Spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis)

Source : Laboratoire du Dr B. Jill Venton - University of Virginia

Spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis) est une des techniques analytiques plus populaires, car il est très polyvalent et capable de détecter presque chaque molécule. Avec la spectroscopie UV-Vis, la lumière UV-Vis est passée à travers un échantillon et la transmission de la lumière par un échantillon est mesurée. De la transmission (T), l’absorption peut être calculée comme une =-log (T). Un spectre d’absorbance qui montre l’absorbance d’un composé à différentes longueurs d’onde est obtenu. Le montant de l’absorbance à une longueur d’onde est due à la structure chimique de la molécule.

UV-visible peut être utilisé de manière qualitative, pour identifier les groupes fonctionnels ou de confirmer l’identité d’un composé en comparant le spectre d’absorbance. Il peut également être utilisé de manière quantitative, comme concentration de l’analyte est liée à l’absorption à l’aide de la Loi de Beer. Spectroscopie ultraviolet-visible est utilisée pour quantifier la quantité d’ADN ou de protéines dans un échantillon pour analyse de l’eau et comme un détecteur pour de nombreux types de chromatographie. Cinétique des réactions chimiques sont également mesurée par spectroscopie UV-visible en prenant des mesures répétées de l’UV-visible au fil du temps. UV-Vis sont généralement pris avec un spectrophotomètre. UV-Vis est également un détecteur très populaire pour les autres techniques d’analyse, comme la chromatographie, parce qu’il peut détecter de nombreux composés.

En général, UV-Vis n’est pas la technique de spectroscopie plus sensible, car pas beaucoup de lumière est absorbée sur une longueur de chemin d’accès court. Autres techniques de spectroscopie comme la fluorescence ont une sensibilité plus élevée, mais ils ne sont pas généralement applicables, comme la plupart des molécules ne sont pas fluorescentes. UV-Vis a une sensibilité similaire aux autres mesures d’absorbance, telles que la spectroscopie infrarouge.

UV-Vis est souvent appelé une technique générale parce que la plupart des molécules absorbera dans la gamme de longueur d’onde UV-Vis. Le UV s’étend de 100 à 400 nm et le spectre visible, de 400 à 700 nm. La plage de 100 à 200 nm est appelée l’UV profond. Sources de lumière sont plus difficiles à trouver pour cette gamme, donc il n’est pas couramment utilisé pour les mesures de l’UV-Vis. Typiques spectromètres UV-Vis utilisent une lampe au deutérium pour le UV que produit feu de 170 – 375 nm et une lampe à filament de tungstène pour visible, qui produit de lumière de 350 – 2 500 nm.

Quand un photon frappe une molécule et est absorbé, la molécule est promue dans un état énergétique plus excité. Lumière UV-visible a assez d’énergie pour promouvoir des électrons à un état électronique supérieur, de la plus haute orbitale moléculaire occupée (HOMO) à la plus basse orbitale moléculaire inoccupée (LUMO). La différence d’énergie entre l’HOMO et la LUMO est appelée la bande interdite. En règle générale, ces orbitales sont appelés collage et anti-adhérant. L’énergie du photon doit correspondre exactement à la bande interdite pour le photon à absorber. Ainsi, molécules avec des structures chimiques différentes ont différentes énergies bande les lacunes et les différents spectres d’absorption. Les transitions plus courantes qui entrent dans la gamme UV-Vis sont π-π * et n - π *. Orbitales pi découlent des doubles liaisons, et n orbitales sont pour les électrons non-liantes. Star de pi sont les orbitales anti-liaison pi. Ainsi, la meilleure absorption UV-Vis est de molécules contenant des doubles liaisons. Pi orbitales adjacentes qui sont reliées, appelé conjugaison, généralement augmente l’absorption. Sigma-σ * transitions, associées à des liaisons simples, sont des énergies plus élevées et tomber dans l’UV profond, donc ils sont moins utiles pour l’utilisation en routine. L’apparition de bandes larges ou les épaules sur la structure de l’UV-Vis tient les nombreux États vibrations et de rotationnels d’une molécule, qui conduisent à séparer les lacunes de bande énergie des énergies légèrement différentes.

Pour les molécules avec absorption dans le visible, les composés apparaîtra souvent colorées. Cependant, une idée fausse commune est que la longueur d’onde d’absorption maximale (λ_max) pour un composé est la couleur, qu'il semble. Un composé qui apparaît rouge n’a pas beaucoup d’absorption dans la région rouge du spectre. Au lieu de cela, le λ_max pour un composé qui ressemble rouge est vert. La couleur d’un composé surgit parce que ces longueurs d’onde de la lumière sont sélectivement transmis par le biais de l’échantillon, et donc ils ne sont pas absorbés. Une roue chromatique est utile pour déterminer quelle couleur va absorber un composé et quelle gamme du λ_max sera, comme la couleur directement en face de la roue de la couleur observée est la couleur qui est plus absorbée.

L’absorption suit la Loi de Beer, A = εbC où ε est le coefficient d’atténuation molaire, b est la longueur du trajet, et C est la concentration. Le coefficient d’atténuation molaire est la caractéristique d’un composé individuel d’absorber à une longueur d’onde donnée et cette propriété est due à des groupes fonctionnels, conjugaison, etc.. Si un composé n’a pas un fort coefficient d’atténuation, il pourrait être marqué avec un ensemble approprié d’augmenter son absorption. Longueur de chemin d’accès est généralement liée à la taille de la cuve et 1 cm de spectrophotomètres standards.

UV-Vis est effectuée sur une variété d’instruments, du traditionnels spectrophotomètres à plusieurs lecteurs de plaques de moderne-jour. Il faut choisir la longueur d’onde d’absorbance, soit à l’aide d’un filtre ou un monochromateur. Un monochromateur est un dispositif qui sépare les longueurs d’onde de la lumière dans l’espace et place ensuite une fente de sortie correspondant à la longueur d’onde désirée de la lumière. Monochromateurs peuvent être analysés afin de fournir un spectre d’absorbance ensemble. Alternativement, un instrument de diodes permet toutes les couleurs de la lumière pour être transmis par le biais de l’échantillon, puis la lumière est séparée en différentes longueurs d’onde dans l’espace et détectés en utilisant des photodiodes. Instruments de diodes recueillent plein spectre plus rapidement, mais sont plus compliqués et plus chers.

1. calibrer le spectromètre

1. Allumez le spectromètre UV-Vis et laisser les feux pour se réchauffer pendant une période appropriée de temps (environ 20 min) pour stabiliser.
2. Remplir une cuvette avec le solvant pour l’échantillon et assurez-vous que l’extérieur est propre. Ceci servira comme blanc et aider à tenir compte de légères pertes en raison de la diffusion ou absorption par le solvant.
3. Placez la cuve dans le spectromètre. Veillez à aligner la cuve correctement, car souvent la cuvette a deux parties, qui sont destinés à la manutention (peuvent être rainurés) et ne sont pas censés briller la lumière à travers.
4. Faire une lecture pour l’essai à blanc. L’absorbance devrait être minime, mais toute absorption devrait être déduite sur de futurs échantillons. Certains instruments peuvent stocker les données vides et effectuer la soustraction automatiquement.

2. effectuer un spectre d’Absorbance

1. Remplir la cuvette avec l’échantillon. Pour s’assurer que le transfert est quantitatif, rincer la cuvette deux fois avec l’échantillon et puis remplissez-le sur ¾ plein. Assurez-vous que l’extérieur est propre des empreintes digitales, etc..
2. Placez la cuve dans le spectromètre dans le bon sens.
3. Couvrir la cuve afin d’éviter toute lumière ambiante.
4. Recueillir un spectre d’absorbance en permettant à l’instrument parcourir les différentes longueurs d’onde et recueillir l’absorbance. La gamme de longueur d’onde peut être définie avec des informations sur l’exemple spécifique, mais une gamme de 200 à 800 nm est standard. Un instrument de diodes est en mesure de recueillir un spectre d’absorbance ensemble en une seule frappe.
5. À partir du spectre d’absorbance collectées, déterminer le maximum d’absorbance (λ_max). Répétez la collection des spectres pour obtenir une estimation de l’erreur en λ_max.
6. Pour faire une courbe d’étalonnage, percevoir le spectre UV-Vis d’une variété d’échantillons de concentration différente. Spectromètres sont souvent limitées à une gamme de linéarité et ne sera pas capables de mesurer une valeur d’absorbance supérieure à 1,5. Si les valeurs d’absorbance de l’échantillon sont en dehors de la gamme de linéarité de l’instrument, diluer l’échantillon pour obtenir les valeurs dans la plage linéaire.

3. cinétique des expériences avec la spectroscopie UV-visible

1. UV-visible peut être utilisé pour des expériences de cinétique en examinant la différence d’absorption au fil du temps. Pour une expérience de cinétique, prendre une lecture initiale de l’échantillon.
2. Ajouter rapidement le réactif pour lancer la réaction chimique.
3. Remuez bien pour mélanger avec l’échantillon. Si on ajoute une petite quantité, cela pourrait se faire dans une cuvette. Vous pouvez également mélanger le réactif avec l’échantillon et versez rapidement certains dans une cuvette pour une mesure.
4. Mesurer l’absorbance à la λ_max pour les analytes d’intérêt au fil du temps. Si en utilisant le réactif de mesure étant (c.-à-d. l’absorbance est de monter parce qu’il est moins réactif à absorber), puis la désintégration indiquera l’ordre de la réaction.
5. À l’aide d’une courbe d’étalonnage, faire un terrain de temps de vs concentration d’analyte, convertir la valeur d’absorbance en concentration. A partir de là, ce graphique peut être adapté avec les formules appropriées pour déterminer les constantes de vitesse de réaction.

UV-visible peut être utilisé pour obtenir un éventail de composés colorés. Dans la Figure 1 a, le spectre d’absorption d’un colorant bleu apparaît. L’arrière-plan montre les couleurs de la lumière dans le spectre visible. Le colorant bleu a une absorption_maximum de λ dans l’orange/rouge. Figure 1 b montre un spectre d’un colorant rouge, avec λ_max dans le vert.

Cinétique mesurable d’une parcelle de l’absorbance à une longueur d’onde au fil du temps. La figure 2 montre une parcelle de l’absorbance d’un colorant bleu (630 nm) car il réagit avec l’eau de Javel.

Figure 1. Spectres d’absorption UV-Vis. A. bleu colorant #1 a absorbance maximale dans l’orange/rouge. B. rouge colorant #40 a l’absorbance maximale dans le vert. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. UV-Vis pour la cinétique. Absorbance du colorant bleu #1 comme il réagit avec l’eau de Javel. La courbe peut être adaptée avec une décroissance exponentielle, ce qui indique de la cinétique de premier ordre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

UV-Vis est utilisé dans de nombreuses analyses chimiques. Il est utilisé pour doser la quantité de protéines dans une solution, comme la plupart des protéines absorbent fortement à 280 nm. La figure 3 illustre un exemple de spectres du cytochrome C, qui a une forte absorbance à 280 et également à 450 en raison d’un hème du groupe. UV-Vis est également utilisé comme une technique standard pour quantifier la quantité d’ADN dans un échantillon, car toutes les bases absorbent fortement à 260 nm. ARN et les protéines absorbent aussi à 260 nm, alors l’absorbance à d’autres longueurs d’onde peut être mesuré afin de vérifier des interférences. Plus précisément, les protéines absorbent fortement à 280 nm, donc le rapport de l’absorbance à 280/260 peut donner une mesure du ratio de protéine à l’ADN dans un échantillon.

La plupart des analyses simples mesurent la longueur d’une onde absorbance à la fois. Toutefois, les informations plus chimiques sont présentes si des mesures sont effectuées à plusieurs longueurs d’onde simultanément. Barrettes de diodes instruments capture toute la lumière qui est transmise, diviser la lumière en différentes couleurs à l’aide d’un prisme ou un caillebotis holographique et absorbance à différentes longueurs d’onde est capturé sur un réseau linéaire de photodiodes. L’avantage de cette méthode est qu’il est utile pour mesurer plusieurs molécules différentes simultanément.

Figure 3. Spectre UV-Vis d’une protéine. Du pic à 280 nm est révélateur d’une protéine. Le pic à 450 est due à l’absorption du groupe hème du cytochrome C.