הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

חלבונים אינטראקציות הם סימן ההיכר של כל תהליכים תאיים חיוניים. עם זאת, רבים של אינטראקציות אלה חולף, או חלש אנרגטית, מניעת הזיהוי שלהם באמצעות ניתוח בשיטות ביוכימיות מסורתיים כגון immunoprecipitation שיתוף. בהקשר זה, את החלבונים פלורסנט encodable גנטית (GFP, RFP, וכו ') שלהם קשורה חופפים ספקטרום הקרינה חוללו מהפכה ביכולת שלנו לפקח על אינטראקציות חלשות in vivo באמצעות תהודה פורסטר העברת אנרגיה (סריג) ^1-3. כאן, אנו בפירוט השימוש שלנו assay סריג מבוסס הקרבה לניטור קולטן קולטן אינטראקציות על פני תא האנדותל.

פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים. השיבוט הראשון, הצעד של הגן העניין שלך לתוך ביטוי יונקים וקטור אמינו סופני לגירסאות monomeric של CFP ו / או YFP יהיה רק ​​דנו בקצרה. השלבים השני והשלישי; transfection של דנ"א לתוך וקטור EA.hy926 לתאי אנדותל, הדמיה confocal עם סריג, המפורטות יותר לעומק בהמשך.

1. בנייה של קולטנים CFP ו YFP chimeric

רצפטורים של עניין צריך להיות משובטים אמינו סופני כדי monomeric גרסאות משופרות של CFP ו YFP. קביעת סריג היא אמפירית תלויה באופן קריטי על אורך של והמקשר בין הטרנסממברני פורש האזור תחילת fluorophore ^1. לכן, באורכים שונים של והמקשר חייב להיחקר עבור כל זוג קולטן חדש תחת חקירה.

1. Into the pcDNA3.1 hygro ^R או ניאו וקטור המכיל ^C-R או monomeric YFP (זה וקטור ניתן לקבל במעבדה שלנו), שיבוט קולטן העניין שלך לתוך האתרים NheI / EcoRI. * הערה, אם יש צורך, NheI תואם אנזימים אחרים, כולל SpeI ו XbaI.
2. המרה התגובה קשירת שלך לתוך קו התא המתאים recA endA1 המוסמכת (אנו משתמשים באופן שגרתי Mach1). מושבות מסך נוכחות של הכנס ואחריו רצפי DNA כדי לוודא היעדר מוטציות.
3. עם קבלת קונפורמציה של שיבוט מולקולרי מוצלח, להכין transfection כיתה DNA וקטור במים מעוקרים או TE באמצעות Qiagen, או דומה, ערכות ה-DNA. הערכת הריכוז טוהר באמצעות ספקטרוסקופית UV. התשואות אופיינית של ה-DNA צריך להיות בטווח של 100-200 מיקרוגרם, שהוא מדולל באופן שגרתי למלאי עבודה של 1 מיקרוגרם / μL.

2. Transfection של 926 תאים EA.hy

1. פיצול EA.hy 926 תאים ^4, גדל להשלים-DMEM (DMEM 10% בסרום שור עוברית + Pen. / דלקת.) לתוך MatTek coverslip (מס '0) 35 מ"מ עם מנות בינוני 2 מ"ל. אתה יכול להשיג שמרני ~ 15 מנות (~ 90% ומחוברות למחרת) מתוך קערה ומחוברות 15 ס"מ. הכינו צלחת אחת להעריך הביטוי של הקולטן בנפרד, כמו גם מנה אחת לכל זוג הקולטן.
2. אפשר התאים כדי לדגור לילה באווירה 5% CO ₂ ב 37 ° C. למחרת, תרבויות יש ~ ומחוברות 70-90%.
3. ביום transfection, להכין את מתחמי nucleolipid ידי ערבוב 2 מיקרוגרם של ה-DNA וקטור chimeric קולטן (2 μL) עם 8 μL של Fugene6 ב 200 μL של OptiMEM מראש התחמם. עבור זוגות קולטן, transfect עם 1 מיקרוגרם של קולטן זה, עבור סכום כולל של מיקרוגרם 2 (ראה גם דיון בהמשך).
4. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
5. המשך דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
6. במהלך תקופת הדגירה, להכין את התאים transfection. לשאוב את התקשורת טרי לשטוף כל צלחת בעדינות בקצרה עם PBS חמים לפני תוספת של 2 מ"ל מראש חימם להשלים-DMEM ללא אנטיביוטיקה (DMEM + FBS). חשוב למנוע את נוכחותו של פניצילין וסטרפטומיצין, כפי שהם הרבה יותר רעיל לתאים במהלך הטיפול עם Fugene6.
7. הוסף את הירידה מורכב חכם תאים דגירה של 20-24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס אווירה של 5% CO _2.
8. לאחר 24 שעות, לשאוב היטב את התקשורת בין התאים פיפטה טרי שלם, DMEM עם אנטיביוטיקה. בעקבות transfection, כדאיות התא צריך להישאר גבוהה יחסית, כלומר לא מעט תאים צף יש לשים לב.
9. התבטאות גנים היא מקסימאלית בדרך כלל לאחר 48-60 שעות נוספות שלאחר transfection. עם זאת, הדמיה אפשרית בדרך כלל קצר כמו 24 שעות. כמובן הזמן ניסויים על ביטוי גנים אופטימלי יש לבצע.

3. הדמיה confocal ו סריג ניתוח

חיים הדמיה תא מבוצע על מיקרוסקופ TCS-SP2 לייקה confocal לייזר AOBS סריקה מצויד דיודה כחולה (405 ננומטר), ארגון (458, 476, 488, 514 ננומטר). HeNe ירוק (543 ננומטר), כתום HeNe (594 ננומטר), ו HeNe אדום (633 ננומטר) לייזרים, PI HCX Apo 63x/1.3 na-גליצרין טבילה העדשה אובייקטיבי, XY ממונע הבמה (Märzhäuser), וכן לשלוט לסביבה ( טמפרטורה, לחות, ו-CO ₂₎ שלב החממה (Pecon). שולטת ניסויית הן קריטיות כדי לחסל fluorophore צולבות לדבר בין ערוצי פליטה כמו גם להעריך בעיות הביטוי הלא ספציפית multimerization fluorophore. ככזה, transfections fluorophore יחיד מנוצלים עבור הקמת כל מושב התמונה. שלילי סריג שולטת (באמצעות קולטנים noninteracting ידוע) יהיה צורך לבצע, על מנת לקבוע את הרקע סריג כי מתרחשת עקב הבעת פני.

1. כדי למנוע crosstalk בין ערוצי הפליטה CFP ו YFP, במקום לשלוט ביטוי CFP לתוך החממה הבמה. בעזרת אור לבן, להתאים את Z-צלחת להתמקדאל התאים.
2. קביעת הגדרות SP חלון לגילוי פליטה של ​​CFP על 465-505 ננומטר ו YFP על 525-600 ננומטר.
3. בעוד ניטור שני ערוצי הפליטה, להלהיב את CFP ב 458 ננומטר. שימוש AOTF, להגדיר את כוח לייזר לחסל לדמם ניכר של מעל CFP לתוך התעלה פליטת YFP. שמור הגדרה זו.
4. בצעו את אותה שליטה על YFP crosstalk (באמצעות השלט ביטוי YFP) בערוץ CFP ידי התאמת כוח עירור ב 514 ננומטר עבור תאים להביע YFP בלבד. שמור הגדרה זו.
5. תאים המקום הבא שיתוף להביע CFP ו YFP לתוך החממה הבמה. באמצעות קביעת רצף של התוכנה לייקה confocal, לאתר תאים להביע רמות דומות של CFP ו YFP עם לוקליזציה קרום תקין.
6. שימוש acceptor תוכנה לייקה צילום הלבנת התוכנית, קבע את הגדרות התורם acceptor כדי CFP הציל וההגדרות YFP, בצורה מכובדת.
7. התקרבות אל התא, להדגיש את ההחזר על ההשקעה (אזור של אינטרס) שבו צילום הרס YFP היא מתרחשת על קרום התא ולהתחיל את התוכנית.
8. עבור הרס תמונה של acceptor, להתאים את AOTF עד 100% ב 514 ננומטר ולאפשר לייזר הלבנת להימשך עד 70% מכלל הפליטה YFP כבר תיגמר. כדי להאיץ את הלבנה, ROIs נבחרים בדרך כלל הציר סריקה של הלייזר (ציר ה-X).
9. במהלך צילום הלבנה, לנטר את התנועה הסלולר לדחות מדידות שהושג עם התנועה ניכר מטוס-XY, כמו מדידות אלו ניתן לדווח שקר סריג יעילות.
10. תמונות טרום ופוסט אקונומיקה נרשמות גם עבור התורם (CFP) ו acceptor (YFP) ו סריג יעילות מחושב: סריג _EFF = (D-D _{הודעה מראש)} / D _הודעה לכל _פוסט D> ד _מראש כאשר D _מראש ו-D הוא _לפרסם את עוצמת התורם לפני ואחרי photobleaching בהתאמה.
11. תוכנת JMP (SAS) משמש כדי לקבוע את מידת ההשתנות ניסיוני.

4. נציג תוצאות

יעילות transfection הם בדרך כלל בין 30% עד 40. למרות ממצאים קודמים על ידי אחרים, לא ראינו כי transfection וביטוי של וקטור אחד טובות של האחר. אכן, לעתים קרובות אנו רואים ביטוי הבלעדית של fluorophore one הכימרה או אחר. אופיינית סריג יעילות להשתנות בין מערכות הקולטן. עבור מערכת הקולטן עניבה, הערכים האופייניים הם 20-28% עבור תאים אפיתל 19-23% בתאי האנדותל. עבור פקדים שלילית, יעילות טיפוסית להלן 2-3%. מידת ההשתנות יקטן במידה ניכרת עם ניסיון.

באיור 1. תמונות נציג transfected EA.hy 926 תאים. תמונה) DIC monolayer של 926 תא EA.hy. ב) תמונה פלואורסצנטי של תאים מוצג (A). ג) כיסוי של (א) ו - (ב) הוכחת יעילות ~ transfection 20-30%.

איור 2. Acceptor נציג צילום הלבנת ניתוח של סריג המתרחשים בין CFP ו YFP בתא EA.hy926. הפליטה CFP ערוץ (לוחות עליון) YFP פליטת ערוץ (למטה שני פאנלים) נוטרו בנפרד לפני ו acceptor הודעה photobleaching. ניסויים photobleaching הוגבלו, ועל סריג ערכים מחושבים מן, האזור בתוך הקופסה הירוקה. סריג יעילות מוצג מגוון מוחלט מ גבוה (אדום 1.0) לנמוך (סגול 0.0) על כיסוי מוגדל של CFP / YFP הממוזגת תמונה לצורך התמצאות בלבד.

ישנם מספר צעדים אשר הם קריטיים להצלחה. הבולט ביניהם הוא קרוב משפחה של רמות ביטוי בין שני קולטנים chimeric. כדי לעקוף בעיה זו, ניתן להפוך את שורות תאים יציבות להביע הן חלבונים של עניין, או לזהות יחס אופטימלי של ה-DNA וקטור לאפשר ביטוי שווה. כמו כן, בשל transfection לא אחידה על פני צלחת, רמות החלבון יהיה לעתים רחוקות להיות שווה בין תאים. לכן, יש לשים לב כדי להבחין בין "גבוה" expressors מ 'נמוך'. אלה כי רמות "ממוצעים" התצוגה של החלבון בדרך כלל תשואה אמין לשחזור סריג יעילות. שיטה אחת במעבדה שלנו קידמה כדי להקל על בעיה זו הוא השימוש adeno ו-lenti וירוסים ביטוי גנים "אפילו". יתר על כן, שיטה חלופית כדי צילום הלבנת acceptor לקביעת סריג יעילות היא פליטה רגיש. אמנם, למרות הפוטנציאל של פליטת רגיש כדי לפקח על תאים בודדים בזמן אמת, מצאנו צילום הלבנת acceptor להיות רגישים יותר ואמין יותר.

לבסוף, בעזרת סריג לפקח על אינטראקציות חלבון יכול להיות מאתגר, דורש בחירה זהירה של אורכי מקשר עבור קולטני קרום כבול. יתר על כן, תוספת של C / YFP לעתים קרובות מאוד משפיע על רמות ביטוי חלבון ותוצאות צבירה ב reticulum endoplasmic ומכשירים golgi. עם זאת, עבור אינטראקציות חולף או לא יציב, סריג הוא מתודולוגיה האידיאלי לנצל.

אנו רוצים להודות ד"ר סקוט הנדרסון לעזרה עם מיקרוסקופיה confocal. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות 1RO1CA127501 כדי WAB, כמו גם מימון הפרויקט טייס ממרכז הסרטן מאסי ואת בית הספר לרפואה (VCU) כדי מיקרוסקופית WAB בוצע ב-VCU Dept. לנוירוביולוגיה & אנטומיה מיקרוסקופית מתקן, נתמך, בין היתר, במימון מרכז NIHNINDS הליבה מענק 5P30NS047463.