שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide

אנו מתארים שיטה לגרימת דלקת ריאות neutrophilic על ידי אתגר לlipopolysaccharide תרסיס על ידי עִרפּוּל, מודל פציעת ריאות חריפה. בנוסף, טכניקות ניתוחיות בסיסיות לבידוד ריאה, אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית הם גם תיארו.

פציעת ריאות חריפה (ALI) היא מחלה קשה המתאפיינת בneutrophilia alveolar, עם אפשרויות טיפול מוגבלות ותמותה גבוהה. מודלים ניסיוניים של ALI הם מפתח לשיפור ההבנה של היווצרות מחלה שלנו. Lipopolysaccharide (LPS) נגזר מחיידקים חיוביים גרם גורם לדלקת בדרכי נשימת neutrophilic וparenchyma ריאות של עכברים. משלוח ריאות יעיל של תרכובות כגון LPS הוא, עם זאת, קשה להשגה. בגישה שתוארה כאן, משלוח ריאות בעכברים מושגת על ידי אתגר לPseudomonas aeruginosa תרסיס LPS. LPS המומס היה תרסיס על ידי nebulizer מחובר לאוויר דחוס. עכברים נחשפו לזרימה רציפה של תרסיס LPS בקופסא פלסטיק במשך 10 דקות, ואחרי 2 דקות אוויר לאחר התרסיס הופסק. אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית שלאחר מכן, ואחריו זלוף פורמלין בוצעו הבאה, המאפשר לאפיון של p סטרילידלקת ulmonary. LPS תרסיס יוצר דלקת ריאות מתאפיינת בneutrophilia alveolar, זוהתה בשטיפה ברונכואלוואולרית ועל ידי הערכה היסטולוגית. טכניקה זו ניתן להגדיר במחיר קטן עם כמה מכשירים, ודורשת הכשרה ומומחיות מינימליות. מערכת החשיפה ובכך ניתן לבצע באופן שיגרתי בכל מעבדה, עם הפוטנציאל לשפר את ההבנה של פתולוגיה ריאות שלנו.

Lipopolysaccharide (LPS) הוא קיר תא מרכיב של חיידקים שליליים ¹ גרם. אתגר לLPS הוא מודל מתועד היטב של פציעת ריאות חריפה, תסמונת המתאפיינת בדלקת חריפה neutrophilic ובצקת ^2. בנוסף, neutrophilia ריאתי הוא גם סימן היכר של מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) ^3, ואתגר LPS בבני אדם כבר בשימוש לדגמן החמרות COPD ^4. לפיכך, מודלים ניסויים של חשיפת LPS קליניים כלים רלוונטיים ובעל ערך להבנת הפתולוגיה אנושית.

המטרה של מסירת הריאות של LPS התרסיס שתואר כאן היא ליצור תגובה דלקתית neutrophilic בניצוח ודרכי הנשימה, ללא מעורבות מערכתית. כמה טכניקות של אתגר LPS תוארו בעבר. הזרקה תוך-ורידית של LPS היא הדרך הנפוצה ביותר של ממשל. למרות שטכניקה זו היא נגישה בקלות, tנזק עיקרי הוא לאנדותל, עם הרס המשני של האפיתל הריאה הבא הגירת נויטרופילים לריאות. ממשל Intra-ורידים גם גורם לדלקת מערכתית ^2, שעלולה לסבך את התמונה הקלינית במודלים של בעלי חיים. דלקת מערכתית בניגוד לא נצפה עם ממשל תוך קנה הנשימה. טכניקה זו, עם זאת, היא עבודה אינטנסיבית ודורשת הרדמה כמו גם הכשרה ^{5 ניכרת, 6.} יתר על כן, בתצהיר ריאתי במסלול הזה של ממשל תלוי בנשימה ^7. כך, בתצהיר ריאות מושפע מעומק ההרדמה הנחוצה לממשל תוך קנה הנשימה והתצהיר משתנה בדרכי הנשימה יכולים להיות שנצפו. בניגוד לכך, מסירת ריאה עם LPS התרסיס דורשת הכשרה מינימאלית, ובקלות יכולה להיות מושלמת במספר גדול של בעלי חיים עם מעט או ללא וריאציה בין יחידים ^{5, 8.}מחקר שנערך לאחרונה מאשר כי משלוח התרסיס עדיף על המסלול תוך-קנה הנשימה ביחס לתצהיר, וכי מינונים רלוונטיים יותר של LPS לגרום דלקת neutrophilic עם מודל זה ^8.

מחקרים קודמים הראו כי אתגר לPsuedomonas aeruginosa LPS תרסיס יוצר תגובה דלקתית משמעותית בלומן בדרכי הנשימה והריאות parenchyma, כוללים הרווחים מכתשי ^{9, 10.} הדלקת מאופיינת בדומיננטיות של נויטרופילים ונוכחות של בצקת ריאות, ולכן יכולה לשמש כדי לטפל בפתוגנזה של פציעת ריאות חריפה ולצבור ידע נוסף של המנגנונים תורמים לפתולוגיה מחלה.

המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת אתיקה לרווחת בעלי החיים בצפון שטוקהולם. הפרוצדורות בוצעו בציות לחוק שוודי.

1. יצירת תרסיס LPS

1. לפזר 0.5 גרם מטוהר P. aeruginosa LPS בתמיסת מלח סטרילית 50 מיליליטר עם תסיסה עדינה ולאמת פירוק. לדלל 1 מיליליטר מומס LPS ב9 מיליליטר תמיסת מלח סטרילית, לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר. להגן מפני אור עם רדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C.
2. להפשיר LPS solubilized בחושך בטמפרטורת חדר ומערבבים היטב מייד לפני השימוש.
3. במנדף הביולוגי מסוכן ברמה השנייה מאוורר, הכנס כניסה אדומה לnebulizer, ולחבר את nebulizer לאוויר חדר דחוס באמצעות צינורות הניתנים על ידי (ערכת סקירה המציגה את המכשירים הניסיוניים באיור 1) יצרן.
   זהירות: ציוד מגן אישי מתאים, ובכלל זה שימוש חוזר respirat מחצית חתיכת פניםאו עם מסנני חלקיקים, משקפי מגן, כפפות ובגדי מגן יש להשתמש במהלך החשיפה.

איור 1:. מצגת סכמטי של המכשירים הניסיוניים המשמשים לייצור תרסיסי הכניסה של nebulizer מחוברת לאספקת אוויר. היציאה של nebulizer מחוברת ראשון מד זרימה דרך צינור 15.9 מ"מ ומסנן אוויר, ואספקת אוויר מותאם ל5.0 L / מ 'בלחץ kbar 2. השקע הוא הבא מחובר למצוידת עם מכסים נשלפים ו -5 חורים מ"מ כדי למנוע הצטברות לחץ תיבת פרספקס.

4. חבר את היציאה של nebulizer לflowmeter המוני באמצעות מסנן אוויר. חבר את מד הזרימה ההמונית לאספקת חשמל.
5. התאם את אספקת האוויר ל5 L / min, עם לחץ שנותר ב1.0-2.0 בר.
6. הסר את מד הזרימה ההמונית ונתק את אספקת האוויר.
7. חבר את היציאה של nebulizer לצינור 15.9 מ"מ, שמתפצל ומתחבר לשתי תיבות פרספקס עם הממדים: 150 x 163 x 205 מ"מ, מצוידים עם מכסים נשלפים. כל תיבה צריכה להיות חור 5 מ"מ בצד מנוגדים הכניסה, כדי למנוע הצטברות לחץ.
8. הנח עד 5 עכברים בכל תיבת פרספקס ולסגור את העפעפיים.
9. פתח את nebulizer ולמלא את הכנס עם לפחות 4 LPS מיליליטר מומס בתמיסת מלח או רכב סטרילי לבד (תמיסת מלח סטרילית; הנפח לא יעלה על 8 מיליליטר). Re-לחבר את הכניסה לאספקת האוויר.
10. לאפשר התרסיס לזרום לתוך תיבות פרספקס הסגור במשך 10 דקות. לפקח על בעלי החיים ברציפות. ודא שאספקת האוויר נשארה בחוזקה מאובטחת לכניסה של nebulizer.
11. נתק את אספקת האוויר. עם המכסים סגורים, תן לחיות להישאר בתיבות פרספקס 2 דקות.
12. פתח את המכסים ולאפשר לתרסיס לפיזור, ולהחזיר את בעלי החיים לtהוא כלובים. אם בעלי החיים מופיעים רטובים, למקם את הכלובים על כרית חימום מוגדרת חום נמוך, כדי למנוע היפותרמיה.
13. לפקח על בעלי החיים ברציפות במשך 30 דקות הראשונות, ולאחר מכן כל שעה 2 ל6 שעות הראשונות. בעלי החיים צריכים להפגין דפוס נשימה נורמלי ופעילות במהלך ואחרי הליך עִרפּוּל.

2. שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL)

1. בנקודת סיום הניסוי, עמוק להרדים את החיות עם isoflurane להשפעה כפי שהומלץ על ידי צוות הוטרינרים של המוסד שלך. לצבוט את כף הרגל האחורית כדי לבדוק רפלקס נסיגה כדי להבטיח עומק מספק של הרדמה לנהל ניתוח גדול. תרסיס למטה הפרווה של בעלי החיים עם אתנול 70%.
2. פתח את הבטן באמצעות מספריים, ולנתק את אב העורקים לexsanguinate בעלי החיים. מניחים פיסת הרקמה על הבטן כדי לספוג את הדם.
3. Follwing המתת חסד, להשתמש לחתוך קדמי, אחורי יחיד של המספריים ללחשוף את החזה. להרים את כלוב צלעות על ידי הקצה הקדמי של עצם החזה ולהשתמש במספריים לנקב את הסרעפת בנקודת הגחון ביותר, בלי לחתוך את כל אונת ריאה. לפתוח את בית החזה על ידי ביצוע שני חתכים בכיוון הקדמי, אחורי (מפגש מתחת ללסת).
4. משוך בעדינות לגזרים את כלוב הצלעות באמצעות מלקחיים, וחתך את קנה הנשימה מתחת לגרון.
5. הרם את קנה הנשימה עם המלקחיים ולהסיר את הריאות על ידי חיתוך הרצועות המחברות את האונות לחלל בית החזה, ומשייכתו בעדינות על ידי השומן ורקמת לב.
6. הכנס צינור פוליאתילן (קוטר פנימי: 0.58 מ"מ; קוטר חיצוני: .965 מ"מ) לתוך קנה הנשימה ולאבטח את הצינור עם מחרוזת של חוט משי.
7. לקשור את multilobe (ארבע אונות של הריאה ימין) עם חוט משי.
8. הכנס מחט 23 מד לתוך צינור פוליאתילן ולהזריק לאט 250 μl של PBS סטרילי קר כקרח לאונה אחת עם מזרק 1 מיליליטר.
9. ברז בזהירות את הריאות30 פעמים ולאסוף את הנוזל באמצעות המזרק. חזור על התהליך עם 200 μl PBS (כ -300 μl PBS צריך להיות התאושש מהאונה אחת מהנפח הכולל של 450 הזריק μl).
10. שמור את נוזל שטיפת רונכואלוואולרית (בלף) על קרח, או למנות את תאי BAL באופן מיידי. ספירת התאים עם heamocytometer, באמצעות פתרון טורק להכתים את התאים ^11. חישוב המספר הכולל של התאים על ידי הכפלת מספר התאים עם הגורם לדילול של הפתרון מכתים והנפח בתחום נספר של heamocytometer.
11. הכן ספירת תאי ההפרש מתאי cytocentrifuged כפי שתואר במקום אחר ^11.

3. פורמלין קיבוע של רקמת ריאות להערכה היסטולוגית

1. הסר את multilobe וsnap-הקפאת קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
2. הר מזרק 60 מיליליטר עם הבוכנה הוסרה על דוכן תמיכת מתכת. מלא את המזרק עם פורמלין 10% להגובה של 20 סנטימטרים מעל ספסל המעבדה, המייצגים את 20 סנטימטרים של לחץ מתמיד.
3. חבר את מחט 23 מד מאובטח לקנה הנשימה למזרק 60 מיליליטר באמצעות צינור פלסטיק עם שסתום כדי לשלוט בזרימה של פורמלין.
4. Insufflate אונת הריאה עם פורמלין למשך 5 דקות. נתק את המחט ולהסיר אותו יחד עם צינור פוליאתילן מקנה הנשימה תוך משיכת חוט המשי כדי לסגור את קנה הנשימה ולשמר את הלחץ בריאות.
5. להטביע את אונת הריאה בפורמלין ולתקן למשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
6. שטוף את הרקמה קבועה שלוש פעמים לפחות 20 דקות עם 70% אתנול, ומייבש לקסילן באמצעות המשטר הבא (1 שעה כל אחד):
   • 3x אתנול 70%
   • 3x אתנול 95%
   • 3x אתנול 100%
   • קסילן 3x
   • 1x פרפין (נוזל)
7. רקמה להטביע מיובשת בפרפין, לחתוך ב4-5 מיקרומטר סעיפים, ואת כתם עם hematoxylin ו eosin, כדי לאפשר הערכה היסטולוגית.

אתגר לפ תרסיס aeruginosa LPS בדרך כלל מניב תגובה דלקתית מסומנת בלומן בדרכי הנשימה ומרחב alveolar, מתאפיין בדומיננטיות של נויטרופילים בשתי נקודות מוקדמות ומאוחרות זמן.

התרסיס LPS גורם neutrophilia ריאתי

עכברי C57BL / 6by וBALB / ג נחשפו לפ תרסיס aeruginosa LPS או רכב לבד ונויטרופילים נפקדו בבלף. מספר התאים הכולל בבלף של C57BL / עכברי 6by נחשפו לתרסיס שנוצר עם רכב הוא רק בדרך כלל סביב או מתחת 200,000 תאים והתאים מורכבים של תאי mononuclear 95-100%, עם רק מעט לימפוציטים (.5-5%), ו אין נויטרופילים בבלף (איור 2 א-ג). עכברי תיגר עם תערוכת LPS תרסיס מספר תא כולל גדל בבלף, בדרך כלל> 500,000 תאים לאחר 6 שעות. מחלחל התא נותר גבוה לאחר 24 שעות. הפרופיל הסלולרי בבלף מוסט לכיוון apredominance של נויטרופילים (80-95%) בעקבות חשיפת LPS (איור 2 ו- C).

איור 2:. Neutrophilia ריאתי בC57BL / עכברי 6by תיגר עם 1 מ"ג / מיליליטר LPS תרסיס C57BL / עכברי 6by נחשף ל1 מ"ג / מיליליטר תרסיס P. aeruginosa LPS או רכב (מי מלח, בר לבן) לבד במשך 10 דקות. ברונכואלוואולרית שטיפה (BAL) בוצעה לאחר 6 שעות או 24 שעות ולויקוציטים נפקד בנוזל BAL (בלף). סה"כ תא (TCN), (ב) נויטרופילים, ותאים (C) mononuclear (MNC) (א) ב בלף. הבדלים משמעותיים נותחו באמצעות מבחני t-לזווג un. n = 3-4, * מציין p <0.05, ** מציין p <0.01.

עלייה דומה בתאים דלקתיים בבלף הוא ציינה בעכברי BALB / ג תיגר-LPS (איור 3 א ). בנוסף, אחוז של נויטרופילים ותאי mononuclear בבלף אחרי אתגר LPS דומה בC57BL / 6 ועכברים BALB / ג (איור 3 ו- C).

איור 3:. Neutrophilia ריאות בעכברים / ג BALB תיגר עם 1 מ"ג / מיליליטר LPS תרסיס עכברים / ג BALB נחשפו ל1 מ"ג / מיליליטר תרסיס P. aeruginosa LPS או רכב (מי מלח, בר לבן) לבד במשך 10 דקות. ברונכואלוואולרית שטיפה (BAL) בוצעה לאחר 6 שעות או 24 שעות ולויקוציטים נפקד בנוזל BAL (בלף). סה"כ תא (TCN), (ב) נויטרופילים, ותאים (C) mononuclear (MNC) (א) ב בלף. הבדלים משמעותיים נותחו באמצעות מבחני t-לזווג un. n = 3, ** מציין p <0.01, *** מציין p <0.001.

פרופיל תא דלקתי דומה neutrophilia הריאה ד הוא ציין עם עִרפּוּל של 5 מ"ג / מיליליטר LPS (4A-C איור) ועל ידי משלוח intranasal של LPS, כפי שדווח בעבר ^12,13.

איור 4:. Neutrophilia ריאות בעכברים / ג BALB תיגר עם 5 מ"ג / מיליליטר LPS תרסיס עכברים / ג BALB נחשפו עד 5 מ"ג / מיליליטר תרסיס P. aeruginosa LPS או רכב (מי מלח, בר לבן) לבד במשך 10 דקות. ברונכואלוואולרית שטיפה (BAL) בוצעה לאחר 24 שעות ולויקוציטים נפקד בנוזל BAL (בלף). (א) בתאי mononuclear מספר תא סה"כ (TCN), נויטרופילים (B), ו- (ג) (MNC) בבלף. הבדלים משמעותיים נותחו באמצעות מבחני t-לזווג un. n = 3, *** מציין p <0.001.

לוקליזציה ריאות של נויטרופילים באתגר-LPS

איור 5:. לוקליזציה ריאות של נויטרופילים בעכברי תיגר-LPS צביעת Hematoxylin ו eosin של רקמת הריאה פורמלין-קבוע מ() C57BL / עכברי 6by החשופים לרכב לבד או 1 מ"ג (B) / LPS תרסיס מיליליטר הקריב לאחר 6 שעות או hr 24 (ג). החץ מצביע על נויטרופילים. בר מציין 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Concentr ation של chemoattractants נויטרופילים בבלף

תכולת החלבון הכוללת בבלף של עכברי תיגר-LPS היא גדלה בהשוואה לעכברים שנחשפו למלוח (איור 6). כמו כן, הביטוי של chemokine chemoattractants נויטרופילים ligands (CXC מוטיב) (CXCL) 1 וCXCL2 גדל באתגר-LPS עכברי ¹⁰ (איור 7 א 'וב').

איור 6:. הגברת ריכוז מוחלט חלבון בנוזל שטיפת רונכואלוואולרית (בלף) של / עכברי 6by C57BL תיגר-LPS תכולת חלבון סה"כ בבלף של עכברי אתגר 1 מ"ג / מיליליטר LPS תרסיס או חשופים לרכב (מי מלח, בר לבן) לבדו הייתה שנמדד על ידי ניתוח spectrophotometric. הבדלים משמעותיים נותחו באמצעות מבחני t-לזווג un. n = 3-4, ** מציין p <0.01.

s = "jove_content" fo: לשמור-together.within-page = "תמיד">
איור 7: אני ncreased ביטוי של CXCL1 וCXCL2 בנוזל שטיפת רונכואלוואולרית (בלף) של עכברי תיגר-LPS ביטוי של CXCL1 () וCXCL2 (B) בבלף של עכברי אתגר 1 מ"ג / מיליליטר LPS תרסיס או חשוף לרכב. (מלוח, בר לבן) לכמת לבד על ידי ELISA. הבדלים משמעותיים נותחו באמצעות מבחני t-לזווג un. n = 3.

LPS תרסיס יוצר תגובה דלקתית בדרכי הנשימה, המתאפיינת בנויטרופילים בsubmucosa אפיתל, חללים המקיפים את דרכי הנשימה ניהול, כמו גם רווחים מכתשי. זה, יחד עם התוכן המוגבר כולל החלבון בבלף, מעיד על דליפת פלזמה, נציג של הפתולוגיה של פגיעת ריאות חריפה. כLPS גורם דלקת סטרילית, התגובה היא עצמאית של התגובה החיסונית אדפטיבית, ויש מגבלות לרלוונטיות לזיהומים חיידקיים. הטכניקה עשויה, עם זאת, ניתן להשתמש כדי לנתח מנגנונים דלקתיים על ידי לא כולל תגובות חיסוני אדפטיבית.

למרות שהמתודולוגיה היא פשוטה ולהתאים בקלות כדי לענות על שאלות מדעיות שונות, הבחירה של nebulizer וצינורות היא קריטית. בתצהיר של LPS וneutrophilia וכתוצאה מכך חייב להיות מאומת עם פתחי הכניסה, nebulizers וצינורות אחרים ממה שמתואר כאן. יתר על כן, st עכבר כפחות נפוץגשמים עשויים להציג תגובות שונות לLPS, מינונים אופטימליים של LPS צריכים להיקבע עבור כל זן. יתר על כן, דלקת neutrophilic שנוצרה עם LPS תרסיס דומה עם הדלקת הנגרמת על ידי משלוח intranasal של LPS, כפי שנצפה על ידי אחרים ^{12, 13.} למרות שממשל intranasal קלות מתבצע, המתודולוגיה דורשת הרדמה ועלולה להציג את הפלורה החיידקים של חלל האף לריאות, כמו חלל האף הוא לא סטרילי והטכניקה דורשת כמות גדולה של כלי רכב.

בנוסף לרלוונטי לפציעת ריאות חריפה, הטכניקה עשויה להיות מפותחת יותר לכוללת אתגרים מרובים עם LPS תרסיס. המתודולוגיה ניתן אפוא לשמש כדי לחקור מנגנונים פתוגניים בדלקת הכרונית של COPD, אשר מזוהה עם מתמיד neutrophilia ^14, יחד עם זיהומים חיידקיים חוזרים או קולוניזציה חיידקים קבועה 15. לפיכך, יש חשיבות מיוחדת לדלקת neutrophilic של עכברי תיגר-LPS לזיהומים חיידקיים הקשורים להחמרות COPD, שהוא מרכזיים בהתקדמות מחלה ^{16, 17.}

אתגר עם LPS התרסיס ניתן להגדיר במחיר קטן עם כמה מכשירים ודורש הכשרה מינימאלית. יתר על כן, הטכניקה יכולה להיות מבוצעת באופן שוטף ובכך בקנה מידה גדול בכל מעבדה, עם וריאציה מעט או ללא בין אנשים ולכן עדיף על מסלולים אחרים של משלוח ריאתי.

אברהם רוס קיבל תשלום ממרצה Boehringer Ingelheim, מלגות נסיעה מאסטרה-זנקתי R & D ומענק מחקר מאסטרה-זנקתי R & D. מגנוס Nord הנו עובד במשרה מלאה של אסטרה-זנקה R & D וקיבל מענקי מחקר מאסטרה-זנקתי R & D. יוהאן גרינוולד וTove ברג הוא שיתוף חוקרים בפרויקט מחקר שאינו קשור במימון החברה AstraZeneca R & D.

ברצוננו להודות לקרסטין Thim (AstraZeneca, לונד, שוודיה), בניטה Dahlberg וד"ר אנדרס אקלונד (קרולינסקה, שטוקהולם, שוודיה), כמו גם ד"ר מרטין סטאמפפלי (אוניברסיטת מקמאסטר, המילטון, ON, קנדה) לקבלת סיוע מיומן ועצה מומחה.