחשים elute רק מהעמודה בשבריר ספציפיים. על ידי ביצוע שלב בקרת איכות, ערכה ששונה • תנאי יכול להיות מפותח זן מסוים להבטיח מקסימום תשואה של תרכובות של עניין. שינויים החומרים, כגון ספק או הרבה אלומינה או גיל דיאתיל אתר, תגרום בהחלט הבדלים • תנאי זה צריכה להיות נשלטת על-ידי ביצוע מבחן בקרת איכות.

מהטכניקות שתוארו מוגבלים בעיקר על ידי הטבע כימי של המקלות שניתן להשיג. בעיקר, שיטות אלה מאפשרות רק החוקרים לבודד ולהפריד שומנים ארוכי שרשרת מן העור של זוחלים. מינים רבים של זוחלים השתמש ברמזים באוויר ו/או proteinaceous כמו אותות כימיים, השיטות המתואר אינם תואמים עם בידוד רמזים אמר. ממיסים עוד, פולרי לא לחלץ רמזים מימית המשטחים של זוחלים או מקורות של התצהיר הסימן (למשלמים בכלוב, פלומות, המצע מימיים) שעשויים להכיל אכן שופע אותות כימיים. שיטות המתאימות עבור לכידת סוגים אלה של רמזים עומדים לרשות החוקרים (למשל, מוצק-שלב microextraction [SPME] רמזים נדיף ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים [HPLC] למקלות מימית), למרות, כמו השיטות כמתואר לעיל, יש עקומת למידה טכנית.

והכי חשוב, השירות של תערובת כימי הסופי כדי החוקר צריך מדריך בין השיטות. לדוגמה, אם חוקר רוצה לדעת אם חיית מוקדי זכר יכול להבחין בין המקלות המיוצר על ידי זכר מול נקבה בני מינו ב bioassay יישוב, החילוץ היא שהשיטה היחידה צריכה^2,3. אם הזיהוי של תרכובות dimorphic מינית היא המטרה, אולם, התמצית חייב להיטהר, כדי לאפשר ביטחון רב יותר בנתינת ההזדהויות מולקולות ספציפיות או לקבוצות של מולקולות דרך ניתוח כימי^{1, 6,9,11}. עם זאת, אפילו לערוך בדיקות עם מקור השומנים, מסה משמעותית של החל תמצית נדרש כדי שבר מדיד מיסות ניתן להשיג; אחרת, איגום של דגימות יכול להיות נרדף אך אינה אופטימלית¹⁴.

התפתחויות עתידיות של פרוטוקול זה כוללים אמצעים כדי לנצל ולהתאים את ההליך עבור מינים יותר הזוחלים. שיטות נוספות שבהן לא פולשנית של חילוץ שומנים בעור גם מפותחים.

המחברים אין לחשוף.

פיתוח שיטות אלה, במיוחד המחסן העור השומנים החילוץ, אירעה במהלך הסכמי שיתוף פעולה (14-7412-טאוב למדעי המחשב-CA, 15-7412-1155-CA ו 16-7412-1269-קה) בין ג'יימס מדיסון האוניברסיטה (JMU) חיה החקלאות האמריקאי של צמח הבריאות פיקוח שירות (APHIS). M.R.P. על תרומתם של התלמידים הבאים להתפתחות של השיטות העור המחסן: ס' פאטל (וושינגטון ו- Lee האוניברסיטה [WLU]), ג'יי. יכול (WLU), ר' פלורס (JMU), ג'יי נול (JMU) ו ס אשטון (JMU).