العزل الكيميائية والتقدير الكمي، وفصل الدهون الجلد من الزواحف

في الزواحف، شحوم الجلد من كونسبيسيفيكس تعتبر حاسمة للإشارات الجنسية، مع إمكانية استخدامها في إدارة الأنواع الغازية. هنا، يمكننا وصف بروتوكولات لاستخراج الدهون الجلد من الجلد تسلط أو الحيوانات كله، تحديد وتحليل كتلة الدهون الإجمالية، وفصل الدهون استخدام تجزئة عبر العمود اللوني.

زواحف إشارة إلى كونسبيسيفيكس باستخدام الدهون في الجلد، أساسا لتمكين رفيقه تتبع وتقييم. وقد عزل هذه الدهون الأداة المساعدة في البحوث التي تركز على أنماط التطور وآليات الاتصال الكيميائي، بالإضافة إلى فهم دور تسرب المياه من الدهون في تطور الحياة الأرضية. هذه الرموز على أساس الجلد لدى نهج التطبيقي، الاستخدام المحتمل لمديري الأحياء البرية التي تتعامل مع الأنواع الغازية. وتشمل الخطوات الرئيسية لتحديد كمية الدهون جلد الزواحف في البروتوكول المعروضة هنا الاستخراج وتحديد مجموع الدهن وتجزئة عبر العمود اللوني، العملية الأخيرة أسفر عن الواتس المنقي من المركبات التي يمكن بعد ذلك أما تحليل لتعيين هوية المركبة (مثلاً، الفصل اللوني للغاز-الكتلي [GC-MS]) و/أو استخدامها مباشرة في المقايسة أكثر دقة. شحوم الجلد يمكن أن تستخلص من جلد الحية، وإلقاء الحيوانات الجلد، أو ميتا كله، واستخدام المذيبات العضوية nonpolar (مثلاً، الهكسين، البنزين، التولوين). استخراج سولوبيليزيس الدهون، وبعد ذلك، يمكن أن تبخر المذيب تؤتي استخراج الدهن فقط قابلة لقياس. وجود ينطوي على الفصل بين استخراج الدهون الإجمالية إلى الواتس المحددة عن طريق عمود التقليدية اللوني. استخراج الدهن المجموع أولاً منضماً إلى عمود على أساس الركيزة (مثلاً، الألومينا)، وبعد ذلك، يتم تمرير الواتس الفردية ("كسور") من المذيبات في مجلدات محددة تسلسلياً من خلال العمود إلى الوت مجموعات من المركبات من خليط الدهن قطبية على أساس مشترك. التقدم الكسور في قطبية في سلسلة موحدة عن طريق زيادة كمية المذيب القطبي (مثلاً، الاثير ثنائي إثيل) النسبي في المذيبات نونبولار. في هذه المخطوطة، نحن وصف عدة طرق لاستخراج الدهون الجلد من الزواحف وثم تقديم بروتوكول قياسي لعزل مجموعات مختلفة من مركبات استناداً إلى قطبية، باستخدام كروماتوغرافيا العمود التقليدي. يستخرج الدهن كله أو الكسور محددة، ثم استخدامها في المقايسة لتحديد أي النشاط البيولوجي أثارت بالمركبات فيها.

زواحف إنتاج الدهون في البشرة، أما مباشرة من خلايا الجلد أو من الغدد المنفصلة التي يتم استخدامها في الاتصالات الاجتماعية، مثل تقييم رفيقه وتتبع والاختصاص، وداخل والاعتراف^{1،2 ،،}من³⁴. وقد عزلة هذه الدهون الجلد الأداة المساعدة في البحوث التي تركز على أنماط التطور وآليات الاتصال الكيميائي، بالإضافة إلى فهم دور الدهون في تطور الحياة البرية^{2،3 تسرب المياه ،4}. علاوة على ذلك، العديد من الزواحف، لا سيما سكواماتيس (السحالي، الأفاعي)، الأنواع الغازية من القلق في النظم الإيكولوجية الحساسة، وهو وضع السحر القائم على فرمون لتحسين تعويض اللون وإزالة الجارية^5،6. كتوم جلد الزواحف يسهل استخراج الدهون الحالية للحصول على عمليات الاستخراج نقي نسبيا من مصدر الإشارات الكيميائية يحتمل أن تكون قوية. وتشمل خطوات مبدأ التحديد الكمي للدهون البشرة الزواحف في البروتوكول وصف الاستخراج وتحديد مجموع الدهن وتجزئة عبر العمود اللوني^1،،من⁶⁷. وقد استخدمت الأساليب بشكل روتيني كما أنها تسفر عن النشطة بيولوجيا المعزولة التي تشرح الكثير عن اختيار رفيقه والاختيار، ولا سيما في الثعابين².

ويمكن استخراج الدهون الجلد من الجلد الحية أو تسليط الجلد، أو الزواحف الميت كله، باستخدام نونبولار أو المذيبات العضوية القطبية^1،7،،من⁸⁹. تجدر الإشارة إلى أن متحف العينات المخزنة في المذيبات مثل الإيثانول ليست الأمثل لاستخراج الدهون الجلد، وينبغي النظر كمصادر محتملة لاستخراج جثث فقط طازجة أو مجمدة طازجة. شحوم الجلد خاملة، مما يجعلها مستقرة على سطح الجلد وسهلة لاستخراج⁷. في إرسال الإشارات بدورها في الإيكولوجيا الزواحف، تودع العظة دهن الجلد غالباً في بيئات قاسية، ولكن بسبب خصائصها الكيميائية قوية، يمكن الاحتفاظ بهذه الرموز على المعلومات القيمة على مدى فترات طويلة من الوقت^{10،11 , 12}-عملية الاستخراج سولوبيليزيس الدهون، استخدام مذيب nonpolar (مثلاً، الهكسين، البنزين، التولوين) عبر نقع ساعات طويلة، متبوعاً بتبخر المذيب، ترك كتلة يمكن قياسها ل استخراج الدهن^{7 , 8}. الدهون البشرة شديدة الامتزاج في المذيبات nonpolar، ومجموعة واسعة من المواد الهيدروكربونية يمكن استخلاصها من مجموعة متنوعة وكذلك من المصادر.

وجود أكثر شاقة من استخراج ولكن يعمل على فصل استخراج الدهن الكلي إلى كسور معينة عن طريق عمود اللوني، للمساعدة في تحديد هوية المركبات تنقية وممكن فيه^{1، 6 , 7 , 8}-استخراج الدهن مجموع منضماً إلى عمود المستندة إلى الركازة، وثم يتم تمرير الواتس الفردية ("كسور") من المذيبات في مجلدات محددة التتابع من خلال العمود إلى الوت مجموعات من المركبات من خليط الدهن التي تكون مشتركة قطبية^6،،من⁷⁸. في الفصل اللوني للدهن، توحيد التقدم الكسور في الأقطاب في بعض التسلسل بزيادة المبلغ النسبي من المذيبات القطبية (مثلاً، الاثير ثنائي إثيل) في المذيبات nonpolar (عادة معبراً عنه بنسبة مئوية: 0%، 2%، الاثير 4 ٪، إلخ. )^6،،من⁷⁸. على الرغم من أن أساليب مثل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) يمكن استخدامها لفصل الدهون في خليط وهي أبسط، كروماتوغرافيا العمود المفضل لأنه يستخدم نظام مغلق، سهل للسيطرة، ويمكن أكثر منفصلة تتركز المخاليط، ومتوافق مع الإرسال المتعدد للكفاءة. في هذه المخطوطة، نحن وصف عدة طرق لاستخراج الدهون الجلد من الزواحف وثم تقديم بروتوكول قياسي لعزل مجموعات مختلفة من مركبات استناداً إلى قطبية، باستخدام كروماتوغرافيا العمود التقليدي. في العديد من مشاريع البحوث التي تنطوي على عزل الإشارات الكيميائية، الهدف النهائي لإحداث تغيير في أجهزة الاستقبال يتعرضون لتلك الرموز. يستخرج الدهن كله أو أجزاء محددة، ثم استخدامها في المقايسة لتحديد أي النشاط البيولوجي أثارت بالمركبات فيه^1،2،،من⁶⁷. في البحوث البيولوجية الأساسية، على سبيل المثال، المقايسة استخدام الكسور محددة يمكن أن تكشف للباحثين أن مصدر المنقي من الفيرومونات ظلت معزولة، وبعد ذلك، يمكن السعي إلى أساليب للتعرف على المركبات المستهدفة. من منظور إدارة الحياة البرية، لا يمكن تحديد الهدف، وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الكسر النشطة في الميدان لجذب conspecifics بالفخاخ أو تمنع رفيقه تتبع في^13،غير الأصلية الموئل¹⁴.

بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الفقاريات برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة جيمس على ماديسون.

1-استخراج

1. إلقاء استخراج الجلد
   1. جمع حوالي 30 سم² من تسلط من زواحف واحد، إزالة الرأس والمقاطع المذرق التي يمكن أن تلوث العينات. ارتداء القفازات ﻛﻟﻭﺭﻭﺑﺭﻳﻧ وتنظيف حظيرة الحطام.
   2. الفارغة التوازن مع حقيبة أو وزن القارب وتزن تسلط (± 0.01 g).
      ملاحظة: يتم تحديد الدقة الشامل بدقة التوازن. تسليط الجلد الشامل هو عامل توحيد لكتلة الدهن المستخرج من الجلد (انظر أدناه)، وكوفاريس إلى حد كبير مع الدهن المستخرج الجماهيري.
   3. فصل تسلط إلى قطع صغيرة (5 سم²) وإضافتها إلى حاوية زجاج يمكن إغلاقها بشرط مع غطاء المتوافقة مع الهكسين (مثلاً، جرة ميسون زجاج مع غطاء معدني أو من قارورة مختبر مع غطاء PTFE). صب ما يكفي الهكسين في الحاوية إلى غمر القطع تسليط الجلد تماما. ختم الحاوية.
      تنبيه: الهكسين القابلة للاشتعال، مهيجة الجهاز تنفسي، ويترافق مع عدة القصيرة الأجل والطويلة الأجل المخاطر الصحية. يتم تنفيذ الإجراءات التي تنطوي على الهكسين في غطاء الدخان (المختبر) أو في الهواء الطلق (حقل) أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) (مثلاً، نظارات دفقة، قفازات ﻛﻟﻭﺭﻭﺑﺭﻳﻧ، اكمام طويلة، وأحذية إغلاق الأصابع).
   4. قم بتسمية container(s) بالقلم الرصاص أو القلم المقاوم للمذيبات. إجازة في container(s) في غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها أو تصل إلى 24 ساعة.
   5. إزالة القطع تسليط استخدام الملقط معدنية نظيفة أو ملقط. اهتزاز القطع للاحتفاظ بأي الهكسين المتبقية في الحاوية. السماح بقطع الجلد لتجف على مناشف ورقية؛ ثم، تجاهلها. إذا كان يتم يجري تنفيذ عدة عمليات الاستخراج، تنظيف ملقط/الملقط بين كل عينة. لتنظيف ملقط/الملقط، شطف لهم في ~ 50 مل الهكسين في كوب.
   6. إذا كان النص المقتبس ليس لاستخدامها فورا، صب أو "الماصة؛" الاستخراج إلى قنينة زجاج من الحجم المناسب وختم ذلك بحد أقصى مبطنة PTFE وتسميته وتخزينها في-20 درجة مئوية.
      تنبيه: لأنه يتضمن الاستخراج الهكسين، تخزين قارورة في الثلاجة الانفجار.
2. استخراج الحيوان الميت كله
   1. تسجيل طول آنف تنفيس (سفل؛ بالسنتيمتر) وكتلة (بالغرام) من الحيوان. إذا كان إجمالي إنتاج الدهن أو فرمون كل وحدة مساحة سطح الجلد يتحدد، استخدم شريط قياس خياط للحصول على محيط الجسم الحد الأقصى (بالسنتيمتر).
   2. للاستخراج, اختر حاوية التي يبلغ قطرها 1/3 من طول الحيوان. ضع الذبيحة بشكل أمن في الجزء السفلي من الحاوية مع الرأس ومجرور في الأعلى. صب الهكسين كافية في الحاوية لتحقيق أقصى قدر من المساحة السطحية المغمور من الجسم.
      ملاحظة: إذا أصبح غمر الرأس أو مجرور لأي مبلغ من الوقت في استخراج، الإحاطة علما.
   3. تأمين الغطاء وتسمية الحاوية ونقع عليه في غطاء دخان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها أو تصل إلى 24 ساعة.
   4. عند إزالة الذبيحة، استخدام الملقط معدنية نظيفة أو ملقط. تحتفظ الهكسين المتبقية على الجثة في الحاوية بالسماح لها بالتنقيط من الجسم، وليس من الرأس أو الذيل. ختم الحاوية.
   5. إذا كان النص المقتبس ليس لاستخدامها فورا، صب الاستخراج أو "الماصة؛" في قنينة زجاج من الحجم المناسب وختم ذلك بحد أقصى مبطنة PTFE وتسميته وتخزينه في-20 درجة مئوية.

2-الدهن التصميم الجماعي

ملاحظة: الدهن المستخرج يمكن تحديد الكتلة في واحدة من طريقتين: مع قنينة زجاج أو قارورة مستديرة القاع، استخدام مبخر دوراني.

1. تحديد الدهن المستخرج الجماعي عن طريق الأسلوب قنينة الزجاج.
   1. استخدم قنينة بريويغيد من حجم كاف (مل 7، مل 22، 50 مل، إلخ). تشمل عملية النداءات الموحدة، والتسمية في الكتلة الإجمالية، أو دائماً وزن القنينة دون غطاء وتسمية (علامات على التسمية أيضا إضافة كتلة). ضع التسمية في عنق قارورة لتجنب الاتصال بالمياه.
      ملاحظة: التبخر في قارورة من الزجاج غير فعالة إذا كان الباحث الوصول إلى نظام غاز متعددة حيث يمكن تبخرت قارورة متعددة في نفس الوقت تحت دفق₂ ن.
   2. نقل الاستخراج إلى القنينة، واستخدام ماصة زجاجية مع لمبة مطاط، أو لكبر حجم مقتطفات، وحدة تحكم ماصة إلكترونية مع ماصة زجاجية المتاح 10 مل. شطف الحاوية مع ~ 3 مل من الهكسين ونقل إلى القنينة كذلك.
   3. تتبخر العينة تحت تيار₂ ن لطيف. إمالة القنينة في زاوية لتمكين مساحة سطحية المذيبات كحد أقصى. وسوف تشكل المكثفات خارج القنينة كما يتبخر الهكسين.
      ملاحظة: سوف تشكل حلقات من الدهن كما يتبخر الهكسين، في القنينة عباب ذلك دورياً الاستخراج.
   4. تتبخر العينة إلى جفاف؛ ثم، ريويغ. سجل عائد إجمالي الدهون.
      ملاحظة: للتحليل عبر المجموعات المختلفة وتوحيد الدهن الجماعي أما إلى إلقاء الجماهيري (كتلة الدهن [في غرام] مقسوماً على كتلة تسليط [في غرام] × 100 غلة كتلة الدهن المئوية تسلط) أو سفل الحيوان (دهن كتلة [في ملليغرام] مقسوماً على سفل] في سنتيمتر]؛ غلة كتلة الدهن كل وحدة طول). أكبر الحيوانات تنتج المزيد من الدهون، والعديد من الأنواع ديمبرافيك بقوة عن طريق الاتصال الجنسي، الذي يفرض تحيز كبير في البيانات.
2. تحديد الدهن المستخرج الشامل عبر مبخر دوراني.
   1. تبخر أسرع كل عينة الفردية، نقل الاستخراج إلى قارورة مستديرة القاع بريويغيد وتتبخر باستخدام مبخر دوراني.
      1. في حالة ملاحظته في الاستخراج الجسيمات، تصفية العينة بوضع مخروط ورق الترشيح في عنق قارورة؛ ثم نقل المقتطف قارورة والسماح لها بتصفية الجاذبية. التخلص من ورق الترشيح بعد أن يتم نقل استخراج كامل.
         ملاحظة: نقل حجم العينة (تصل إلى حجم قارورة ~ 80%) قبل تبخر دوارة. أي محتدما للاستخراج إلى المكثف مبخر دوراني يسبب التلوث ويتطلب المكثف تنظيفها. يمكن وضع فخ عثرة بين قارورة والرقبة المكثف إذا تحدث الفقاعات أو "الاهتزاز" في معظم العينات.
   2. تشغيل الطاقة إلى حمام مبخر والمياه الدوارة (50 درجة مئوية؛ وأقل من نقطة الغليان المذيبات). قم بتشغيل تدفق المياه الباردة المكثف.
      ملاحظة: المكثف مبخر دوراني متصل المبردات المتداولة أو حنفية المياه الباردة التنفيس إلى استنزاف. يمكن أن يكون معدل تدفق بطيء إذا كان الماء أكثر برودة من المحيط، لتكثيف بخار المذيبات ترك في قارورة ودخول مكثف.
   3. قم بتشغيل المصدر فراغ (فراغ الماء أو مضخة). تأكد من ضغط فراغ كافية للاحتفاظ قارورة في الرقبة المكثف. فتح التنفيس في نهاية المكثف قبل الاتصال قارورة. الشريحة قارورة على رقبة المكثف، إغلاق التنفيس الختم، وضمان قارورة لا قطع المكثف عندما يتم تحريرها في قارورة.
   4. أقل في قارورة حتى ~ 50% هي غارقة في الحمام. بدء دوران قارورة على سرعة متوسطة. حالة الفراغ، وسرعة وتدفق مكثف، ودرجة حرارة الحمام المثلى، سوف تتكثف على اللولب بخار المذيبات ترك في قارورة والتنقيط في قارورة الانتعاش.
      1. إذا كان يغلي العينة (مثلاً، فقاعات كبيرة، الغاز السريع)، الحد فورا من فراغ و/أو سرعة مبخر دوراني. إذا استمر الغليان، إيقاف دوران قارورة وإيقاف الفراغ، رفع قارورة من الحمام، والإفراج عن ختم فراغ. كرر الخطوتين 2.2.3 و 2.2.4.
         ملاحظة: إذا كان هو جمع لا مذيب في قارورة الانتعاش ولكن من الواضح هو التبخر الاستخراج الفراغ nonoptimal على الأرجح ويجب تعديلها.
   5. تتبخر العينة تحت الفراغ حتى ~ 2 مل بقايا المذيبات في قارورة (مقتطفات كبيرة الحجم)، أو إذا كان يستخدم قارورة بريويغيد، تتبخر حتى حبة سائل مع < مرئياً قطرها 1 سم في الجزء السفلي قارورة. إيقاف تشغيل بالتناوب والفراغ؛ بعد ذلك، رفع قارورة خارج الحمام.
   6. عقد الرقبة قارورة كالفراغ الذي هو الإفراج عن الختم؛ ثم تطور الرقبة الانزلاق من المكثف. إذا كان يتم استخدام قارورة حجم كبير، دوامة استخراج مكثف في قارورة لإذابة الدهون المرئية؛ ثم قم بنقل الحل عن طريق الماصة لقارورة صغيرة الحجم، بريويغيد. أضف 3 مل الهكسين شطف قارورة كبيرة ودوامه، "الماصة؛" أن قارورة أصغر، وتتبخر مرة أخرى (الخطوات 2.2.3-2.2.5).
   7. سوف ترسخ حبة السائل في الاستخراج كما يتبخر الهكسين. وبمجرد جفاف، تسمح لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. وسوف تشكل الدهون بيضاء شفافة، بالشمع الأصفر في قارورة (~ 5 دقائق). وزن قارورة للحصول على الكتلة النهائي.
      ملاحظة: اعتماداً على طبيعة الدهون المستخرجة، سيكون لديهم الصلبة (مثلاً، شمع) أو خصائص سيميسوليد (مثلاً، النفط الخام)، ولا سيما عندما يتم تبخر الدهون هورمونات (انظر أدناه).
3. جعل الدهون في حجم المسجلة من الهكسين تؤتي ملغ إيه وان دهن كل 1 مل الهكسين. حجم العمل لتتقدم للفصل اللوني ~ 5 مل. إذا كان نقل من قارورة فيال، والإبقاء على 2 مل من إجمالي حجم شطف في قارورة بعد نقل أغلبية الاستخراج إلى القنينة.
4. تسمية قارورة وختم عليها مع قبعات مبطنة PTFE وتخزينها في-20 درجة مئوية.

3-العمود اللوني

ملاحظة: لفصل مركبات غير معروفة استناداً إلى قطبية في محددة الكسور، الدهن المستخرج الجماهيري يمكن أن تكون الأعمدة اللوني السائل إضافة إلى استعداد ومجزأ استخدام شطف القياسية.

1. إعداد العمود
   1. اعتماداً على الكتلة الدهنية في المقتطف، استخدام أما الكبيرة-أو عمود كروماتوغرافيا زجاج صغيرة الحجم مع محبس الحنفية تفلون. أما مزودة بالعمود أو تنصهر إلى مستودع التخزين الثابتة (500 مل لعمود كبير؛ 250 مل لعمود صغيرة). من الآن فصاعدا، هذا البروتوكول إلا يشير إلى عمود الفصل لوني لكميات كبيرة تنصهر إلى خزان. دقة تنظيف أي الأواني الجديدة وأجزاء لاستخدامها في الفصل اللوني كما هو موضح في القسم 4؛ ثم شطف لهم مع الهكسين أو المذيبات نونبولار آخر.
   2. اطوِ قطعة من الصوف الزجاجية (~ 14 سم في الطول [ل] x 4 سم في العرض [W]) عدة مرات حتى يتم تشكيل ساحة ~ 4 سم × 4 سم. استخدم قضيب وتد خشبي أطول من العمود لوضع الألياف الزجاجية في الجزء السفلي من العمود.
   3. تأمين العمود في غطاء لموقف خاتم قياسية مع المشابك اثنين (مثلاً، قطب أو وحدات)، واحد أعلاه محبس الحنفية وواحدة أسفل رقبة الخزان. مستوى العمود. ضع العمود على ارتفاع المسافة العمل كافية للكأس 500 مل لتناسب بسهولة تحت العمود السماح. فتح في محبس الحنفية.
   4. صب المجففة الرمال في العمود، ضعه ~ 3 سم رمل أعلاه الألياف الزجاجية وغسلها. ضع ورقة سوداء أو داكنة تحت العمود واضغط عليها بلطف. إذا كان الرمل يسقط من العمود مع كل برنامج المشورة التقنية، الحاجز الألياف الزجاجية غير كافية. كرر الخطوات 3.1.2-3.1.4.
      ملاحظة: استخدم مشبك تكشفت مسجلة في نهاية قضيب الوتد لجلب الألياف الزجاجية من الأسفل.
   5. ضع الكأس 500 مل تحت العمود. صب ببطء ~ 25 مل الهكسين من الكأس 100 مل أو اسطوانة في الخزان العمود على الرمل الرطب. أغلق محبس الحنفية عندما يكون هناك سم ~0.5 من الهكسين فوق الرمال.
   6. تزن من الألومينا محايدة. لكل عمود الصغيرة، استخدم ز ~ 50؛ ~ 175 غ لكل عمود كبير. صب الألومينا في قارورة Erlenmeyer ل 1. حد 400 غرام ألومينا في قارورة 1 لتر.
   7. لتفعيل الألومينا (النشاط الثالث)، "الماصة؛" المياه لوحدة التخزين يساوي 6% الألومينا الكتلة (أي، على 100 جرام من أكسيد الألومنيوم، إضافة 6 مل من الماء). أضف الماء كقطرات في جميع أنحاء الألومينا.
   8. وتغطي قارورة مع رقائق الألومنيوم أو فلين. قوة دوامة (لم يهز) لتفريق هذه التهمة بالتساوي. تستمر حتى تبقى لا كتل مرئية.
      ملاحظة: سوف الدافئة قارورة كما يتفاعل الماء مع شركة ألومينا، الذي من المتوقع.
   9. إضافة الهكسين حتى تغطي تماما الألومينا، مع سم ~0.5 من الهكسين أعلاه الألومينا. دوامة قارورة لتشكيل الطين.
   10. ضع قمع تنفيس في الخزان للعمود وكوب زجاج 500 مل أسفل العمود. فتح في محبس الحنفية. دوامة واﻷلومينا واطراد صب ذلك في العمود. ضمان الألومينا هو تسوية بالتساوي في العمود ولا فقاعات كبيرة أو تشكل الشقوق في العمود الألومينا. اضغط بلطف الجانب من العمود إلى تسوية بالتساوي الألومينا.
       ملاحظة: يجب إضافة الهكسين إضافية ليصب إضافية، الاحتفاظ الطين. يمكن إعادة استخدام الهكسين جمع في الكأس تحت العمود إذا كان كوب زجاج نظيفة في البداية.
   11. العمود تتشكل عندما أعلى أكسيد الألومنيوم مستقرة و ~ 4 سنتيمترات تحت رقبة العمود في قاعدة الخزان. استخدام ماصة شطف داخل الخزان مع الهكسين لشركة ألومينا المتبقية. برفق باستخدام قمع، إضافة طبقة ثانية من الرمال على رأس شركة ألومينا، إلى ~ 1 سم أسفل الخزان.
       ملاحظة: سوف تتدفق الهكسين من العمود كما محبس الحنفية لا تزال مفتوحة. لا تدع العمود تجف. إذا كان العمود يجف، يجب أن تبدأ العملية مرة أخرى، بدءاً من الخطوة 3.1.2. يمكن إيقاف البروتوكول هنا إذا تعد الأعمدة يوميا قبل وجود. بشدة وضع فلين في الجزء العلوي من الخزان أو تغطية ذلك محكم مع إحباط. ملء الخزان مع ~ 100 مل الهكسين. تشديد في محبس الحنفية.
2. تجزئة لاستخراج الدهن
   ملاحظة: بغض النظر عن حجم العمود، الكسور لاستخراج الدهن يمكن جمعها على حدة وتجمع استناداً على قطبية الكسر أو التخلص منها تماما إذا كانت لا تحتوي على أي من المركبات المعروفة باسم/تحديد الهدف. جولات من تكرار شطف (n = 3 مجلدات) يتم تمريرها من خلال العمود إلى ضمان شطف كافية الدهون. اتبع الجدول 1 شطف العمود كبيرة (مع مقتطف الشامل > 30 ملغ) أو شطف العمود الصغيرة (مع مقتطف الشامل < 30 ملغ). بروتوكول شطف المصممة خصيصا لعزل كيتونات الميثيل فقط في الجدول 2.
   1. أما إزالة الهكسين المتبقية في الجزء العلوي من العمود، استخدام ماصة كبيرة الحجم، أو السماح الهكسين بالتنقيط خارجاً في كوب نظيف. اترك ~ 3 مل الهكسين فوق الرمال في الجزء العلوي من العمود.
      ملاحظة: الهكسين المجمعة محض إذا اتصلت تنظيف الأواني الزجاجية ويمكن إعادة تدويرها في الكسر الأولى فقط.
   2. نقل استخراج الدهن إلى العمود، باستخدام ماصة زجاجية طويلة. ببطء "الماصة؛" استخراج لتجنب الإخلال بطبقة الرمل. شطف قنينة استخراج أو قارورة مع مل ~ 5 من الهكسين ونقلها إلى العمود.
      ملاحظة: إذا تم تخزين الاستخراج في-20 درجة مئوية، وسوف عجلت الدهون. الحارة القنينة حتى مرئياً متسرعا لا أكثر.
   3. فتح في محبس الحنفية والسماح بالعينة لتحميل في العمود. إذا كان للاستخراج كتلة كبيرة (> 30 ملغ)، فرقة مصفر قد تكون مرئية في شركة ألومينا، أسفل الرمال في الجزء العلوي. جمع من خلال التدفق في كوب نفايات كما لم يعد هذا الهكسين نظيفة. أغلق في محبس الحنفية عندما ~ 3 مل يبقى على رأس الرمل.
      تنبيه: الدهن في المقتطف، ملزمة الآن بأكسيد الألومنيوم والعمود، ولا تجف أو العينة سوف تضيع.
   4. ضع بريويغيد ووصفت الجولة-أسفل قارورة (100 مل أو 250 مل 500 مل) تحت العمود قبل سكب الكسر الأول. يمكن جمع الكسور لإهمالها في حاوية زجاجية مشتركة.
   5. إعداد جزء أول (الهكسين: 0 100% % إثيل الاثير [حتى الآن، "الاثير"]) في اسطوانة تخرج. إذا كان إعداد الكسور في وقت مبكر، تغطي بإحباط أو سداده مع الفلين.
      ملاحظة: الكسور التقدم في القطبية؛ ولذلك، لا يلزم الاسطوانة أن تشطف بين الكسور.
   6. إضافة الكسر الأولى للخزان بصب عبر زجاج تنفيس قمع الموجهة إلى جنب خزان لتجنب الإخلال بطبقة الرمل. فتح محبس الحنفية البدء شطف. قم بإغلاق في محبس الحنفية عندما يبقى ~ 3 مل الهكسين فوق الرمال في الجزء العلوي من العمود.
      ملاحظة: تتوقف ابدأ شطف داخل جزء فردية عن طريق إغلاق في محبس الحنفية قبل تم جمع غالبية النذرة. بين الكسور، لا تترك محبس الحنفية مغلقة لمدة أطول من ح ~ 1 لأن التأخير يمكن أن تغير نوعية والتكرار شطف.
   7. كرر الخطوات 3.2.4-3.2.6 للكسور 2 و 3. جمع الكسور في قوارير حجم مناسب تسمح headspace لتبخر دوارة، خاصة إذا كان يتم تجميع الكسور.
   8. إعداد جزء الرابع (أثير البروم ثنائي الفينيل 2 ٪) وإضافته إلى الخزان. ضع قارورة القادم تحت العمود وفتح محبس الحنفية جمع الكسر الرابع. إعداد جزء الخامس؛ ثم يستمر حسب الحاجة.
      ملاحظة: من الممكن أن تتبخر fraction(s) الأولى عن طريق التبخر الروتاري حين جمع الكسور المتعاقبة.
   9. لإعداد الكسور لاستخدامها في تحليل GC-MS، الحصول على كتلة كسر استخدام توازن دقة 0.01 أو 0.1 مغ. جعل الكسور الدهن يعطي 1 ملغ من المادة الدهنية في 1 مل الهكسين.

4-تنظيف

1. ترك في محبس الحنفية مفتوحة وعكس العمود في الكأس النفايات. أكسيد الألومنيوم والرمل سوف تنفد من العمود؛ وبدلاً من ذلك، يهز للإسراع بالعملية. استخدم قضيب وتد لجلب الصوف الزجاجية إذا كان عالق (تجنب خدش الزجاج) أو ضربة بها مع دفق₂ ن.
2. راءى وتنظيف جميع الأواني الزجاجية، استخدام المنظفات الصف المختبر في الماء الساخن في حوض بلاستيك بفرشاة الأواني زجاجية (مع الشعر أو شعيرات البلاستيكية). أغسل 3 x. أشطف جيدا بالكثير من الماء الدافئ حتى الزجاج لم يعد بقعة للمس.
3. شطف الأواني الزجاجية وأدوات x 3 مع المياه. وضعها على رف أيردري. للإسراع التجفيف، إضافة كمية صغيرة من الأسيتون (3 مل) للأواني الزجاجية، دوامة، والسماح لها أيردري أو تشغيله تحت دفق₂ ن.

استخراج التالي والدهن الكلي الشامل هو النوع الأول من البيانات التي يمكن الحصول عليها من خلال البروتوكول المعروضة هنا. ومع ذلك، ينبغي تحليل الدهن مجموع القيم الجماعية ابدأ دون بعض المحاولات لتوحيد القيم التي تم الحصول عليها. يمكن استخدام العديد من الطرق، ولكن نوصي أما توحيد كتلة الدهن المستخرج إلى سفل الحيوان (بالسنتيمتر) أو إلى الكتلة من الجلد تسليط التي تم استخراجها. ستكون النتائج السابقة في قيمة الدهن الجماهيري على طول وهذا الأخير نسبة مصدر الشامل. للتوحيد والسبب أن الحيوانات الأكبر بطبيعة الحال إنتاج الدهون البشرة أكثر لأن لديهم جلد مجموع مساحة أكبر. الشكل 1A تجسد هذه الرابطة، حيث تسلط جداول الدهن المستخرج من الجلد الشامل خطيا مع الكتلة الجلد المستخرجة. مرة واحدة موحدة تسلط مجموع كتلة الجلد، هذه العلاقة الخطية تماما إزالة (الشكل 1B).

بعد تجزئة، يمكن استخدام نفس النهج التوحيد مع جماهير كسور الفردية (الشكل 2). في هذه المجموعة من بيانات العينة، كل جزء لا تساهم على قدم المساواة الدهن المستخرج مجموع الكتلة: الدهون محايدة (الكسور 1-3) هي المهيمنة مجموعة المركبات نسبة الشامل بالمقارنة مع كل مجموعة من أكثر الدهون القطبية (الكسور 4-6 و 7-9 و 10-12).

رقم 1: العلاقات بين استخراج الدهن الجماعي وإدخال المواد- (أ) في الزواحف، الجلد العلاقة بين تسلط مجموع الكتلة والدهن المستخرج من الجلد الجماهيري يرتبط ارتباطاً إيجابيا (ف < 0.001). (ب) عند الدهن المستخرج من الجلد الجماهيري هو موحدة لمجموع تسليط الجماعية (الدهن مقسوماً على كتلة تسلط الشامل)، هذه العلاقة لم تعد موجودة (ف = 0.46). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: توحيد الجماهير الكسر بعد شطف. استخدام كروماتوغرافيا العمود، يمكن التيد مقتطفات دهن الجلد إلى الكسور، استناداً إلى قطبية المركب. الكسر، ثم أعرب عن كتلة كنسبة من استخراج الدهن الكلي (كتلة كسر [في ملليغرام] مقسوماً على مجموع الدهن استخراج كتلة [في ملليغرام) لتحديد الاختلافات بين الكسور أو تجريبية وتضم⁸. الأشرطة تمثل الوسائل. الخطأ أكبر من وزارة شؤون المرأة؛ خطأ أسفل هو CI 95%. يتم توفير نقاط البيانات الفردية للوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: الممثل تشروماتوجرافس غاز الميثيل كيتون الكسور. (أ) مع شطف السليم، كيتونات الميثيل هي المركبات الأكثر وفرة في جزء 7 من الجدول 2 ، ويمكن اعتبار مقاطع قمم (الوقت الاحتفاظ = 24-34 دقيقة). ومع ذلك، جزء (ب) 6 من الجدول 2، غلة فقط المركبات nontarget. يمكن أن تحدث هذه النتيجة نفسها عند انتهاء صلاحية المذيب القطبي المستخدمة في المرحلة المحمول أو إذا تم إيقاف تشغيل العمود لفترات طويلة من الزمن (> ح 1) بين الكسور. لاحظ الفرق بين آثار اثنين في وفرة الجزيئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: وحدات التخزين شطف القياسية للجلد الدهن تجزئة. وحدات تخزين المذيبات والنسب المئوية لمنح كبيرة الحجم (مثلاً، 250 مل) و [صغيرة الحجم] (مثلاً، 100 مل) أعمدة اللوني باستخدام أكسيد الألومنيوم (النشاط الثالث). الهكسين هو المذيب الناقل؛ إثيل الاثير هو المرحلة المتنقلة.

الجدول 2: مخطط شطف معدلة للرباط الأفعى الميثيل كيتونات. تكون وحدات التخزين هذه للاستخدام مع عمود كروماتوغرافيا صغيرة الحجم، ومع العلامة التجارية لشركة ألومينا المتاحة حاليا. وقد الكسر التيد الإيجابية كيتونات الميثيل بيواكتيفيتي قوية في الاختبارات الميدانية مع الحياة البرية ومغازلة الذكور الرباط الأفاعي^1،7. لتأكيد وجود الميثيل يمكن أن تضعف إلى 1 مغ/مل كيتونات في كسور المستهدفة، عينات وتحليلها عن طريق GC-السيدة يوفر الشكل 3 تشروماتوجرامس الممثل للنتائج الإيجابية والسلبية على السواء بعد شطف.

استخراج الدهون الجلد في الزواحف يمكن تطبيقها على الجلد حية أم ميتة، بالإضافة إلى تسليط الجلد، مما يوفر مرونة في التطبيق التجريبي لهذا الأسلوب. علاوة على ذلك، يمكن أن يتم استخراج الدهون الجلد في الميدان، لتمكين تطبيق ديناميكية للأسلوب لمجموعة واسعة من علماء الأحياء^2،13. استخراج الدهون البشرة بسيط؛ ولذلك، فمن السهل أن توسيع نطاق عمليات الاستخراج حسب الحاجة لكل تجربة أو تصميم، والممارسين لا تحتاج خبرة كبيرة تنفيذ الأساليب. هي العوامل الوحيدة التي تحد للارتقاء بمستوى توافر مساحة غطاء الدخان، ووفرة من الأواني نظيفة، ويمكن إغلاقها بشرط، ومساحة تخزين المذيبات.

تجزئة استخراج دهن الجلد يمكن تكييفها لاحتياجات للباحث، وذلك، مرونة مماثلة لاستخراج الدهن. على سبيل المثال، يمكن التيد الدهون محايدة وثم التخلص منها، أن يسفر عن كسور المستهدفة قد تنقية المركبات ذات الأهمية أو تبسيط المقايسة. يمكن أن يتم تجزئة في جداول متعددة داخل وعبر عينات الدهن. على سبيل المثال، يمكن تشغيل أعمدة متعددة في وقت واحد لجعل العملية أكثر كفاءة. أو، يمكن مجزأ فقط جزء من خلاصة مجموع الدهون في عمود صغير وبالتالي، قطع الغيار الكواشف والوقت. المقام الأول يقتصر وجود كتلة استخراج الدهن الكلي ودقة المعدات المتاحة للباحث. على سبيل المثال، إذا كان الباحث توازن بدقة مغ 10.0، تحديد الكسر جماعية، ومن ثم، دقة إعداد نموذج لتحليل GC-MS هو إلى حد كبير، أن لم يكن كلياً، إعاقة. نفس الشيء صحيح بالنسبة الأواني الزجاجية. إذا كان الباحث عمود الحجم الكبير لتجزئة ولكن لديه كتلة الدهون إجمالية صغيرة لفصل، شطف أو فصل من المركبات سوف تقدم لكن سيتطلب من هدر كبير المذيبات، الكواشف، والوقت، ويحتمل أن الهدف مركبات أنفسهم.

وينصح بإجراء فحص مراقبة الجودة قبل تحديد مخطط شطف، كما هو مبين في الجدول 2، وأن تقرر ما هي كسور قد يتم تجاهل. للتأكد من شطف الدهون المرغوب، عمود يمكن أن يكون تشغيل حيث جمعت على حدة كل جزء، 1-15، وتحليلها ثم استخدام GC-MS. في الشكل 3، تظهر آثار الممثل الغاز اللوني أن الكيتونات الميثيل من الثعابين الرباط الوت فقط من العمود في جزء معين. قبل تنفيذ هذه الخطوة مراقبة الجودة، ويمكن وضع نظام شطف معدلة لنوع معين لضمان أقصى غلة من المركبات ذات الأهمية. على الإطلاق سيؤدي إلى تغييرات في المواد، مثل المورد أو الكثير من الألومينا أو سن الاثير ثنائي إثيل، الاختلافات في شطف التي ينبغي أن يسيطر عليها لأداء اختبار مراقبة الجودة.

التقنيات الموضحة محدودة أساسا بطبيعة المواد الكيميائية من الرموز التي يمكن الحصول عليها. في المقام الأول، تسمح هذه الأساليب إلا الباحثون عزل وفصل الدهون سلسلة طويلة من جلد الزواحف. استخدام العديد من أنواع الزواحف الإشارات المحمولة جوا و/أو البروتينية كإشارات كيميائية، ووصف أساليب تتنافى مع عزل الرموز المذكورة. سيتم استخراج المذيبات علاوة على ذلك، نونبولار لا مائي العظة من سطوح الزواحف أو مصادر لترسب جديلة (مثلاً، المياه القفص، البراز، الركيزة المائية) في الواقع قد تحتوي على إشارات كيميائية وفيرة. الأساليب المناسبة لالتقاط هذه الأنواع من منبهات متاحة للباحثين (مثلاً، ميكروكستراكشن المرحلة الصلبة [سبمي] للعظة متقلبة وعالية الأداء اللوني السائل [[هبلك]] بالنسبة للرموز المائية)، وعلى الرغم من مثل الأساليب المذكورة أعلاه، هناك منحنى التعلم تقني.

الأهم من ذلك، ينبغي أن يسترشد فائدة الخليط الكيميائي النهائي للباحث الأساليب المستخدمة. على سبيل المثال، إذا كان باحث يريد أن يعرف إذا كان حيوانا المحورية ذكور يمكن أن نميز بين العظة التي تنتجها الذكور مقابل الإناث conspecifics في العينة مستهدفة، يتم استخراج الطريقة الوحيدة المطلوبة^2،3. إذا كان تحديد هوية المركبات ديمبرافيك جنسياً هو الهدف، ومع ذلك، الاستخراج يجب أن تنقيته، لتمكين ثقة أكبر في تعيين هوية لجزيئات معينة أو مجموعات من الجزيئات عن طريق التحليل الكيميائي^{1، 6،،}من⁹¹¹. ومع ذلك، حتى إجراء الفصل اللوني مع مصدر المحتوى دهني، كتلة كبيرة من بدء استخراج مطلوب كي يمكن الحصول على الجماهير الكسر قابلة للقياس؛ وبخلاف ذلك، تجميع عينات يمكن متابعتها لكن ليس الأمثل¹⁴.

التطورات المستقبلية لهذا البروتوكول تشمل تدابير للاستفادة وتكييف الإجراءات المتعلقة بالأنواع أكثر الزواحف. كما يجري تطوير طرق موسع إضافية لاستخراج الدهون الجلد.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تطوير هذه الطرق، لا سيما تسليط الجلد الدهني الاستخراج، حدث خلال الاتفاقات التعاونية (14-7412-1061-كاليفورنيا و 15-7412-1155-كاليفورنيا و 16-7412-1269-CA) بين جامعة ماديسون جيمس (جمو) والحيوانية "وزارة الزراعة الأمريكية" والنباتات دائرة التفتيش الصحي (APHIS). تحملها يعترف بمساهمات الطلاب التالية لتطوير أساليب الجلد يراق: س. باتل (واشنطن وجامعة لي [تقريرنا])، J. زاشرى (تقريرنا)، ر. فلوريس (جمو)، نول ياء (جمو) و S. أشتون (جمو).