ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Reticulum endoplasmic (ER) מכיל את הרמה הגבוהה ביותר של סידן תוך תאי, עם ריכוזים כ -5,000 פי יותר מרמות cytoplasmic. פיקוח הדוק על סידן ER הכרחי לקיפול חלבונים, שינוי וסחר. הפרעות לסידן ER יכולות לגרום להפעלה של תגובת החלבון מקופלת, מנגנון תגובת לחץ ER שלוש שיניים, ותורמות לפתוגנזה במגוון רחב של מחלות. היכולת לעקוב אחר שינויי סידן ER במהלך התפרצות מחלה והתקדמות חשובה בעיקרון, אך מאתגרת בפועל. שיטות זמינות כעת עבור סידן ER הניטור, כגון צבעי ניאון סידן תלוי וחלבונים, סיפקו תובנה דינמיקת סידן ER בתאים, אולם הכלים אלה אינם מתאימים ללימודים בvivo. המעבדה שלנו הוכיחה ששינוי לcarboxy-הסופית של לוציפראז Gaussia מקנה הפרשת הכתב בתגובה לדלדול סידן ER. השיטות לשימוש בלוציפראז מבוסס, חלבון ניטור סידן מופרש ER (SERCaMP) במבחנה וביישומי vivo מתוארות במסמך זה. וידאו זה מדגיש זריקות כבד, מניפולציה תרופתית של GLuc-SERCaMP, איסוף דם ועיבוד, ופרמטרי assay לניטור אורך של סידן ER.

Reticulum endoplasmic (ER) פונקציות רבות יכולות סלולריות כוללים קיפול חלבונים, הפרשת חלבון, שומנים הומאוסטזיס, ואיתות תאית ^1. מרכז לתפקוד נורמלי ER הוא שמירת ריכוזי סידן luminal ב ~ 5000 פעמים אלה שנמצאו בציטופלסמה ^2-4. תהליך עתיר אנרגיה זה מוסדר על ידי ATPase סידן Sarco / reticulum endoplasmic (SERCA), משאבה שזז יוני סידן לחדר המיון. זרימה של סידן מחדר המיון מתווכת בעיקר על ידי ryanodine (RyR) וקולטני אדנוזין אינוזיטול (IP3R). בגלל תהליכי מיון רבים תלויים בסידן, לשבש את החנות יכולה להוביל ללחץ ER ומוות של תאי סופו של דבר.

ER חוסר ויסות הסידן נצפה במחלות כולל קרדיומיופתיה, סוכרת, אלצהיימר, פרקינסון ושל ^5. בשל הפרוגרסיביות של מחלות אלו, זה כבר מאתגר להתוות סיבה והתוצאה מחדשlationship בין פתוגנזה ושינויים בחנות סידן ER. מספר הטכנולוגיות איפשר להתקדמות משמעותית בהבנה של דינמיקת סידן ER, כוללים צבעים ואינדיקטורים מקודדים גנטיים סידן (GECIs) שלנו. צבעים נמוכים זיקת סידן, המגדילים בקרינה כאשר חייב Ca ^{2 +,} ניתן לטעון לתאים לבחון תאי subcellular עם ריכוזים גבוהים של סידן ^6. GECIs, כגון D1ER ותופס לאפשר ניטור של תנודות סידן עם שליטה מדויקת יותר של לוקליזציה subcellular ^7-9. לאחרונה, סוג אחר של GECIs נקראים אינדיקטורים למדידת סידן בפח אברון חלבון (CEPIA) תוארו ^10. גישה שלישית המשלבת גנטיקה וכימיה מולקולה קטנה הוא טעינת צבע הממוקד-אסטראז (TED), אשר מנצל carboxylesterase מקודדים גנטי (ממוקד לחדר המיון) עם צבע סידן מבוסס אסתר ^11.

בעוד המגייסיש גישות ementioned נקודות חוזק וחולשה טבועים, הם יכולים לספק תובנה חשובה דינמיקת סידן ER באמצעות מדידות של הקרינה אקוטיות. הם, לעומת זאת, לא אופטימליים למחקרים ארוכי טווח לעתים קרובות נדרשו לחקור את התקדמות מחלה. במטרה להמציא שיטה לעקוב אחר דינמיקת סידן על פני תקופות זמן ארוכות, זיהינו ופיתחנו שינוי חלבון ליצירת חלבוני סידן מופרש ER ניטור (SERCaMPs) ^12.

SERCaMP עוקף כמה מגבלות הקשורות לשיטות אחרות, על ידי מתן גישה פולשנית לחקור חנות סידן ER שוב ושוב. אנחנו הוכחנו בעבר כי ASARTDL carboxy מסוף פפטיד (אלאנין-סרין-אלאנין-ארגינין-תראונין-אספרטית חומצה-לאוצין) מספיק כדי לקדם את שימור ER; עם זאת, בתנאים שגורמים לירידות בסידן ER, רצף הפפטיד הוא כבר לא מסוגל לשמור על localizatio ERn והחלבון מופרש ^13. בסיס טכנולוגית SERCaMP הוא התוספת של ASARTDL לcarboxy-הסופית של חלבון מופרש (לוציפראז למשל Gaussia, או GLuc) כך שההפרשה מופעלת על ידי דלדול סידן ER, ובכך ליצור כתב חזק של חוסר ויסות הסידן ER ^12. הביטוי של GLuc-SERCaMP באמצעות שיטות מהונדסים מאפשר נוזלים ביולוגיים כוללים תרבית תאים בינוני ופלזמה להיות מנותח לשינויים בפעילות GLuc כאינדיקטור של הומאוסטזיס סידן ER. יש שיטת בקשות למחקר האורך של שינויים הדרגתיים בחנות סידן ER הן במבחנה in vivo. הפרוטוקול הבא נכתב כמתווה כללית לשימוש SERCaMP מבוסס GLuc ללמוד הומאוסטזיס סידן ER, אבל הפרוטוקול יכול לשמש כמדריך לSERCaMPs כתב חלופי.

1. במבחנה Assay: זיהוי שחרור SERCaMP משורת תאי SH-SY5Y יציב

1. טופל SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL צלחת (SERCaMP) בתרבית רקמת צלחות ב150,000 תאים לכל ² סנטימטר של שטח פנים. 96 צלחות גם, למשל, זרע 50,000 תאים לכל היטב (איור 1 א). לגדל תאי SH-SY5Y בDMEM סרום + 1x פניצילין / סטרפטומיצין (הגבוה של גלוקוז, Glutamax, פירובט) + צמיחת שור 10%.
   1. תאי מעבר עד 15 פעמים (איור 1). מספר מעבר גבוה לא נבדק.
   2. חזרו תאים לחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5.5% CO ₂ ו דגירה הלילה.
2. לפני טיפול ניסויי (ים), לאסוף דגימת בסיס לכל אחד גם על ידי העברת 5 μl של supernatant התרבות לאטום מוקף חומת 96 צלחת גם. לפני איסוף, לטפוח בעדינות את הצלחת על כל הצדדים ומערבולת כדי למנוע תופעות שיפוע. חותם את הצלחת האטומה עם דבק שלגיליון אילינג ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הזמן של assay האנזימטית.
   הערה: המופרש GLuc-SERCaMP הוא יציב מאוד במדיום תרבית תאים. אנו דווחו בעבר כ 5-10% מפעילות GLuc אבדו לאחר דגירה 72 שעות ב 37 ° C (מודגרות על תאי SH-SY5Y) ^12.
3. פנק את התאים כרצויים לבחון דלדול סידן ER (למשל סביבתי, תרופתי, מניפולציות גנטיות). יש להימנע מחשיפה ארוכה לסביבת סביבה (מחוץ לחממה מבוקרת) כשינויי pH יהיה במהירות להתרחש בCO ₂ באטמוספרה. להוסיף HEPES עד בינוני התרבות ב 20 מ"מ, כדי לייצב pH ^14, אם מניפולציות ממושכות נדרשות. הימנע מחשיפה לאור בעת שימוש HEPES במדיום תרבות ^15.
   1. בקרה חיובית: פנק את תאים עם 100 ננומטר thapsigargin (TG) או חומצת cyclopiazonic 50 מיקרומטר (רו"ח) במשך 4-6 שעות לניסויים בתאי SH-SY5Y. תגובה מקסימלי בשורות תאים אחרות עשויה לדרוש incubations יותר או concen שונהtrations של תרכובות.
   2. שליטה שלילית: בינוני תרבות אסוף מתאי SH-SY5Y הורים. מניסיוננו, הארה הרקע לassay זה היא פחות מ 0.05% מהפרשה בסיסית מתאי SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP יציבים.
4. לאסוף דגימות חנות 5 μl של תקשורת מותנה בנקודתי הזמן הרצויים, כפי שמתוארים בשלב 1.2.
5. להעריך את הפעילות האנזימטית במדיום כפי שתואר בסעיף 5.
6. בדוק GLuc תאית על ידי immunoblot או assay הארה.
   1. לimmunoblot: תאי lyse במאגר Ripa שונה המכיל 50 מ"מ טריס (pH 7.4), 150 מ"מ NaCl, 0.25% deoxycholate נתרן, 1 mM EDTA, 1% NP40, ומעכבי פרוטאז. נפרד על ג'ל SDS-polyacrylamide והעברה לממברנה 0.20 מיקרומטר PVDF. דגירה הממברנה עם נוגדן GLuc (1: 2,000 דילול) הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לבצע שטיפות דגירה נוגדן וקרום המשניות לפי פרוטוקול מוגדר על ידי משתמש למגיב זיהוי של בחירה.
   2. לassay הארה (איור 2): בצע את השלבים על הקרח הבא:
      1. הסר את כל המדיום מבארות של צלחת תרבית הרקמה ולשטוף עם 200 μl של PBS הקר.
      2. להוסיף 75 μl של חיץ תמוגה המכיל 50 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, 1% NP40 ומעכבי פרוטאז היטב כל אחד.
      3. סובב את הצלחת על שייקר מסלולית (120 סל"ד) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
      4. בעדינות פיפטה lysate למעלה ולמטה באמצעות pipettor רבי ערוצים, הימנעות בועות אוויר. העבר 5 μl של lysate לצלחת אטומה ולהעריך הארה כפי שתואר בסעיף 5.

2. במבחנה Assay: Transfection חולף של תאים הונצחו עם SERCaMP

הערה: יש לנו ציינו כי נהלי transfection חולפים יכולים לגרום ללחץ סלולארי ולהקהות את תגובת GLuc-SERCaMP שלאחר מכן. הגישה הבאה פותחה כדי למזער EFF transfection רישומם בתאי SH-SY5Y. אופטימיזציה של הליך זה (כולל בחירה של מגיב transfection) לשורות תאים חלופיות עשויה להידרש. במידת האפשר, מומלץ שימוש בקווים יציבים תא או שיטות התמרה ויראלית המפורטים בסעיפי 1 ו -3 בהתאמה.

1. תאי SH-SY5Y צלחת בצלחת 100 מ"מ ב 4 x 10 ⁶ תאים. מנה זו תהיה מספיק כדי מחדש זרע כ -300 בארות (96 פורמט צלחת היטב) בעקבות הליך transfection.
2. תאי Transfect עם מגיב Xfect באמצעות 20 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (קידוד GLuc-SERCaMP) ו -6 μl של מגיב Xfect. ה- DNA בקנה מידה ומגיב בהתאם לXfect כלי תרבות גדולים יותר או קטנים יותר.
3. חזור תאי חממה במשך 48 שעות.
4. Trypsinize תאים ולזרוע 96 צלחות גם ב60,000 תאים לכל טוב. בצע את הפעולות הבאות תוארו בסעיף 1.

3. במבחנה Assay: ביטוי בתיווך וקטור ויראלי של GLuc-SERCaMP

1. כייל GLuc-SERCaMP AAV באמצעות פריימרים ובדיקות הבאים: פריימר קדימה, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; פריימר ההפוך, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; בדיקה (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 שכותרת), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'לPCR כמותי.
   1. הכן את עקומת הסטנדרט ידי linearizing פלסמיד המכיל GLuc ומטהר את ה- DNA באמצעות ספין-טור (למשל ניקוי Machery-נגל NucleoSpin ג'ל וPCR). לכמת את ה- DNA על ידי הפרדה על agarose ג'ל לצד סולם המוני. הכן דילולים 1:10 של DNA בין 100 pg / ml 10 / מיליליטר FG בPBS. חשב את / עותקי מיליליטר של פלסמיד דנ"א GLuc בכל אחד מהריכוזים המבוססים על המשקל המולקולרי של פלסמיד.
   2. לדלל את מניות AAV בPBS (הדילול המתאים יהיה תלוי בפרמטרים של הכנה נגיפית ולקבוע באופן אמפירי).
   3. הפעל את תגובת PCR במערכת ה- PCR בזמן אמת באמצעות התנאים הבאים: 95 ° C × 5 דקות, 94 ° C × 20 שניות, ודקות × 1 60 מעלות צלזיוס במשך 41 מחזורים. חישוב עותקים / מ"ל ​​באמצעות העקומה סטנדרטית.
2. lentivirus כייל עם ערכת כייל המהיר p24 Lenti-X. להפשיר aliquots lentiviral על קרח ולדלל את חלבון p24 שליטה במדיום SH-SY5Y.
   1. לדלל את lentivirus כך שהיא תיפול על העקומה סטנדרטית (למשל 1: 20,000 או 1: 100,000). הגורם לדילול הנדרש ישתנה בהתאם לפרמטרים הכנת lentiviral וצריך להיקבע באופן אמפירי. עקוב אחר ההוראות של היצרן עבור כל השלבים הבאים.
3. תאי פלייט 96 צלחות גם. לתאי SH-SY5Y, ניתן בעקבות הליכי ציפוי המפורטים בסעיף 1. לנוירונים בקליפת המוח עיקריים חולדה, צריכים להיות מבודדים תאי זרע ועל צלחות מצופים כראויים שתואר קודם לכן ^16. לשמור נוירונים בקליפת המוח עיקריים עכברוש במדיום Neurobasal בתוספת 1x B27 ו- L-גלוטמין 500 מיקרומטר. לבצע חילופים בינוניים חצי בכל יום אחר.
4. Transduce התאים בנגיף. המטרה של התמרה ויראלית היא להשיג ביטוי ברמה נמוך, כמו בלוציפראז Gaussia מספק אות חזקה.
   1. תאי SH-SY5Y התמרה AAV: transduce למחרת ציפוי. לדלל AAV 6.0 x 10 ⁷ VG / μl במאגר דילול AAV (PBS + 0.5mm MgCl _2). הוסף 5 μl של AAV המדולל (3.0 x 10 ⁸ VG; משרד הפנים בסך של כ -6,000) בכל טוב של 96 צלחת היטב (איור 3 א). להשתמש באקונומיקת 10% כדי להשבית פסולת וקטור נגיפית.
   2. AAV התמרה של תאי עצב בקליפת המוח עיקרי עכברוש: ​​transduce 6-8 ימים לאחר ציפוי. לדלל AAV 4.0 x 10 ⁶ VG / μl במאגר דילול AAV. הוסף 5 μl של AAV המדולל (2.0 x 10 ⁷ VG; משרד הפנים בסך של כ 350) לכל גם96 צלחת היטב (איור 3). משרד הפנים האופטימלי צריכים להיקבע באופן אמפירי לסוגי תאים אחרים. להשתמש באקונומיקת 10% כדי להשבית פסולת וקטור נגיפית.
   3. התמרה lentiviral של תאי SH-SY5Y: transduce למחרת ציפוי. לדלל lentivirus 20 pg / p24 μl (ריכוז נקבע באמצעות ערכת Titering) בתמיסת מלח המאוזן של האנק. להוסיף 5μl של הנגיף המדולל לטוב (של p24 100 עמ ', שווה ערך ל 1,250,000 חלקיקי lentiviral, או ~ 1,250 IFUs) של צלחת גם 96 המכילה 100 נפח μl. בקנה מידה גדול יותר בהתאם לפורמטים. להשתמש באקונומיקת 10% כדי להשבית פסולת ויראלי.
5. לאסוף דגימת טיפול מראש של מדיום ולהתחיל טיפולים ניסיוניים 48 שעות (SH-SY5Y) או 5-7 ימים (נוירונים בקליפת המוח עיקריים עכברוש) לאחר התמרה.

4. בVivo SERCaMP Assay

הערה: לפני ביצוע כל הליכי בעלי חיים כדי להיות בטוחים לקבל את האישור מתאים באמצעות המוסד שלך. כלניתוחי הישרדות הם להיעשות בתנאים סטריליים בהרדמה נאותה. כל ההליכים המתוארים להלן אושרו ועומדים בהנחיות NIH ACUC.

1. מכשירי ניתוח החיטוי לפני תחילת הניתוח (121 מעלות צלזיוס, 30 דקות עיקור, זמן יבש 20 דקות). נקה את כל המכשירים בultrasonicator הבאים מייד את כל הנהלים ולפני מעוקר. לשמור על תנאים סטריליים במהלך ניתוח הישרדות. לניתוחים הדורשים בעלי חיים רבים, לנגב מכשירי ניתוח עם אלכוהול 70%, ultrasonicate וחרוז לעקר בין חולדות. עיין בחומרי רשימת מכשירים דרושים.
2. הכן חולדה לניתוח. כאן אנו משתמשים זכר Sprague-Dawley (180-200 גרם).
   1. להרדים חולדות באמצעות isoflurane גז במשך 3 דקות (4-5% Isoflurane נשאו ב1,000 סמ"ק / דקה) ואחרי זריקות intraperitoneal של xylazine (8 מ"ג / קילוגרם) וקטמין (80 מ"ג / קילוגרם). החל משחת עיניים כדי להגן על קרניות מהתייבשות. Bניתוח egin פעם העכברוש הוא עמוק בהרדמה כפי שהודגם על ידי חוסר רפלקס הנסיגה הבא זנב או קמצוץ רגל.
   2. לגלח את האזור של בטן מעט מתחת לצלעות (אזור בית חזה נמוך) לאזור הבטן באמצע. לשפשף את אזור ניתוח שלוש פעמים, לסירוגין אלכוהול 70% ולשפשף פולידין. מניחים חולדה במצב שכיבה באזור ניתוח סטרילי עם וילונות כירורגי סטרילי.
3. לדלל AAV-GLuc-SERCaMP 7.6 x 10 ⁹ מיליליטר VG / (ריכוז סופי). מערבבים היטב על ידי צינור היפוך.
   הערה: טווח של ריכוז נגיפי יכול להשתנות (איור 4).
   1. Pipet 105 μl של AAV המדולל לתוך צלחת סטרילית. שימוש במחט 30-מד לאסוף את הווירוס לתוך מזרק.
4. לבצע ניתוח כדי לחשוף את הכבד ולהזריק AAV-GLuc-SERCaMP.
   1. לפני ביצוע חתך בבטן, תחול bupivacaine 0.25% לאזור החתך. באמצעות אזמל, לעשות חתך אופקי מתחת לצלעות (AP2-3 סנטימטר בסמיכות). בוטה לנתח להפריד רקמת חיבור מבהיפודרמיס.
   2. חותך שרירים בטן, לחשוף את האונה הימנית של כבד המדיאלי.
      הערה: אונות נוספות ניתן להזריק מבוססות על יישום הסוף.
   3. הנח חיה תחת מיקרוסקופ הניתוחי ולהתאים כדי לקבל אונה המדיאלי תקין של כבד בשדה הראייה. הזרק וירוס לתוך parenchyma של האונה המדיאלי; 3 אתרים נפרדים, כ 33 μl לכל אתר.
      הערה: השאר את מחט ברקמה למשך 5-10 שניות לאחר הזרקה כדי להבטיח אספקה ​​של כל נפח ההזרקה.
   4. לתפור את השרירים ועור בטן בנפרד ולהוסיף כוהל באמצעות מוליך כותנה שקצה. מניחים חולדה בחדר התאוששות עד התודעה הוא חזר ועכברוש הוא מסוגל לשמור על תנוחה זקופה. אל תשאיר חולדה (ים) ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal. הבית לבד עד החתך הגליד ותפרים הוסרו (7-14 ימים).
      הערה: לפי הנחיות לאחר ניתוח NIH, לשמור על שיא כירורגית. תסמן כרטיס כלוב עם הליך, תאריך, מזהה ניסוי, משקל גוף, ויום של ניתוח. כאב / מצוקה, ייצור צואה, פעילות, ומזון וצריכת מים הם להיות במעקב והניתוח נרשם 3 ימים שלאחר. שיכוך כאבים שלאחר ניתוח מסופק על ידי הוספת פרצטמול למי השתייה (450 מ"ג / 100 סמ"ק) למרות שאנחנו לא בדרך כלל לצפות סימנים של כאב או מצוקה לאחר ניתוח.
5. בגין איסוף דם זנב 4-7 ימים לאחר ההזרקה. הכן צינורות איסוף דם על ידי תיוג ומראש משקלות. הוסף 50 הפרין μl (1000 U / ml) על צינור אחד.
6. עכברוש מקום בתא ההרדמה isoflurane 3 דקות (4-5% Isoflurane נשאו ב1,000 סמ"ק / min). הסר עכברוש מהתא והמקום בחרטום (2-3% Isoflurane נמסר על 500 סמ"ק / min). איסוף דם יכול להתחיל ברגע שהחולדה בהרדמה עמוקה כפי שהודגם על ידי חוסר רפלקס הנסיגה הבאה pi הזנבNCH.
   1. בעזרת המספריים סטרילי קצה לחתוך זנב (מ"מ 1-2) ולאסוף דם ירידה מבחינת לתוך צינור הפרין טרום מלא. איסוף דם עד נפח מגיע יותר מ 2: 1 דם ליחס הפרין (> 100 הפרין μl μl דם / 50). יכולים להיות מותאמים כרכי איסוף דם המבוסס על עיצוב ניסיוני. השתמש במוליך כותנה רטוב להחיל אבקת עצירות לזנב כדי לעצור את הדימום.
   2. צינורות דם חנות ב 4 מעלות צלזיוס אם איסוף דגימות שלאחר מכן. נגב מספריים עם כרית אתנול וחרוז לעקר בין אוספים.
   3. לשקול צינורות איסוף ולהתאים עם הפרין להשיג 2: 1 יחס (דם: הפרין). צעד זה לנרמל את הסכום של הפרין בכל דגימה (טבלה 1).
   4. צינורות צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant (פלזמה) לצינור וחנות טרי ב -80 ° C עד הזמן של assay בלוציפראז (סעיף 5).
      הערה: אחסון של דגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד 72 שעות לפני assay האנזימטית יש מ 'השפעת inimal על הארה (איור 5 א). יש עד 3 מחזורים להקפיא להפשיר דגימות פלזמה אין כל השפעה על הארה (איור 5).
7. ממשל thapsigargin (ביקורת חיובית):
   1. הכן thapsigargin על ידי דילול באתנול לריכוז סופי של 2.5 מ"ג / מיליליטר. הזרק thapsigargin ב1 מ"ג / קילוגרם IP לתוך הבטן התחתונה.
      הערה: thapsigargin מגביר קרישת טסיות מושרה תרומבין ¹⁷ והוא יכול לעשות אוסף דם מזנב קשה יותר.
8. assay בלוציפראז Gaussia:
   1. להפשיר דגימות פלזמה על קרח.
      הערה: מחקרים ארוכי טווח, הפשרה ולבצע assay הארה לכל דגימות נקודת הזמן באותו היום (שימוש בתכשיר יחיד של מצע).
   2. העברת 10 μl של פלזמה לצלחת מוקפת חומה אטומה ולמדוד את הפעילות האנזימטית כפי שתואר בסעיף משכפל טכני 5. הפעלה 3-4 של כל דגימת פלזמה.
9. Euthanasi
   הערה: היתרון של טכנולוגית SERCaMP הוא היכולת longitudinally סידן ER הצג. בהתאם לפרמטרים ונקודתי קצה ניתוחים ניסיוניים, בעלי חיים הם להיות מורדמים באמצעים מתאימים לנקודת סיום ניתוח ובהתאם להנחיות ACUC מוסדיות.

5. הארה Assay

1. הכן את פתרונות coelenterazine מניות (CTZ) על ידי דילול המתחם במתנול acidified (30 μl 10 N HCl עד 3 מיליליטר של מתנול) עד ​​20 מ"מ. הכן aliquots ליחד ולאחסן ב -80 ° C.
2. הכן את מצע העבודה ביום של assay.
   1. למבחנים במבחנה, לדלל coelenterazine 8 מיקרומטר ב PBS, למשל להוסיף 10 μl של 20 מ"מ מניית CTZ 25 מיליליטר של PBS (איור 6 א ', ב').
   2. עבור מבחני in vivo, לדלל coelenterazine בPBS 100 מיקרומטר, 500 חומצה אסקורבית מ"מ, 5 מ"מ NaCl.
3. דגירה CTZ מוכן לפחות 30 דק 'בטמפרטורת חדר לפני תחילת assay.
   הערה: שלב זה הוא לעתים קרובות כלול במבחני בלוציפראז Gaussia כמו שיש דיווחים על דעיכת מצע מהירה במהלך 30 דקות הראשונות לאחר ההכנה. אנחנו לא נצפו השפעה זו במערכת שלנו (איור 6 ג); עם זאת, לעתים קרובות אנו כוללים את שלב הדגירה שכן מצאנו שום השפעה שלילית על assay.
4. השתמש בקורא צלחת כי הוא מסוגל פליטת אור ניטור ומצויד בהזרקת מצע. ראש הקווים עם מצע.
   הערה: המצע הראשוני דרך הקווים יכול להיות מועדים לשפלה. כדי להימנע מקריאות נמוכות באופן מלאכותי לדגימות מוקדמות, להזריק 20-30 בארות ריקות (טעינת צלחת ריקה על הקורא) לפני מדידת דגימות ניסוי.
5. הזרק של מצע 100 μl לטוב, לנער מהירות בינונית במשך 5 שניות, ולמדוד פליטת אור. לקורא צלחת Biotek Synergy השני, לשלב פליטת אור על 0.5 שניות (במבחנה דגימות) ו -5 שניות (בvivo דגימות) לצעד הקריאה. לייעל פרמטרים צלחת קורא לביצועי assay אידיאליים.
   הערה: תערוכות לוציפראז Gaussia קינטיקה הבזק עם דעיכת אות מהירה (בהשוואה לזוהר קינטיקה נצפתה עם luciferases אחר). קינטיקה של הבזק GLuc מושפעת בסרום בתרבית תאים בינוני (איור 7 א), המדגישה את החשיבות של שליטה על הרכב בינוני על פני דגימות. בשל הריקבון המהיר של הארה לאחר הוספת מצע (קינטיקה פלאש), את הזמן בין להזריק ולקרוא צעדים חייבים להיות אחיד לכל הדגימות. קורא הצלחת צריך להיות מוגדר להזריק מצע לטוב, לחכות זמן קבוע (לדוגמא, אנו משתמשים בצעד שייק 5 שניות), וקראנו שכן. הוספת מצע לכל צלחת לפני הקריאה מציבה אתגר משמעותי, אלא אם כן מצע ניתן להוסיף לכל הבארות בו זמנית. אם מזרק אינו זמין, ניתן לעקוף הבעיה באופן חלקי על ידי דוגרים הצלחת במשך 10 דקות בין addi המצעtion ומדידה (וכך למנוע את החלק התלול של עקומת הדעיכה) (איור 7).
6. חזור על ההזרקה, לחכות זמן, ולקרוא לכל צעדים גם על הצלחת.

שיטת GLuc-SERCaMP מאפשרת הערכה של הומאוסטזיס סידן ER על ידי דגימת נוזלים תאיים. ניתן לכלול מספר פקדים בעיצוב ניסיוני כדי לשפר את הפרשנות של תוצאות. ראשית, שימוש בכתב constitutively מופרש (למשל GLuc ללא ASARTDL C-המסוף או "GLuc-אין תג") יכול להיות מועסק על מנת להעריך את ההשפעות של טיפולים ניסיוניים על מסלול ההפרשה (הפרשה סלולרית העולמית) וביטוי transgene. לדוגמא, עלייה ברמות תאי של שתי GLuc-SERCaMP וGLuc-אין תג תיחשב תוצאה חד משמעית. לחלופין, עלייה בהפרשת GLuc-SERCaMP עם חוסר מקביל GLuc-אין תגובת תג תומכת אירוע סידן ER תלוי (איור 8). הפרשת GLuc-SERCaMP בתגובה לדלדול סידן ER ניתן להעריך עוד יותר על ידי מדידת GLuc תאית, אם כי זה מוגבל לנקודת זמן אחת כפי שנדרשה תמוגה. Int racellular GLuc-SERCaMP יקטן בתגובה לדלדול סידן ER, כפי שהוא מופרש בהדרגה, ותאי: היחס תאית (מחושב לכל גם בודד) יגדל (איור 2). תאי: היחס תאית הוא שימושי כדי לשלוט על שינויים בביטוי transgene.

מאפננים תרופתיים של חנות סידן ER יכולים להיות מנוצלים כדי לאשר את התרומה של סידן ER לשחרור SERCaMP בפרדיגמות רומן. Dantrolene, אנטגוניסט RyR, ידוע לייצוב סידן ER, שאמורה לצמצם או לעכב את שחרורו של SERCaMP בתגובה לTg (איור 8 ב). מומלץ, במידת האפשר, כדי לבדוק את תרכובות נוספות המשפיעות על שטף סידן ER (למשל Xestospongin C, 4 כלורו-M-cresol) בפרדיגמות ניסוי רומן העסקת SERCaMP. מחקרים אלה הם לעתים קרובות מאתגרים in vivo, אבל עשוי להיות אפשרי במקביל מודלים תרבית רקמה.

ללימודים בvivo באמצעות GLuc-SERCaMP, יש לבחון נתונים באופן עצמאי לכל חיה, עם כל בעלי חיים המשמשים כשליטה שלה "טיפול מראש". זה הכרחי כדי להסביר שונות בtransgene דלivery וביטוי בין בעלי החיים (איור 4 א).

סדר הגודל של תגובות SERCaMP יהיה מושפע ממגוון של גורמים, שרבים מהם קשור לבריאות בסיסית של התאים וניתן לשלוט ישירות על ידי החוקר. להיענות SERCaMP מקסימלי, זה הכרחי כדי לייעל את התנאים שמעדיפים הומאוסטזיס סידן ER בסיסי. זה כולל תאי זריעה בצפיפות אופטימלית ושימוש titers ויראלי נמוך. ייתכן שיש לי תאים מסוגים שונים ורקמות דרישות נוספות, שאמור להיקבע באופן אמפירי.

איור 1:. צפיפות יציבה SH-SY5Y קו תא זריעה ושיקולי מספר מעבר (א) תאי SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP היו זרע בצפיפויות שונות וטופחו במשך 40 שעות. מופרש GLuc-SERCaMP נמדד 4 שעות לאחר טיפול עם 300 ננומטר Tg oשליטה ברכב r (ממוצע ± SD, n = 6). גידול מושרה thapsigargin בהפרשת GLuc-SERCaMP מצויינים עבור כל צפיפות תאים. תאים (ב) SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP במעבר מספר 2 ו -15 נבחנו להפרשה מושרה thapsigargin. תאים שטופלו עם 100 ננומטר Tg לשעה 2 או 4 שעות, ופעילות GLuc המופרשת הייתה מנורמלת לפקדי רכב שטופל (ממוצע ± SD, n = 4, לא הייתה השפעה משמעותית של מעבר-גורם, 2-way ANOVA). קו מקווקו מציין y = 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:. Assay אנזימתי למדידת GLuc-SERCaMP תאית () תאיים ו- (ב) פעילות האנזימטית GLuc תאית הוערך בcor העיקרי העכברושנוירונים tical (transduced עם AAV-GLuc-SERCaMP). שישה ימים לאחר התמרה, תאים שטופלו עם 60 ננומטר thapsigargin במשך 4 שעות. כGLuc-ASARTDL מצטבר במדיום, ירידות מקבילה ברמות תאיות הם נצפו. (ג) יחס של תאית: פעילות GLuc תאית ניתן לחשב עבור כל פרט היטב.

איור 3:. כייל AAV-GLuc-ASARTDL לעומת תגובה מושרה thapsigargin לתאי SH-SY5Y ולהלשין נוירונים בקליפת המוח ראשיים () תאי SH-SY5Y היו זרע ב 96 צלחות גם בשעה 5 x 10 ⁴ תאים לכל היטב ואפשרו לדבוק הלילה. תאים היו transduced בריבוי המצוין של זיהום (משרד הפנים), טופחו במשך 48 שעות ולאחר מכן טופל ב300 ננומטר Tg או רכב. הארה נמדדה בטווח הבינוני לאחר 8 שעות (ממוצע ± SEM, n = 3). * P <0.05, מולמבחני t טייפל (תיקון הולם-Sidak). נוירונים בקליפת המוח עיקריים (B) עכברוש היו transduced על DIV8 עם AAV-GLuc-ASARTDL במשרד הפנים ציינו (מחושב באמצעות 60,000 תאים לכל קירוב טוב בזמן של התמרה). חמישה ימים לאחר התמרה, תאים שטופלו עם 100 ננומטר Tg או שליטה ברכב והארה במדיום נמדדו לאחר 8 שעות (ממוצע ± SEM, n = 6). * P <0.05, t-בדיקות מרובות (תיקון הולם-Sidak).

איור 4:. Thapsigargin-induced שחרור GLuc-SERCaMP לדם הבא זריקות intrahepatic על מגוון של titers ויראלי () ערכי הארה גלם מחולדות (n = 8) intrahepatically הוזרק titers AAV-GLuc-ASARTDL שונה. Thapsigargin (1 מ"ג / קילוגרם) הזרקה (IP) היה מנוהל על יום 12. דם נאסף בנקודות זמן מצוינת ומאוחסן ב -80 & #176; C עד הזמן של assay. (ב) ערכים מנורמלים הארה מפנל, מדגימים תגובה מושרה thapsigargin SERCaMP בחולדות (n = 8) להביע כמויות שונות של AAV-GLuc-ASARTDL.

איור 5:. טיפול ואחסון של דגימות פלזמה GLuc-SERCaMP (in vivo) (א) פלזמה נאספה מחולדות intrahepatically להביע GLuc-SERCaMP (n = 10), aliquoted ומאוחסן ב -80 ° C עד הזמן של מבחני. צינורות הוצאו מ-80 ° C ומאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס במשך פעמים הצביעו לפני מדידת הארה (ממוצע ± סטיית תקן). (ב) השפעה של הקפאה / מפשיר מרובה של דגימות פלזמה על פעילות האנזימטית GLuc. דגימות שנאספו מפלזמת חולדות intrahepatically להביע AAV-GLuc-SERCaMP (n = 10) היו נתונים למספר מצוייניםמחזורים להקפיא להפשיר וassayed להארה (ממוצע ± SD).

איור 6:. הכנת מצע coelenterazine למבחני GLuc-SERCaMP בינוני תרבות () נאסף מתאי קווי SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP טופלו עם 300 ננומטר Tg (או שליטה ברכב) במשך 5 שעות. פעילות GLuc במדיום הוערכה על ידי הזרקת ריכוזים שונים PBS + של coelenterazine (ממוצע ± SD, n = 6). (ב) ערכי הארה מפנל היו מנורמלים לרכב שטופל שליטה בכל ריכוז מצע להעריך את ההשפעה מושרה thapsigargin. (ג) מצע ריקבון על פני כמה שעות. הארה מכמות ידועה של GLuc רקומביננטי (0.1 ng או 0.02 ng) נמדדה על פני כמה שעות לאחר הכנת מצע (הממוצע ± SD, n = 4). (ד) בזמן הארה הגלם לרקומביננטיGLuc ירידה לאורך זמן בשל למצע ריקבון, ההבדל של פי הדגימות (כפי שנקבע על ידי הארה) נשמר.

איור 7:. שיקולים למבחני GLuc-SERCaMP הקשורים לקינטיקה של תגובת GLuc / CTZ () בינוני תרבות משנה את הדעיכה של אות GLuc / CTZ. 5 μl של supernatant המכיל GLuc-SERCaMP היה מעורב ביחסים שונים של PBS ובינוני תרבות. של מצע 100 μl (15 מיקרומטר CTZ בPBS + 500 חומצה אסקורבית מ"מ) נוספה 50 μl של מדגם שהיה מדולל כפי שמתוארים בטבלה. פליטת אור הייתה פיקוח על 15 דקות. (ב) 5 μl של מדיום נאסף מתאי SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL ומצע μl 100 (8 מיקרומטר CTZ בPBS 5 מ"מ NaCl +) נוספה. הארה נמדדה מייד לאחר הוספת מצע (ט = 0) וכל 30 שניות על פני במהלך 15 דקות (± סטיית תקן, n = 12). הנתונים הוא להתוות כאות אחוזים ביחס למרווח של 30 שניות הקודם כדי להעריך את קצב הדעיכה. הבלעה מציגה את נתוני הארה הגלם.

איור 8:. תימוכין תרופתיים של דלדול סידן ER () השפעה של 100 ננומטר thapsigargin על הפרשת GLuc נבדקה לGLuc-ASARTDL וGLuc-אין שליטת תג (ממוצע ± SD, n = 6). (ב) ייצוב סידן ER עם dantrolene (אנטגוניסט RyR) מעכב שחרור SERCaMP מושרה Tg. היו מראש שטופלו בתאים עם הריכוזים מצויינים של dantrolene למשך 30 דקות או 16 שעות לפני תוספת של 100 ננומטר thapsigargin. פעילות GLuc במדיום נמדדה לאחר 4 שעות (הממוצע ± SD, n = 6).

99fig9.jpg "/>
איור 9:. תוצאות נציג מוק עבור assay GLuc-SERCaMP הערה הרכב ערכים טופלו עלולים להפחית בין צלחות, בשל התמוטטות למצע (תלוי במרווח זמן בין קריאת צלחות בודדות). כדי להסביר את האפקט הזה, אפקט הטיפול ספציפי מחושב באופן עצמאי לכל צלחת ויחס זה הוא בהשוואה על פני צלחות.

טבלת 1:. דם אוסף שולחן דוגמא של יומן איסוף דם ללימודי SERCaMP.

פרוטוקול זה מדגיש במבחנה ובשירות vivo של GLuc-SERCaMP לפקח דלדול סידן ER. למרות שינוי החלבון כדי ליצור SERCaMP מופיע להכליל לחלבוני כתב אחרים ^12, בחרנו בלוציפראז Gaussia לפליטת האור שלו חזק (200-1,000 הגדול יותר פי) בהשוואה לluciferases האחר ^18. אנו מדגימים שחרור GLuc-SERCaMP זיהוי מושרה thapsigargin על פני מגוון מינון של פי 100 של וירוס GLuc-SERCaMP נמסר לנוירונים עכברוש עיקרי בקליפת המוח, תאי SH-SY5Y, וכבד חולדה (איורים 3 ו -4). אנחנו שתוארו קודם לכן הדור של שורת תאי transfected ביציבות להביע GLuc-ASARTDL והוכיחו כי כמה כמו 20 תאים באוכלוסייה של 5 x 10 ⁴ תאים ללא תווית יכולים לדווח thapsigargin מושרה תגובה ^12. כאן אנו מראים כי שורת התאים היציבה באופן עקבי יכולה לדווח תגובה מושרה Tg מתוך 15 קטעים, רוב analyzאד, מצביע על כך שביטוי מתמשך של הכתב לאורך הזמן אינו משפיע על יכולתה להשתחרר בתגובה לדלדול סידן ER (איור 1). הנתונים שלנו מצביעים על כך שGLuc-SERCaMP מתקיים בעיקר בתוך חדר המיון של תא עד זמן של דלדול סידן ER כאשר הוא מופרש. בתנאים "נורמלים", יש הפרשה בסיסית נמוכה המאפשרת את הקמתה של הומאוסטזיס סידן ER בסיס ^12. בעקבות דלדול ER סידן על ידי thapsigargin, רמות של שינוי הארה תאית ותאי בכיוונים מנוגדים. זה יכול לבוא לידי ביטוי כיחס למצביע על שינוי בחלוקת מצב יציבה של החיישן (איור 2). חשוב לציין, כשחרור SERCaMP הוא מווסת על ידי ביטוי קולט KDEL ^12, הגודל של שחרור עשוי להשתנות בהתאם לסוג תא. אנחנו מדמיינים שהחלפה "ASARTDL 'עם רצפי carboxy המסוף כמו KDEL-חלופיים עשויה להידרש כדי להשיג maxiתגובת mal SERCaMP בסוג תא או רקמה ספציפית.

למבחנים במבחנה, רמות GLuc-SERCaMP תאי תצטבר לאורך זמן בשל יציבותו של הכתב מופרש; דיווחנו ירידת 5-10% בקירוב בפעילות לאחר 72 שעות ^12. ככזה, החלפה בינונית לפני הייזום תרופתי או אתגר גנטי להומאוסטזיס סידן ER ייתכן שתהיה צורך להפחית את אות רקע עקב הצטברות חיישן. בניגוד לכך, זמן מחצית החיים של GLuc-SERCAMP in vivo הוא 3.5-4.7 דקות ¹² המציין אות בפלזמה מייצגים מהדורה האחרונה של הכתב למחזור דם. ברגע שהדם הוא vivo לשעבר ומעובד לפלזמה, לעומת זאת, GLuc-SERCaMP הוא יציב מאוד (איור 5).

למתודולוגיות המתוארות, בינוני או פלזמה מועברת ל96-גם צלחות אטומות לפני מבחני האנזימטית. שני גורמים חשובים לשקול בעת שימוש בכתב המבוסס על GLucים הוא קינטיקה הבזק של האנזים והתמוטטות של מצע coelenterazine. קוראי צלחת מצוידים במרססים מתאימים ביותר להפעלת GLuc מבחני האנזימטית לנרמל את הזמן בין בנוסף מצע ומדידות הארה. התכונות הכימיות של coelenterazine לעשות את זה נוטה ריקבון, המונע השוואת ערכי הארה גלם נמדדים בזמנים שונים לאחר הכנת מצע. מקפלים הבדלים בין דגימות, עם זאת, נשמרים (איור 6), המאפשר את ההבדל היחסי בין שליטה ודגימות ניסוי כדי להיות במעקב על משך הניסויים (איור 9).

היכולת לעקוב אחר תנודות סידן ER in vivo היא יתרון כאשר חוקרים מחלות מתקדמות. בעוד שיטות אחרות, כגון צבעי ניאון cytoplasmic, מתאימות לאקוטי בניסויים במבחנה, כתב SERCaMP הוא ראשון שמאפשר ניטור סידן ER האורך. Ouפרוטוקול R מתאר זריקות כבדי ישירות של AAV-GLuc-SERCaMP. יש לנו זוהו רמות קבועות של GLuc-SERCaMP במחזור של בעלי חיים ללא עוררין במשך 56 ימים לאחר הזרקה (נקודת הזמן האחרונה שנבדקה עד כה) ולחזות ניסויים כבר אפשריים ^12. וקטורי AAV קטנים בגודל, מדידה כ 20 ננומטר בקוטר, ומהווים דרישות בטיחות ביולוגית מינימליות ^19. כדי לעקוף את ההמרה של הגנום חד-גדילי AAV לגדילי דנ"א כפול, AAV-SERCaMP היה ארוז כמו סרוטיפ-1 וקטור פעמיים תקועים AAV ^20. AAV סרוטיפ-1 הוכח ביעילות transduce כבדי עכברוש ^19,21; עם זאת, האזהרה של טכניקת ההזרקה שלנו הוא הפוטנציאל לוירוס לנסוע לרקמות אחרות בגוף. על אף שהשיטה היה מוזרק ישירות לתוך הכבד, המתודולוגיה שלנו כפי שהוצג לא יכולה להבחין במקור של שחרור SERCaMP, ולכן ייתכן שרקמות אחרות מאשר הכבד עשויות לתרום לGLuc-SERCאות מגבר. מניפולציות גנטיות בעתיד יגבילו ביטוי למקד סוגי רקמות. לדוגמא, קווי נהג רקמות ספציפיות Cre חצו עם GLuc-SERCaMP Cre תלוי יאפשר לניטור רקמות הספציפיות של סידן ER באמצעות דגימת פלזמה.

הטכניקה המתוארת בvivo משתמשת titers ויראלי הנמוך בשל האופי חזק של הכתב. שחרור GLuc-SERCaMP ניתן לאתר ממגוון נגיפי של 7.6 x 10 ⁷ VG 7.6 x 10 ⁹ VG (איור 4). מגוון זה הוא 4-400 פעמים נמוכה יותר מאשר דווח בעבודה קודמת ניצול זריקות נגיפיות גחלילית מבוססת לוציפראז של הכבד ^19. בריכוזים גבוהים יותר, שצפינו הפסד של ביטוי לזיהוי לאורך זמן, שהוא ככל הנראה בשל תגובה חיסונית של בעלי החיים לtransgene ^22. יש להימנע titers גבוה יותר של וירוס במידת האפשר בשל סבירות מוגברת של אובדן אות. titers נמוך מאלו שהוצגו לא להיותen נבדק. פרוטוקול זה מתאר זריקות של AAV-GLuc-SERCaMP לכבד; גישות דומות נמצאות בתאוריה אפשרית עבור סוגים אחרים של רקמות. פרמטרים כגון ריכוז וסרוטיפ נגיפיים חייבים להיות מותאמים לביטוי מספיק ברקמות אחרות.

בשל האופי חזק של הכתב, בנפחים קטנים של דם (100-150 μl) ניתן לאסוף מקטעי זנב, המאפשרים לאוספים חוזרים לאורך ניסויים. זה היה שימושי לאפיון אורך של שחרור GLuc-SERCaMP בתגובה לthapsigargin, שבו אנו נצפו רמות גבוהות לאחר מתן thapsigargin אחרי חזרה לרמות בסיס (איור 4). טיפול נכון של דגימות הפלזמה הבאות איסוף דם הוא גם חשוב. ככזה, יש לנו הפגנו שSERCaMP הוא יציב בפלזמה מאוחסנת על 4 מעלות צלזיוס עד 72 שעות לפני assay האנזימטית (איור 5). יתר על כן, דגימות פלזמה יכולות לעבור לפחות שלוש הקפאה / לאמחזורי האו עם השפעה מינימאלית על הארה (איור 5). בפועל, אנו מאחסנים את כל הדגימות ב -80 ° C, להימנע להקפיא להפשיר מחזורים מיותרים לפני הערכת assay האנזימטית, ולנתח את כל הדגימות לניסוי באותו הזמן.

ER דלדול סידן הוא מעורב בפתוגנזה של מגוון רחב של מחלות. הוא לעתים קרובות חשב להיות אירוע במעלה הזרם שמעכב תפקודים תאיים ומוביל להפעלה של תגובת פרש החלבון (UPR). UPR הוא תגובה אדפטיבית המועסקת על ידי ER להקים מחדש תנאי homeostatic ^5. מדינות כרוניות של לחץ ER מעבר לקיבולת של UPR לשחזר הומאוסטזיס, סופו של דבר מוביל למוות של תאים. לחץ ER וחוסר ויסות הסידן ER הם נצפו במחלות כמו סוכרת מסוג 1, נפרופתיה סוכרתית, מחלות ניווניות וdieases לב וכלי דם ^5. מערכת היחסים בין חוסר ויסות הסידן והיווצרות מחלה, לעומת זאת, היא difficult להתוות. יש טכנולוגית SERCaMP הפוטנציאלית כדי לעקוב אחר תהליך זה על תוחלת החיים של בעל חיים, ובכך לספק תובנה התפתחות מחלה והתקדמות. יתר על כן, ההערכה של תרופות פוטנציאליות שנועדו למנוע או חוסר ויסות הסידן ER נכון ניתן להעריך באמצעות SERCaMP. לבסוף, זיהוי מחלות שבי שחרור GLuc-SERCaMP מתרחש מציע הזדמנות למהנדס ולהעסיק חלבונים מופרשים טיפוליים או פפטידים כSERCaMPs כאמצעי לריפוי גנטי מחלה מוסדרת.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.