Préparation et élevage d’insectes axeniques avec des semis de culture tissulaire pour les études d’interaction entre le microbiote hôte et intestinal du coléoptère

Pour obtenir un insecte axenique, sa surface d’œuf est stérilisée et la larve éclose est ensuite élevée à l’aide de feuilles axeniques. Cette méthode fournit un moyen efficace pour la préparation d’insectes axeniques sans administrer d’antibiotiques ou développer un régime artificiel, qui peut également être appliqué à d’autres insectes mangeurs de feuilles.

Les intestins des insectes sont colonisés par diverses bactéries qui peuvent avoir un impact profond sur les traits physiologiques de l’hôte. L’introduction d’une souche bactérienne particulière dans un insecte axenique est une méthode puissante pour vérifier la fonction microbienne intestinale et élucider les mécanismes sous-jacents aux interactions intestin microbe-hôte. L’administration d’antibiotiques ou la stérilisation des surfaces des œufs sont deux méthodes couramment utilisées pour éliminer les bactéries intestinales des insectes. Cependant, en plus des effets indésirables potentiels des antibiotiques sur les insectes, des études antérieures ont indiqué que l’alimentation en antibiotiques ne pouvait pas éliminer les bactéries intestinales. Ainsi, les régimes artificiels sans germes sont généralement utilisés pour maintenir les insectes axeniques, ce qui est un processus fastidieux et laborieux qui ne peut pas ressembler pleinement aux composants nutritionnels des aliments naturels. Décrit ici est un protocole efficace et simple pour préparer et maintenir les larves axeniques d’un coléoptère (Plagiodera versicolora). Plus précisément, les surfaces des œufs de coléoptères ont été stérilisées, après quoi des feuilles de peuplier exemptes de germes ont été utilisées pour élever des larves d’axenique. Le statut axenique des insectes a ensuite été confirmé par des essais dépendants de la culture et indépendants de la culture. Collectivement, en combinant la désinfection des œufs et la culture sans germes, une méthode efficace et pratique a été développée pour obtenir P. versicolora axenique, fournissant un outil facilement transférable pour d’autres insectes mangeurs de feuilles.

Semblable aux mammifères, le tube digestif des insectes est une cavité pour la digestion et l’absorption des aliments. La plupart des insectes abritent diverses bactéries commensales qui se développent dans leurs intestins et vivent de la nutrition fournie par les hôtes¹. La communauté commensale intestinale a un impact profond sur de multiples processus physiologiques chez les insectes, y compris la digestion et la désintoxication des aliments ^2,3,4, la nutrition et le développement ^5,6,7, la défense contre les agents pathogènes et les parasites ^8,9,10,11, la communication chimique^12,13 et les comportements^{14 ,15}. Curieusement, certains microbiotes intestinaux peuvent être facultativement pathogènes ou être manipulés par des agents pathogènes envahisseurs pour aggraver l’infection, ce qui indique que les bactéries intestinales peuvent être nocives dans certains cas 16,17,18. Les bactéries intestinales peuvent également servir de ressource microbienne pour les applications biotechniques et la lutte antiparasitaire. Par exemple, des bactéries digérant la lignocellulose provenant d’insectes phytophages et xylophages ont été utilisées pour digérer les cellules végétales afin de développer des biocarburants¹⁹. La dispersion de symbiotes intestinaux modifiés exprimant des molécules bioactives est une tactique nouvelle et prometteuse pour lutter contre les ravageurs agricoles et forestiers et les moustiques transmettant des maladies infectieuses 19,20,21, qui peut également être utilisée pour améliorer l’aptitude des insectes utiles ²². Illustrer comment une bactérie intestinale se comporte in vivo est donc considéré comme une priorité pour tirer pleinement parti de sa fonction et l’exploiter davantage pour diverses applications.

Les animaux peuvent abriter de 1 à > 1000 espèces microbiennes symbiotiques dans l’intestin¹. En conséquence, il est difficile de vérifier avec précision comment les taxons bactériens individuels ou leur assemblage se comportent à l’intérieur d’un animal, et si l’hôte ou ses partenaires microbiens déterminent une fonction spécifique. Par conséquent, la préparation de larves axeniques pour obtenir des insectes gnotobiotiques par colonisation mono- ou multi-espèces est nécessaire pour étudier la fonction bactérienne et l’interaction avec les insectes²³. À l’heure actuelle, l’administration de cocktails antibiotiques et la stérilisation de la surface des œufs d’insectes sont des méthodes courantes pour éliminer les bactéries intestinales ^14,24,25,26. Cependant, les régimes antibiotiques ne peuvent pas éliminer complètement les bactéries intestinales et ont un effet négatif sur la physiologie de l’insecte hôte^27,28. Par conséquent, l’utilisation d’insectes traités aux antibiotiques peut obscurcir les véritables capacités de certaines bactéries intestinales. Heureusement, la stérilisation de surface des œufs peut annuler ce problème^23,29, qui n’a pas ou peu d’effets sur les insectes expérimentaux. En outre, les régimes artificiels ne peuvent pas ressembler pleinement aux aliments naturels pour insectes, et le développement d’un régime artificiel est un processus coûteux et laborieux^30,31.

Le coléoptère du saule, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), est un ravageur répandu qui mange les feuilles et se nourrit principalement d’arbres saplicacés, tels que les saules (Salix) et le peuplier (Populus L.) ^32,33. Ici, le dendroctone du saule a été utilisé comme insecte mangeur de feuilles représentatif pour développer un protocole de préparation et d’élevage d’un insecte sans germes. Nous avons exploité la culture de tissus végétaux pour obtenir des feuilles de peuplier exemptes de germes pour élever des larves de P. versicolora axenic à partir d’œufs stérilisés. Le statut axenique des larves de P. versicolora a été vérifié par des tests dépendants de la culture et indépendants de la culture. Ce protocole peut maintenir des insectes axeniques qui imitent mieux la condition sauvage que l’élevage d’insectes avec un régime artificiel. Plus important encore, cette méthode est pratique à un coût très faible, ce qui augmente la faisabilité de l’obtention d’insectes axeniques pour de futures études d’interaction insecte-intestin, en particulier pour les insectes non modèles sans régime artificiel bien développé.

1. Élevage d’insectes

1. Maintenir la population de P. versicolora dans une chambre de croissance à l’état de 27 °C et 70 ± 5 % d’humidité relative avec une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité. Placez-les dans des boîtes en plastique perforées avec du papier absorbant humide carrelé et nourrissez-les de branches de peuplier frais. Vaporisez de l’eau propre sur du papier absorbant pour maintenir l’humidité et changez les branches tous les deux jours.
2. Isoler les adultes pour la ponte après la nymphose. Nourrissez-les de feuilles tendres pour obtenir plus d’œufs.
3. Recueillir les œufs nouvellement pondus (dans les 24 heures). Placez les œufs sur du papier absorbant humide pendant 60 h pour préparer les larves d’axenique.
   REMARQUE: Les œufs nouvellement pondus éclosent après environ 72 h. Le meilleur moment pour stériliser les surfaces des œufs est la veille de l’éclosion; sinon, le nombre d’œufs éclos avec succès diminuera.

2. Culture de peupliers sans germes

1. Préparer des solutions mères de Murashige et de Skoog (MS) et de 1 mg/mL d’acide acétique α-naphtalène (NAA) (voir la Table des matériaux).
2. Dans une hotte de biosécurité, ajouter 50 μL de solution mère NAA de 1 mg/mL à 500 mL de milieu MS, agiter pour bien mélanger et verser environ 50 mL par récipient de culture tissulaire et attendre la solidification.
3. Préparez des scalpels, une lampe à alcool et une pince; stériliser les scalpels et les pinces dans la flamme de la lampe à alcool dans la hotte de biosécurité.
4. Couper des segments de tige de 3 à 4 cm avec des bourgeons apicaux ou des bourgeons latéraux de plants de peuplier à environ 1 mois de croissance (semis de culture tissulaire sans germes) et les insérer dans le milieu de culture, un ou deux segments de tige par récipient.
5. Incuber ces segments de tige dans une chambre de croissance à 25 °C et 50 ± intensité lumineuse de 10 cd avec une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité pendant environ 30 jours. Utilisez les feuilles exemptes de germes pour nourrir les larves axeniques.

3. Stérilisation à la surface des œufs et élevage des larves axeniques

1. Boîtes de Petri autoclaves, pinceaux, papier filtre, eau distillée et une boîte de Petri contenant du support de gélose LB (Luria-Bertani).
2. Placez les feuilles avec des œufs adhérents dans une boîte de Pétri, retirez soigneusement les œufs des feuilles à l’aide d’une pince et transférez-les dans une autre boîte de Pétri.
   REMARQUE: Cette étape doit être effectuée très soigneusement car les œufs adhèrent aux feuilles.
3. Lavez ces œufs avec de l’éthanol à 75% pendant 8 min et répétez le lavage quatre fois avec de l’eau stérile.
4. Transférer les œufs sur un milieu de gélose LB pour préserver l’humidité pour l’éclosion.
   REMARQUE: L’utilisation d’un milieu de gélose LB peut aider à vérifier si l’œuf désinfecté est exempt de germes.
5. Placez la boîte de Pétri dans une chambre de croissance et attendez que les œufs éclosent dans les 24 heures.
6. Dans une hotte de biosécurité, carreler trois morceaux de papier filtre humide dans une boîte de Pétri, placer des feuilles de peuplier sans germes sur le papier, recueillir les larves et les placer sur les feuilles, sceller la boîte de Pétri avec un parafilm et les incuber dans une chambre de croissance à 27 °C et 70 ± 5% d’humidité relative avec une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.
   REMARQUE: Les feuilles cultivées en tissu sont délicates et peuvent perdre de l’eau rapidement. Ainsi, l’utilisation de papier filtre humide est nécessaire lors du transfert des feuilles dans la boîte de Pétri.
7. Changez les feuilles tous les deux jours.
8. Pour les groupes élevés de manière conventionnelle, transférez les œufs des feuilles dans une boîte de Pétri contenant du papier filtre humide et nourrissez ces larves avec des feuilles de peuplier exemptes de germes.

4. Vérification des larves d’axenique avec des tests dépendants de la culture

1. Sélectionnez au hasard trois larves^{de 1 ème}, 2^{e et 3e} stade parmi les groupes exempts de germes et élevés de manière conventionnelle.
2. Disséquez les larves du^3ème stade avec des ciseaux et des pinces stériles sous un stéréomicroscope et collectez leurs intestins dans des tubes de microcentrifugation. Recueillir intactes^{les larves du} 1er et du 2 e stade dans^des tubes.
   REMARQUE: Recueillir les larves entières du^1er et du 2^e stade car elles sont trop petites pour être disséquées et garder leurs intestins intacts.
3. Ajouter 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate et trois billes d’acier dans des tubes de 1,5 mL et broyer les tissus en homogénats à l’aide d’un homogénéisateur battant les billes.
4. Ajouter 100 μL de l’homogénat au milieu de la gélose LB et plaquer à l’aide d’une tige d’étalement en verre stérile.
5. Placez les plaques à 37 °C pendant 24 h et observez les colonies bactériennes.

5. Vérification des individus axeniques avec des tests indépendants de la culture

1. Extraire l’ADN total des tissus (obtenu à la section 4) à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN.
2. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nm.
3. Amplifier le gène de l’ARNr 16S bactérien à l’aide d’amorces universelles d’ARNr 16S avec PCR. Configurez le système de réaction avec 18 μL de 1,1x mélange maître PCR (voir la table des matériaux), 0,5 μL d’amorce 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL d’amorce 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') et 100 ng d’ADN modèle. Réglez les conditions de PCR à 95 °C pendant 3 min; 28 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 1 min; suivi de 72 °C pendant 10 min. Conserver les produits PCR à 4 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
4. Mélangez les produits PCR avec un colorant d’acide nucléique et analysez-les par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1% dans 1x tampon TAE. Utilisez 10 μL d’un marqueur d’ADN comme référence.
5. Observez le gel avec un transilluminateur UV et recherchez le fragment cible autour de 1 500 bp.

Les étapes de la vie de P. versicolora sont illustrées à la figure 1. Le mâle adulte est plus petit que la femelle adulte (figure 1A). Dans le champ, le coléoptère regroupe ses œufs sur une feuille; ici, quatre œufs ont été détachés d’une feuille (figure 1B). Les segments de tiges de peuplier et les semis utilisés pour l’élevage d’insectes hacheniques sont illustrés à la figure 2. L’intestin d’une larve du^3e stade est représenté à la figure 3 et les segments de l’intestin sont marqués de crochets blancs.

Bien qu’aucune colonie bactérienne n’ait été observée dans aucun groupe exempt de germes, elle a été observée dans tous les groupes élevés de façon conventionnelle (figure 4), ce qui indique que les larves d’œufs stérilisés nourris avec des feuilles de peuplier cultivées en tissu ne contiennent aucune bactérie. Les bandes PCR d’environ 1 500 pb sont apparues dans tous les groupes élevés de manière conventionnelle. En revanche, aucune bande n’a été observée dans les groupes exempts de germes ou le témoin négatif (figure 5), ce qui implique qu’aucune bactérie intestinale n’existait chez les larves d’axenique. Il n’y avait aucune différence dans le temps de développement larvaire, le taux de survie ou l’apparence entre les larves de P. versicolora exemptes de germes et élevées de manière conventionnelle. Cependant, la masse corporelle des larves exemptes de germes était légèrement supérieure à celle des larves élevées de manière conventionnelle le 5^e jour, bien que les masses deviennent similaires avant la nymphose¹⁶. Ces résultats ont confirmé la faisabilité de ce protocole pour préparer et élever les larves axeniques.

Figure 1 : Stades de vie du dendroctone du saule, Plagiodera versicolora. (A) Adultes femelles et mâles; B) les œufs; (C) 1^ère larve d’instar; D) 2^{e larve du} stade; (E) 3^{e larve} d’instar; et (F) pupe. Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Segments et semis de tiges de peuplier. (A) Segments de tige avec bourgeons apicaux; (B) les segments de tige ont poussé des racines après 10 jours; C) un semis d’un mois. Barres d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : L’intestin d’une larve du troisième stade. L’intestin antérieur, l’intestin moyen et l’intestin postérieur sont étiquetés avec des crochets. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Confirmation de l’efficacité de l’élimination des bactéries intestinales par la culture d’homogénats d’insectes intestinaux ou entiers sur des plaques de gélose LB. Aucune bactérie n’a été observée chez les larves nourries avec des feuilles de peuplier exemptes de germes, alors que des bactéries ont été observées dans des groupes élevés de manière conventionnelle. Les^larves des 1er^, 2e et^3e stades ont été utilisées pour le dosage. Trois larves ont été sélectionnées au hasard dans chaque groupe. Abréviations : GF = larves exemptes de germes; CR = larves élevées de façon conventionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Confirmation de l’efficacité de l’élimination des bactéries intestinales par pcR à l’aide d’amorces universelles du gène de l’ARNr 16S. La bande cible du gène de l’ARNr 16S est d’environ 1 500 pb. 1^ère, 2^ème et^3ème larves d’instar ont été utilisées pour le test. Aucune bande cible n’a été observée dans les groupes GF. Abréviations : NC = contrôle négatif; GF = sans germes; CR = élevé de façon conventionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La préparation de larves exemptes de germes et l’obtention de larves gnotobiotiques en réintroduisant des souches bactériennes spécifiques sont des méthodes puissantes pour élucider les mécanismes sous-jacents aux interactions hôte-microbe. Les larves nouvellement écloses obtiennent le microbiote intestinal de deux manières principales: la transmission verticale de la mère à la progéniture ou l’acquisition horizontale par les frères et sœurs et l’environnement³⁴. Le premier peut être rempli par transfert parental à la progéniture par contamination de la surface de l’œuf³⁵. Ainsi, il est hautement possible d’obtenir des larves axeniques en stérilisant les surfaces des œufs d’insectes 27,28,29. L’administration d’un cocktail de plusieurs antibiotiques est un autre moyen de développer des insectes axeniques mais présente plusieurs inconvénients²⁸. En revanche, la stérilisation de la surface des œufs suivie d’un régime axenique est meilleure pour le développement d’insectes axeniques 23,28,29.

Les œufs de la plupart des coléoptères consommateurs de feuilles sont visibles, faciles à acquérir et simples à désinfecter. C’est la principale raison pour laquelle un réactif simple (éthanol à 75 %) et un temps plus court (8 min) ont été utilisés pour la désinfection par rapport à des études similaires (par exemple, 40 min de désinfection des œufs pour plautia stali avec 75 % d’éthanol et de formaldéhyde pour obtenir des insectes axeniques; 6 min de stérilisation de la surface de l’œuf de Drosophila avec 1% de chlore actif et 75% d’éthanol; et 10 min de stérilisation à la surface de l’œuf du charançon rouge Rhynchophorus ferrugineus avec 10% d’hypochlorite de sodium solution)23,29,36. Pour les espèces d’insectes avec de minuscules œufs, l’utilisation de désinfecteurs et la durée de stérilisation doivent être optimisées car le traitement peut avoir un impact significatif sur les résultats.

Dans certains cas, des régimes artificiels sans germes sont utilisés pour l’élevage d’insectes axeniques après la stérilisation à la surface des^{œufs 29,37}. Cependant, le développement d’un régime artificiel approprié pour les insectes est un processus fastidieux et laborieux. Les nutriments contenus dans l’alimentation influencent largement la physiologie des insectes (par exemple, le temps de développement, l’immunité) et le microbiote intestinal ^6,35. Ainsi, un régime artificiel qualifié pour un insecte devrait contenir une composition nutritionnelle similaire à celle de l’aliment naturel, ce qui est difficile à réaliser, en particulier pour les insectes phytophages. Dans ce protocole, nous avons nourri les insectes avec des plantes hôtes axeniques, ce qui surmonte les lacunes d’un régime artificiel. Il est important de noter que, comme pour le peuplier utilisé ici, il n’est pas difficile non plus d’obtenir des semis cultivés en tissu à partir de nombreuses cultures économiquement importantes telles que le tabac, la pomme de terre, la tomate, le blé et le riz par stérilisation à la surface des graines ou désinfection de la section de la tige³⁸. Il convient de noter que les endophytes chez les plantes peuvent exister dans les semis cultivés en tissu³⁹ et peuvent être éliminés grâce à la technologie de culture du méristème à pointe de pousse⁴⁰. En conclusion, ce protocole fournit une nouvelle méthode pour maintenir les insectes exempts de germes, qui est un outil pratique pour faciliter les études d’interaction insecte-bactéries intestinales.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ce travail a été financé par la National Natural Science Foundation of China (31971663) et le Young Elite Scientists Sponsorship Program de CAST (2020QNRC001).