סינתזה יעילה מוצק בשלב פפטיד של trimer BIS-peptide פונקציונליות ניצול "בטיחות לתפוס" הליך מחשוף שרף HMBA מתואר.

בשנת 1962 פרסם RB Merrifield ההליך הראשון באמצעות מוצק שלב סינתזת פפטיד כדרך חדשנית ביעילות לסנתז פפטידים. טכניקה זו במהירות הוכיח יתרון על פני קודמו פתרון שלב בזמן והן העבודה. שיפורים על מהות תמיכה מוצק, קבוצות להגנה על עובדים ואת שיטות צימוד המועסקים בחמש השנים האחרונות הגדילו רק את השימושיות של המערכת המקורית של Merrifield. כיום, השימוש הגנה BOC מבוסס בסיס / שרף nucleophile אסטרטגיה cleavable או Fmoc מבוסס הגנה שרף חומצי אסטרטגיה cleavable, חלוץ ידי RC שפרד, משמשים בדרך כלל לסינתזה של פפטידים ^1.

בהשראת אסטרטגיה מוצק של Merrifield תמיכה, פיתחנו BOC / טרט-בוטיל מוצק שלב האסטרטגיה סינתזה להרכבה של פונקציונליות למוצרי פפטידים כתם ^2, אשר מתואר להלן. השימוש סינתזה מוצק בשלב לעומת to פתרון שלב המתודולוגיה היא לא רק יתרון בזמן והן העבודה כפי שתואר על ידי Merrifield ^1, אלא גם מאפשר בקלות רבה יותר בסינתזה של BIS-peptide ספריות. סינתזה שאנחנו מראים כאן משלב לשלב הסופי מחשוף המשתמשת שני שלבים "בטיחות לתפוס" מנגנון לשחרר פונקציונליות BIS-peptide שרף ידי היווצרות diketopiperazine.

כתם למוצרי פפטידים הם נוקשים, ספירו סולם oligomers של ה-BIS-חומצות האמינו כי הם מסוגלים למקם פונקציונליות באופן צפוי designable, שבשליטת בסוג סטריאוכימיה של יחידות monomeric ואת הקישוריות בין מונומר אחד. כל חומצה אמינית-BIS הוא טהור stereochemically, פיגום מחזורית המכילה שתי חומצות אמינו (חומצה carboxylic עם α-אמין) ^3,4. המעבדה שלנו חוקרים כעת את הפוטנציאל של פונקציונליות כתם למוצרי פפטידים על פני מגוון רחב של תחומים לרבות, קטליזה אינטראקציות בין חלבונים ו-Nanomaterials.

1. הגדרת

1. התגובה הגדרת לסינתזה מוצק בשלב זה מחסנית פוליפרופילן פילטר או הכור זכוכית המחוברת דרך צינור פוליפרופילן בקבוק סינון סגורה תחת ואקום, כפי שמוצג באיור 1. התגובה יכולה להיות מעורב בר סערה מגנטית או מבעבעים חנקן באמצעות כור.
2. סעפת הגז המחובר גליל ארגון מצויד בצינור ייבוש bubbler שמן מומלץ גם היא מאפשרת את כלי התגובה להיכלל תחת אווירה פעיל ולא מאפשר הסרה של חומרים כימיים מ באריזות סגורות.
3. כל הפעולות נעשות במנדף ונכון ציוד מגן אישי (משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות nitrile) נדרשת.

2. ראשית טוען Bis-peptide על גבי שרף

1. שוקל 114 מ"ג HMBA-AM שרף (0.88 mmol / טעינה גרם, 100 μmol) לכלי 8 תגובה מ"ל ולהוסיף בר סערה מגנטית. מכסה את החלק העליון של הדואר עם כלי מחצה גומי טיהור צינור עם ארגון לפחות 5 דקות.
2. בינתיים, שוקל 117.3 מ"ג של מתחם 1 של איור 3 (586.63 g / mol, 2eq) ו - 59.2 מ"ג של 1 - (mesitylene-2-sulfonyl)-3-Nitro-1-,2,4 triazole (MSNT, 296.0 g / mol, 2eq) לתוך צינור 15 צנטריפוגות הפנויה מ"ל ו להתמוסס dichloromethane מ"ל 2 נטול מים (DCM). הוסף 24 μL של 1-methylimidazole (NMI, 80.81 מ"ל / mol, 3eq) לפתרון ומערבבים עד שהיא נמסה לגמרי.
3. מעבירים את הפתרון מופעל לכלי התגובה באמצעות מזרק ולאפשר לעורר תחת ארגון לילה ~~~HEAD=NNS (10 שעות).
4. הסר את מחיצת ומסננים את התערובת התגובה. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ו dimethylformamide (DMF) (5x). לבצע את "מבחן מתיל אדום" המתואר בסעיף 10.1 כדי להעריך את מידת הטעינה שרף. אם שרף נשאר אדום במהלך הבדיקה מתיל אדום ואז צעדים 2.2 ו 2.3 יש לחזור. צבע צהוב, מצביע על מבחן שלילי מתיל אדום, היא המועדפת;עם זאת, מאז באף אחת מהקבוצות הידרוקסיל הנותרים יהיו כתרים בשלב הבא, תוצאה חיובית מעט (אור בצבע כתום שרף) עשוי להיות מקובל.

3. Deprotection של שרף Bis-peptide בו זמנית ראשון תקרת

1. הוסף 1 מ"ל של DCM לכלי התגובה ולאחר מכן להוסיף 1 ברומיד מ"ל מימן 33% dropwise חומצה אצטית על 30 שניות (מבעבע מתרחשת) ולאפשר לעורר במשך 15 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת.
2. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). לנטרל את שרף על ידי שטיפה פעמיים עם פתרון V / V 5% N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) ב DMF מכן לשטוף עם DCM (5x) ו DMF (5x) שוב. לבצע את "מבחן מתיל אדום" ו - "מבחן chloranil" שהוזכר בסעיף 10.1 ו -10.2. תוצאות צריך להיות שלילי אדום מתיל הבדיקה חיובית למבחן chloranil.

4. צימוד BOC / tBu מוגן פונקציונליות Bis-עמילא חומצה

1. להחזיר אווירה אינרטי לכלי, המכיל שרף תגובה על ידי שטיפה שלוש פעמים עם DCM נטול מים מכן לצרף מחצה וקו ארגון. לנקות ולשטוף את הכלי על ידי הוספת 1-2 מ"ל של DCM נטול מים ולתת ומערבבים במשך 30 שניות ולאחר מכן ניקוז כלי עד קו ארגון bubbler מתחיל לעלות. האם זה לפחות עוד פעם אחת.
2. להכין תמיסה של 0.15 M פונקציונליות BIS-חומצת אמינו (3eq) ו - 245 מ"ג של 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt, 136.11 g / mol, 18eq) ב 2 מ"ל של DCM 02:01: DMF במבחן האש יבשים צינור תחת אווירה ארגון. הוסף 47 μL של diisopropylcarbodiimide (DIC, 156.6 מ"ל / mol, 3eq) ומערבבים במשך 90 דקות.
3. הוסף 35 DIPEA μL (174.19 מ"ל / mol, 2eq) ב DMF 666 נטול מים μL כדי שרף ומאפשרים לערבב במשך 5 דקות.
4. להעביר מראש פעיל BIS-חומצה אמינית פתרון לכלי התגובה באמצעות מזרק ולאפשר לעורר לילה.
5. מסננים את התערובת התגובה ולשטוף פעמיים עם DCM נטול מים בתקופת ארגון.
6. כדי לקדם את סגירת diketopiperazine, להוסיף פתרון 0.25 מ 'של HOAt (136.11 g / mol, 10eq) ו DIC (156.6 מ"ל / mol, 10eq) ב 4 מ"ל של 1:1 DCM: DMF ולאפשר לעורר במסגרת ארגון שעה 1.
7. הסר את מחיצת ומסננים את התערובת התגובה. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ו DMF (5x). אם תרצה, לבצע את "מבחן chloranil" שהוזכר בסעיף 10.2.

5. Deprotection של BOC / tBu מוגן חומצה אמינו Bis-פונקציונליות

1. הוסף 2 מ"ל של תמיסה של חומצה trifluororacetic 95:5 (TFA): triisopropylsilane (TIPS) לכלי התגובה ולאפשר לו ומערבבים במשך שעה 1. מסננים שוטפים את שרף במשך כ 30 שניות עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת.
2. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). לנטרל את שרף על ידי שטיפה פעמיים עם פתרון V / V 5% DIPEA ב DMF אז לשטוף DCM (5x) ו DMF (5x) שוב. אם תרצה, לבצע את "מבחן chloranil" שהוזכר בסעיף 10.2.

7. Functionalizing סוף Bis-peptide Prolidine

1. בסוף prolidine של פפטיד BIS הגוברת ניתן acylated באופן עצמאי או יחד באמצעות diketopiperazine. כמו כן, לצורך כך ניתן להשאיר מוגנים, אשר יהיה ביקע האחרונים והנותן את חומצת האמינו חינם. אם תרצה, לבצע את "מבחן chloranil" שהוזכר בסעיף 10.2 כדי להעריך את יעילות צימוד.

8. Deprotection של Fmoc ו Acylation הסוף הרביעון של Bis-peptide

1. פתרון 2ml של piperidine 20% DMF נוסף והתגובה היא מעורבת במשך 20 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DMF (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת.
2. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x).
3. הכן פתרון 0.15 מ 'של חומצת אמינו (3eq) ב 2 מ"ל של N-methylpyrrolidone (NMP) עם 114 מ"ג 2 - (7-עזה-1H-benzotriazole-1-י.ל.) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU, 380.2 גרם / מול, 3eq) ו 104.5 DIPEA μL (174.19 מ"ל / mol, 6eq) ומערבבים היטב. הוסף תגובה כלי ולאפשר לעורר במשך 6 שעות.
4. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x).

9. הסר את הקבוצה BOC שרף כרוך חומצת אמינו ו קליב שרף

1. הוסף 2 מ"ל של TFA 01:01: פתרון DCM לכלי התגובה ולאפשר לעורר במשך 30 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת.
2. לשטוף ולנקז שרף במשך 30 שניות עם DCM (5x) ואז DMF (5x).
3. הוסף 2 מ"ל של תמיסה של DIPEA 10% DMF נטול מים ולאפשר לעורר 24-48 שעות.
4. לאסוף את התערובת לתוך בקבוק התגובה מראש שקל בתחתית הסיבוב. העברת 30 μL של פתרון זה μL 450 של THF בבקבוקון LC-MS ולהגיש לבדיקה. לשטוף את שרף עם aliquots נוספים של DMF ולאסוף לתוך הבקבוק התחתון בסיבוב מכן הסר ממס ב vacuo.

10. טיהור של ה-BIS-peptide

1. ממיסים גולמי BIS-peptide בסכום מינימלי של sulfoxide דימתיל (100-250 μL) ולהעביר את הכנס בקבוקון HPLC. הכנס לתוך המקום autosampler של חצי prepitive HPLC המערכת (Hewlett Packard 1100 הסדרה) מצויד הכנה XTerra MS טור C18 7.8x150 5 מ"מ מיקרומטר ו לולאה 100 הזרקת μL.
2. ביצוע מספר רב של 50 זריקות μL של המדגם באמצעות תוכנית הדרגתי של 5-95% אצטוניטריל במים עם חומצה פורמית 0.1% מעל 30 דקות תוך ניטור ב 274 ננומטר. איסוף המוצר שיא בצינור מראש שקל חד פעמי צנטריפוגות ולהקפיא יבש באמצעות lyophilizer. זהירות יש לנקוט עם הסיבוב הראשון כמו שינוי קל זמן השמירה שיא בהשוואה LCMS אנליטיים הוא נצפה בדרך כלל.

11. שיטות הערכה

1. מתיל אדום מבחן ⁷: הסר ~ 1 מ"ג של שרף יבש באמצעות פיפטה חד פעמי לשטוף את כלי התגובה 4 מ"ל. הוסף פתרון של 20 מ"ג מתיל אדום, 50 N μL, ללהקת diisopropylcarbodiimide (DIC), ו 5 מ"ג 4-dimethylaminopyridine (DMAP) ב DCM 500 נטול מים μL ולאפשר לעורר למשך 5-10 דקות. מסננים לשטוף שרף עם DCM עד תסנין הופך חסר צבע. סימן חיובי הוא שרף את החרוזים הנותרים כתום או אדום.
2. מבחן CHLORANIL ^12: העברה ~ 1 מ"ג של שרף יבש לתוך בקבוקון קטן באמצעות פיפטה חד פעמי. הוסף 3 טיפות של chloranil הן 0.8 מ"מ פתרון DMF ו אצטילדהיד 2% בתמיסה DMF ולתת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות. אינדיקציה חיובית היא החרוזים שרף מפנה כחול / סגול.
3. מלכודת הפעלת מבחן: תרכובות מופעל במהלך הסינתזה ניתן להעריך על ידי העברת כמות קטנה (μL 5-10) של הפתרון מופעל על כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה נוזלית (LC-MS) בקבוקון המכיל 50 μL של pyrrolidine. מערבבים ביד במשך כמה שניות (solutiב צריך להיות צהוב) ואז לדלל עם μL 450 של tetrahydrofuran (THF) ולהגיש לניתוח LC-MS.
4. אנליטי LC-MS: המוצר הסופי ביניים הפעיל ניתן להעריך באמצעות HP 1200 סדרת LC-MS מערכת מצויד Xterra ווטרס טרשת נפוצה 3.5 מיקרומטר C18 4.6 מ"מ x 150 מ"מ טור מערכת שיפוע של אצטוניטריל 5-95% במים עם חומצה פורמית 0.1% מעל 30 דקות.

12. נציג תוצאות

דוגמה בוטה הן (איור 4) מטוהרים (איור 5) עקבות LCMS מסופקים. התשואות מטוהרים של כ -10% צפויים להשתמש בשיטות שתוארו לעיל.

באיור 1. תרשים של ניסיוני הגדרת לסינתזה שלב מוצק.

איור 2.מינוח רלוונטי של ה-BIS, חומצות אמינו / כתם למוצרי פפטידים.

איור 3. תוכנית סינטטי בסך הכל. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 4 א. Trace HPLC של מוצר גולמי ב 274 ננומטר.

איור 4 ב '. ספקטרום MS שיא של מוצר גולמי.

איור 5 א. HPLC עקבות של מטוהרים מוצר ב 274 ננומטר.

איור 5 ב '. MS ספקטרום של מטוהרים producלא שיא.

הגישה המוצגת כאן סינתטי מספק שיטה לסינתזה של פפטידים למוצרי כתם פונקציונליות מ-BIS אמינו אבני הבניין של חומצות באמצעות נפוצות מוצק שלב סינתזה טכניקות פפטיד. סינתזה מונומר אלה אבני הבניין "Pro4" מ ³ טרנס-4-hydroxyproline היא מדרגית הושלם בהצלחה השלב hydantoin ב mmol 600 (234 גרם) בהיקף (לא פורסם). לאחר מונומרים הם ביד, השימוש מוצק שלב טכניקות מספק שיטה מהירה יותר של סינתזה BIS-peptide מ המתודולוגיה הנוכחית פתרון שלב ⁴ שלנו על ידי ביטול הצורך התגובה עבודה עליות purifications ביניים.

האתגר העיקרי בסינתזה מוצק הוא שלב באבחון התקדמות הבעיה סינתטי פתרון ביניים שכן אין הם מבודדים. זה הוביל לפיתוח של בדיקות colorimetric רבים כולל אלה כדי לזהות אם אמינים חינם (קייזר מבחן ¹⁰⁾ או ללא hydroxyls (מתיל מבחן האדום ⁷⁾ נחשפים על שרף. למרבה הצער, מבחן נפוץ קייזר ¹⁰ אינו חל בדרך כלל סינתזה שלנו מוצק שלב עקב השימוש הבלעדי כמעט של אמינים או אמינים משניים המחובר לפחמן הרביעון. אפשרויות אחרות להערכה על שרף HMBA כוללים השסעים הבדיקה באמצעות nucleophile כגון ¹¹ הידרזין, מחשוף Fmoc כמותית פיקוח על ידי UV / Vis ^1,11, ו - השמנה וניתוח תרכובות מופעל נכנסות.

נושא נוסף התעלמו בסינתזה מוצק בשלב זה האופי החוזר ונשנה של צעדים סינתטיים הנדרשים על ידי המפעיל. עם זה בחשבון, החוקרים ממליצים על שימוש בגיליון אלקטרוני או רשימת הבדיקה בעת ביצוע כל סינתזה ידנית מוצק בשלב פפטיד.

המתקשים בשימוש כתם למוצרי פפטידים לסינתזה מוצק בשלב לעומת α-אמינו חומצות נפוצות כוללת את פוטנציאל הזיווגים קשה יותר בשל הין סטריתdrance, הצורך ב-שרף סגר diketopiperazine, ו deprotections בו זמנית (BOC / tBu; Cbz / tBu). המתקשים נוסף טמון בהשגת שחרור הכמותי לעומת שרף באמצעות "הניצרה" השיטה בהשוואה אמצעי יותר קונבנציונאלי. עם גורמים אלה בחשבון, זה אפשרי מאוד אופטימיזציה נוספת של שיטה זו יכולה להיות מושגת ואת המאמצים הנוכחיים נערכים בקבוצה שלנו כדי לשפר את השיטה המוצגת כאן.

אין ניגוד עניינים הצהיר.

המחברים מבקשים להודות לד"ר זכריה ז בראון וג'ניפר Alleva לפיתוח הראשוני של טכניקה זו סינתזה מוצק בשלב פרקר ומתיו FL לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכת על ידי הסוכנות איום הפחתת ההגנה (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) ואת פרס Witzel הורסט אחוות נתמך על ידי Cephalon, Inc