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Résumé

Ici, nous présentons la préparation d'une décoction er-xian (EXD) en quatre étapes, trempage, décoction, filtration et concentration, et démontrons l'administration d'un sérum contenant EXD préparé à des rats. Ces méthodes s'appliquent à l'étude in vivo et in vitro des décoctions à base de plantes telles que les médicaments traditionnels chinois.

Résumé

La médecine traditionnelle à base de plantes, une médecine alternative dans le milieu clinique, a reçu une attention accrue ces dernières années. Avant la livraison au corps, une procédure d'extraction supplémentaire est communément requise pour libérer les constituants actifs des herbes brutes. La décoction de l'eau est une procédure d'extraction classique qui est encore largement utilisée dans les milieux cliniques. Ici, nous proposons un protocole détaillé pour la décoction er-xian (EXD) afin d'appliquer des décoctions à base de plantes à des études expérimentales. On décrit le calcul d'une dose adaptée aux animaux, ainsi que les quatre étapes principales de l'EXD: trempage, décoction de l'eau, filtration et concentration. De plus, l'EXD contenant du sérum est introduit chez les rats comme moyen de validation in vitro . Ici, les rats ont été administrés par voie orale EXD pendant trois jours. Les échantillons de sang ont ensuite été recueillis, inactivés, centrifugés et filtrés. Le sérum, dilué avec le milieu de culture, peut être utilisé pour traiter les cellules ou les tissus dans vItro. Par exemple, EXD a été appliqué à la fois à des études in vivo et in vitro et a démontré que EXD améliore l'ostéogenèse. Ce protocole peut être utilisé comme référence pour la préparation et l'application de plantes médicinales.

Introduction

L'intérêt pour l'étude et l'application de la phytothérapie traditionnelle augmente actuellement. Par opposition aux médicaments modernes, dans lesquels les ingrédients chimiques sont définis, les formules à base de plantes contiennent des ingrédients inconnus et nécessitent des procédés d'extraction pour permettre la distribution de leurs composés actifs. Bien que de nombreuses études tentent de sélectionner un petit composé avec une structure bien connue comme représentant de l'herbe entière ou de la formule à base de plantes, ni les efficacités pharmacologiques ni les mécanismes ne peuvent être considérés comme équivalents 1 , 2 . Bien que les empreintes digitales permettent d'analyser les constituants des formules à base de plantes complexes, certains constituants ne sont toujours pas clairement analysés, ce qui entraîne un défi lors de la combinaison de tous les extraits d'étude 3 . Les interactions de nombreux constituants / extraits mesurent les effets thérapeutiques des plantes médicinales. Pour conserver cet avantage, la forme-décoct traditionnelle d'extraitIon - est encore largement utilisé dans la clinique. Comme la procédure d'extraction a un impact important sur l'efficacité thérapeutique, un protocole standard de décoction traditionnelle d'eau est nécessaire, en particulier pour les études in vivo 4 , 5 .

D'autre part, lors de l'exploration de mécanismes pharmacologiques, l'administration de décoctions à base de plantes lors d'études in vitro ou ex vivo est également un défi. La notion de sérum contenant des médicaments a d'abord été proposée par Tashino en 1988 6 . Depuis lors, un nombre croissant de chercheurs l'ont appliquée à la phytothérapie 7 , 8 , 9 . Bien que la méthode du sérum contenant du médicament présente certaines limites, telles que l'influence de certains composants du sérum, elle est encore considérée comme une méthode qui imite de près les conditions physiologiques.

La décoction er-xian a été développée au début des années 1950 pour soulager les symptômes ménopausiques 10 , 11 , 12 , 13 . Il a également été appliqué au traitement de l'anémie aplasique 14 , l'ostéoporose ménopausique 15 , 16 , 17 , l'insuffisance ovarienne prématurée 18 , le cancer du sein 19 , le cancer de l'ovaire 20 et la puberté retardée 21 . Ici, nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation à la fois de la décoction er-xian (EXD) et de son sérum contenant des médicaments. De plus, nous décrivons l'application de sérum contenant EXD et EXD aux modèles d'ostéoporose ménopausique murine.

Un EXD est composé de 9 g chacun de Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii , Radix Morindae Officinalis et Radix Angelicae Sinensis et 6 g de Cortex Phellodendri et Rhizoma Anemarrhenae par patient adulte par jour. La dose équivalente pour une souris est de 0,1418 EXD / kg / jour selon l'équation suivante 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA et dB font référence à la dose par poids corporel (mg / kg) de l'homme et de la souris, respectivement. La dose, en mg / kg, est remplacée par le nombre d'EXD / kg. La RA et la RB représentent respectivement le facteur corporel humain et le facteur corporel de la souris, qui sont proportionnels à la (surface corporelle (m 2 ) / poids corporel (kg)) 2/3 (voir tableau 1 ). WA et WB indiquent le poids corporel (kg) de l'homme et de la souris, respectivement.

Protocole

Le protocole suit les directives sur les soins des animaux de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai et est approuvé par l'expérimentation animale du Comité d'éthique animale de Shanghai.

1. Protocole I: Préparation de l'EXD

  1. Calcul
    1. Administrer l'EXD à un groupe de traitement de 10 souris de six mois de la région de contrôle d'impression féminine (ICR) (0,02 kg / souris), 5 jours par semaine pendant 12 semaines.
      REMARQUE: un total de 1,702 EXDs est nécessaire. Étant donné que les EXD sont mesurés par incréments discrets, dans la pratique réelle, administrez 2 EXD.
    2. Calculez le volume d'EXD appliqué par souris ( c'est-à-dire V = (0.1418 EXD / kg • jour) * (0.02 kg / souris) * 50 mL / EXD = 0.14 mL / mouse • day).
  2. Trempage
    1. Mettre toutes les matières premières de deux EXD ( c.-à-d., Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) et Rhizoma Anemarrhenae (12 g), 96 g au total) dans un récipient avec un couvercle.
      REMARQUE: Un récipient en céramique est recommandé.
    2. Macer les herbes brutes avec 500 ml d'eau distillée pendant 1 heure; L'eau devrait couvrir les herbes d'environ un pouce. Laissez toutes les herbes tremper soigneusement.
  3. Première décoction de l'eau
    1. Chauffer les herbes à l'aide d'un cuisinière à gaz ou d'une cuisinière à induction à haute puissance jusqu'à ce que l'eau bouillonne (environ 5 à 10 minutes, la durée dépend de la puissance de chauffage, du récipient et de la quantité d'herbes et d'eau). Mettez l'appareil hors tension pendant 2 h.
  4. Première filtration
    1. Couvrir un gobelet en verre de 500 ml avec du papier filtre ordinaire ou avec de la gaze et du coton. Déposer soigneusement la décoction dans le bécher à travers le filtre. Laissez les herbes dans le récipient.
    2. Renvoyer les résidus de fines herbesN le papier filtre sur le contenant.
  5. Deuxième décoction d'eau
    1. Ajouter de l'eau distillée au récipient avec les herbes; Laissez-le couvrir les herbes d'environ un pouce.
    2. Répétez l'étape 1.3.
  6. Deuxième filtration
    1. Répétez les étapes 1.4.1 et 1.4.2.
    2. Verser la deuxième décoction dans le même bécher. Mélanger ensemble la première et la seconde décoctions.
  7. Concentration
    1. Mettez le bécher sur un cuisinier à gaz avec de la gazine métallique sans amiante entre eux, faites chauffer la décoction à l'aide d'un mijot bas et remuez lentement et continuellement avec une tige de verre.
    2. Lorsque la décoction se réduit à 200 mL, transférez-la à un bécher de 500 ml.
    3. Répétez l'étape 1.7.1 jusqu'à ce que la décoction soit réduite à 100 mL.
  8. Stockage et administration
    1. Transférer la décoction concentrée dans une bouteille en verre stérile. Laissez refroidir à la température ambianteRe (RT). Conserver à 4 ° C si vous utilisez dans une semaine ou à -70 ° C pour un stockage à long terme.
    2. À l'aide d'une aiguille de gavage, administrer 0,14 mL / souris de la décoction à des souris ovariectomisées (OVX) une fois par jour, 5 jours par semaine pendant 12 semaines.

2. Protocole II: Préparation du Sérum contenant EXD

  1. Calcul
    1. Calculez la dose d'équivalent de rat (ROUGE) en utilisant 0,15 kg comme poids corporel de chaque rat (1 mois): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 EXD / Kg / jour.
      REMARQUE: Un total de 10 ml de sérum contenant EXD est nécessaire pour préparer 100 ml de milieu de culture (10% de sérum contenant EXD). Chaque rat devrait fournir 2 mL de sérum. Ainsi, 6 rats (une perte de 20% est pris en compte) sont nécessaires pour l'administration EXD une fois par jour pendant 3 jours. Le nombre d'EXD est: (0.111 EXD / kg • jour) * (0.15 kg / rat) * (6 rats) * (3 jours) = 0.300 EXD. Encore une fois, parce que les EXD sont mesurés par incréments discrets,Utilisez 1 EXD.
    2. Calculer le volume d'EXD appliqué par rat ( c.-à-d., V = (0.111 EXD / kg • jour) * (0.15 kg / rat) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / rat • jour).
  2. Trempage
    1. Mettez les matières premières pour 1 EXD dans un récipient avec un couvercle. Macerer les herbes brutes dans de l'eau distillée pendant 1 heure; L'eau devrait couvrir les herbes d'environ un pouce. Laissez toutes les herbes tremper soigneusement.
  3. Première décoction de l'eau
    1. Chauffer les herbes à l'aide d'une cuisinière à induction à haute puissance jusqu'à ce que l'eau bouillonne (environ 5 à 10 minutes, la durée dépend de la puissance de la chaleur, du récipient et de la quantité d'herbes et d'eau). Mettez l'alimentation hors tension à feu doux pendant 2 h.
  4. Première filtration
    1. Couvrir un gobelet en verre de 500 ml avec du papier filtre ordinaire ou avec de la gaze et du coton. Déposer soigneusement la décoction dans le bécher à travers le filtre. Laissez les herbes dans le récipient.
    2. Retournez les résidus d'herbes sur le papier filtre sur le récipient.
  5. Deuxième décoction d'eau
    1. Ajouter de l'eau distillée au récipient avec les herbes; Laissez-le couvrir les herbes d'environ un pouce.
    2. Répétez l'étape 2.4.
  6. Deuxième filtration
    1. Répétez les étapes 2.5.1 et 2.5.2.
    2. Verser la deuxième décoction dans le même bécher comme à l'étape 2.4.1 et mélanger ensemble la première et la seconde décoctions.
  7. Concentration
    1. Mettez le bécher sur une cuisinière à gaz avec une gaze de fil sans amiante entre eux, faites chauffer la décoction à l'aide d'un mijot bas et remuez lentement et continuellement avec une tige en verre.
    2. Lorsque la décoction se réduit à 100 mL, transférez-la à un bêcher de 100 ml.
    3. Répétez l'étape 2.7.1 jusqu'à ce que la décoction se réduise à 50 mL.
  8. Stockage et administration
    1. Transférer la décoction concentrée en une stérileBouteille en verre. Laissez refroidir à la RT. Conserver à 4 ° C si vous utilisez dans une semaine ou à -70 ° C pour un stockage à long terme.
    2. Administrer intragastriquement 0,83 ml / rat une fois par jour pendant 3 jours.
  9. Préparation de sérum contenant EXD
    1. Anesthésier les rats par injection intraperitoneale de 300 mL / 100 g de 80 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine à 1 h après la dernière administration d'EXD. Confirmer une anesthésie appropriée par pincement.
    2. Incitez la peau et le péritoine du rat de l'abdomen au bas du thorax à l'aide d'un scalpel (ou des ciseaux à action directe). Créez une incision de longueur et de profondeur d'environ 5 cm et 0,5 cm, respectivement. Déplacez les viscères abdominaux vers la gauche en utilisant du papier de soie.
    3. À l'aide de papier de soie, retirer le tissu conjonctif de l'aorte abdominale pour exposer clairement le vaisseau.
    4. Dessinez lentement le sang de l'aorte abdominale en utilisant une seringue de calibre 22 de 10 ml. Transférer àUn tube stérile de 15 ml après avoir retiré l'aiguille; Un rat peut produire 8 à 10 ml de sang.
      REMARQUE: Le rat doit être vivant ( c.-à-d. Avec l'impulsion de l'aorte abdominale) lorsque vous commencez le dessin du sang et que vous avez décroché après la fin du dessin.
    5. Incorporer le sang dans une position verticale pendant 30 à 60 min à la RT de la pièce. Centrifuger à 500-600 xg pendant 20 min. Placez soigneusement tout le surnageant (sérum) dans un tube stérile de 50 ml et mélangez ensemble le sérum (de différents animaux).
    6. Effectuer l'inactivation de la chaleur en incubant le sérum dans un bain d'eau à 56 ° C pendant 30 min. Filtrer le sérum en utilisant un filtre à seringue avec une membrane de polyéthersulfone hydrophile de taille de pores de 0,22 μm. Utiliser le sérum frais ou le conserver à -20 ° C.
  10. Préparation de sérum contenant un médicament témoin (utilisé dans le groupe témoin)
    1. Administrer chaque rat avec le même volume de solution saline (0,83 ml) une fois par jour pendant 3 jours. Les autres étapes sont identiques à celles de l'étape 2.9.
  11. Application
    1. Ajouter 10 ml de sérum contenant un excès de SOR ou de médicament contenant EXD à chaque 100 ml de milieu, plus 1% de pénicilline-streptomycine (PS) 23 .

Résultats

L'effet d'EXD sur la densité osseuse des souris OVX

La coloration de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) de la colonne vertébrale lombaire montre des trabécules osseuses accrues après traitement EXD in vivo ( figure 1A , panneau droit) par rapport à celles du groupe OVX ( figure 1A , panneau de gauche). La figure 1B montre les images μCT représentatives du 4ème lombaire chez les souris OVX ( Figure 1B , panneau gauche) et les souris OVX avec traitement EXD pendant 12 semaines ( Figure 1B , panneau droit). Plus d'os trabéculaires sont observés à l'intérieur de la vertèbre lombaire des souris traitées par EXD que celles des souris OVX témoins. Les données de l'imagerie μCT indiquent un volume volumique / volume tissulaire augmenté (BV / TV), le nombre trabéculaire (Tb. N) et l'épaisseur trabéculaire (Tb. Th) et une diminution de l'espace trabéculaire (Tb. Sp) du 4ème lombaire Dans les souris EXD ( figure 1C ).

L'effet d'EXD sur l'ostéogenèse des cellules souches mésenchymateuses osseuses (BMSC) à partir de souris OVX

La figure 2 représente le potentiel ostéogénique des BMSC. Les gouttelettes de graisse (astérisque, forme irrégulière d'une goutte de lipide) sont formées automatiquement lorsque les souris BMSC de souris OVX sont cultivées pendant 7 jours ( Figure 2A , panneau de gauche). Chez les souris traitées par EXD, des nodules osseux (flèche) sont formés au lieu d'une gouttelette grasse ( Figure 2B , panneau droit). Un test de phosphatase alcaline (ALP) démontre que plus de cellules ALP positives (violet) peuvent être détectées dans les bMSC traitées par EXD ( Figure 2B , panneau droit) par rapport à celles dans les BMSC à partir de souris OVX témoins ( Figure 2B , panneau de gauche).

Les changements dans l'expression des gènes entre les souris OVX et EXDS = "xref"> 24

Le regroupement hiérarchique montre que l'expression de 389 gènes révélée par microarray dans les BMSC a été repliée (> 1,5, normalisé par des souris non OVX) entre les souris traitées OVX et EXD in vivo (total: 26 991 gènes) ( Figure 3 ). Le vert indique que l'expression a été régulée à la hausse, tandis que le rouge indique que l'expression était dérégulée. Trois échantillons dans le même groupe sont regroupés en premier, indiquant les qualités fiables du profil. La figure 4 montre la voie de signalisation superposée ciblée par EXD, à la fois in vivo et in vitro .

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Figure 1: L'effet de l'EXD sur la morphologie osseuse.
( A ) coloration H & E de la 4ème section lombaire des souris traitées OVX et EXD. ( B) Images reconstructives μCT tridimensionnelles du 4ème os trabéculaire lombaire dans les souris témoins OVX et EXD traitées. ( C ) Quantification de μCT. BV: volume osseux, TV: volume tissulaire, Tb.N: nombre trabéculaire, Tb.Th: épaisseur trabéculaire, et Tb.Sp: espacement trabéculaire. Les colonnes représentent les moyennes ± SE. N = 6 par groupe. * P <0,05, ** p <0,01 EXD contre OVX (test t de Student). ( AC ) ont été modifiés de Shufen Liu et al. 24. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2: Effet d'EXD sur la différenciation BMSC.
( A ) Images de BMSC cultivées pendant 7 jours après beiNg isolé du fémur de souris traitées par OVX ou EXD. * Indique une gouttelette grasse. Une flèche indique un nodule osseux. ( B ) coloration ALP de BMSC traités par OVX et EXD cultivés pendant 7 jours (le violet représente ALP positif). ( C ) Quantification de ( B ). Les colonnes représentent le moyen ± SE à partir de trois plats (six souris) par groupe. ** p <0,01 EXD contre OVX (test t de Student). ( AC ) ont été modifiés de Shufen Liu et al. 24. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3: Effet d'EXD sur le profil d'expression génétique.
Heatmap du regroupement hiérarchique de l'expression de 389 gènes dans OMS de OVX et EXD Récolté le 7 e jour après la dissociation. L'échelle (petite image) indique que les changements de pli sont normalisés par des BMSC non OVX. La liste des gènes est fournie dans le Fichier supplémentaire 1 . La figure a été modifiée par Shufen Liu et al. 24. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 4: Effet d'EXD sur la voie de signalisation superposée dans les expériences in vivo et in vivo.
Les 10 premières voies de signalisation superposées qui sont inversées par EXD in vivo et un sérum contenant EXD in vitro basé sur la voie du KEGG. Les gènes liés aux voies sont présentés dans le Fichier supplémentaire 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Espèce Souris Rat Cochon d'Inde lapin Chat Singe Chien Humain
R 59 90 99 93 82 111 104 100

Tableau 1: facteur R dans différentes espèces.
Le facteur R dans 8 espèces qui sont couramment utilisées dans la recherche pharmacologique. Le facteur R est proportionnel à: (surface corporelle (m 2 ) / bPoids total (kg)) 2/3 .

Fichier supplémentaire 1.
Informations sur 389 gènes qui sont régulés à la hausse ou régulés à la baisse ≥1,5 fois mais sont sauvés par EXD in vivo . Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2.
Informations sur la voie de signalisation (basée sur la voie KEGG) et les gènes apparentés dans des expériences in vivo et in vitro . Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Au cours des dernières années, on a accordé plus d'attention aux médicaments à base de plantes, un type de médicament alternatif appliqué dans le milieu clinique dans le monde oriental depuis des milliers d'années. Différente du modèle de la médecine moderne "banc à lit", la médecine traditionnelle à base de plantes nécessite d'abord le modèle "lit à banc" pour expliquer leurs mécanismes. Cela peut être suivi d'une validation effectuée au niveau du banc et du traitement pour le développement de médicaments nouvellement optimisés. Jusqu'à présent, il existe plusieurs méthodes d'extraction qui ont été signalées à la version active des composants provenant de formules entières ou d'herbes. Parmi eux, l'extraction de l'eau est la plus largement utilisée.

L'extraction de l'eau des plantes médicinales comporte quatre étapes fondamentales. La première étape consiste à tremper. Une phytothérapie complexe est macérée dans l'eau pendant une période de temps, habituellement de 0,5 à 1 h. Le temps de trempage dépend de la quantité et de la propriété des herbes brutes. ÀAssurez-vous que les herbes crues sont trempées, le centre de chaque pièce ou bloc doit être trempé. Le volume d'eau dépend du volume total d'herbes. Parfois, le poids des herbes est utilisé pour déterminer la quantité d'eau nécessaire au trempage. Cependant, les densités d'herbes varient considérablement. Étant donné que le trempage consiste à macérer toutes les herbes, en facilitant la libération des composants actifs pendant les étapes suivantes, le volume d'herbes est préférable pour une utilisation comme norme de référence pour le volume d'eau. La deuxième étape consiste à cuisiner. Les processus d'ébullition et de mijot ont été développés sur des milliers d'années. La variation du temps de cuisson dépend principalement du type d'herbes, en raison de leurs différentes caractéristiques physiques, chimiques et pharmacologiques 12 . Les diaphorétiques sont suggérées pour cuire pendant une courte période de temps, habituellement moins de 20 minutes, alors que les aromatiques ne devraient être ajoutés que quelques minutes avant la première ébullition afin d'éviter les réactions volatiles. FOu des herbes toniques, une longue période de temps est nécessaire pour lixivier leurs constituants thérapeutiques. Dans ce cas, EXD est utilisé pour le traitement de l'ostéoporose post-ménopausique au cours des décennies 12 . Dans la théorie de la médecine traditionnelle chinoise, ce syndrome est considéré comme causé par une déficience liée aux rein. EXD est principalement conçu pour tonifier le rein. Par conséquent, l'EXD a été cuite pendant 2 à 3 h pour permettre à l'EXD d'exercer ses effets anti-ostéoporotiques 15 . La troisième étape est la filtration. La filtration aide à éviter que l'aiguille de gavage ne soit bouchée avec les granules de fines herbes. La quatrième étape est la concentration. Le volume d'administration du gavage doit être soigneusement pris en considération. Il a été rapporté que de grands volumes, tels que 10 mL / kg ou plus, administrés par gavage oral peuvent entraîner plusieurs problèmes liés à l'absorption, y compris la dérive rapide des composés au duodénum ou à la pneumonie par aspiration associée au reflux passif du MateriaL dans l'oesophage 25 . Ainsi, les volumes choisis pour les souris et les rats étaient d'environ 7,5 mL / kg et 5,5 mL / kg, respectivement.

Il est important de confirmer si les composants efficaces des EXD digérés et métabolisés dans le sang sont semblables à ceux de l'extrait brut. En termes de bioéquivalence EXD, Wu et al. A signalé la détermination de 7 composants dans le plasma de chien: l'épimedine A, l'épimedine B, l'épimedine C, l'icariine, le sagittatoside B, le 2-"-O-rhamnosyl icariside II et le baohuoside I 26 . Hu et al. A trouvé 21 composés dans le plasma de rat après administration orale 27 . Jusqu'à présent, l'extrait brut d'EXD n'a pas été signalé. Cependant, certains des composants efficaces testés dans le sang, tels que l'icariine et la berbérine, ont été directement appliqués aux animaux pour une observation comparative 28 .

Il existe plusieurs approches pour calculer le bioe animalDose quivalente. La méthode traditionnelle basée sur le poids corporel (mg / kg) n'est pas appropriée parce que la pharmacocinétique varie selon les différentes espèces. Le calcul basé sur la surface corporelle (mg / m 2 ), dans lequel le taux métabolique est lié à la taille individuelle de l'animal, est fréquemment utilisé 29 . L'équation appliquée ici tient compte de la surface corporelle et du poids corporel et est couramment utilisée dans la médecine traditionnelle chinoise 30 .

De nombreux types d'animaux, tels que les lapins, les cobayes, les rats et les souris, peuvent être choisis pour la préparation du sérum contenant du médicament. La même espèce que celle des cellules traitées in vitro est préférée. Dans cette étude, les rats ont été choisis parce qu'ils fournissent plus de sérum que les souris et sont plus proches des souris en termes d'espèces par rapport aux autres animaux. En outre, la dose équivalente en utilisation in vivo ou clinique est recommandée, comme le montre le protocole in vitro . Le dilutL'ion du sérum (1:10 est recommandé) n'est pas pris en compte; C'est-à-dire que 10 fois la dose équivalente n'est pas appliquée aux animaux fournis par le sérum en raison de la réaction toxique potentielle provoquée par les cellules ou les organes traités 31 . La fréquence d'administration du médicament varie d'une fois par jour pendant 3 à 14 jours à deux fois par jour (2 h entre chaque administration) 7 , 8 , 32 . Le temps de collecte se produit généralement entre les heures 1 et 2 (avant l'heure 6) après la dernière administration 33 , 34 . L'objectif est de maintenir la concentration de médicament dans le sang relativement stable et à son niveau de pointe lorsque les échantillons sont collectés 35 . Les routines d'administration peuvent inclure l'injection, l'administration de la peau ou l'inhalation, conformément aux routines d'administration in vivo .

L'inactivation de la drogue-Le sérum contenant est encore controversé. Les partisans pensent que la présence de nombreux composants actifs, tels que les hormones, les enzymes, les anticorps et les compléments dans le sérum lui-même, peut entraîner des réactions inattendues qui influent sur les résultats 36 . L'opposition croit que les composants actifs produits par les médicaments pourraient également être supprimés par le processus d'inactivation 37 . Pour équilibrer cela, les gens conçoivent le groupe témoin de sorte que le sérum provenant d'animaux traités par voie saline soit utilisé.

Il existe certaines limites au protocole. La qualité de l'extrait n'est pas évaluée avant de commencer l'expérimentation in vivo et in vitro . Deuxièmement, les antibiotiques sont utilisés dans le milieu de culture, ce qui peut provoquer des interactions herb-drogues et nécessite des tests supplémentaires. Troisièmement, le temps de trempage et de mijotine est déterminé en fonction de l'expérience tirée de la pratique clinique et de l'expérimentation animale. On peut choisir plus de périodes de temps fOu la comparaison. Les temps de trempage et de mijot peuvent être modifiés pour différentes formules à base de plantes. Le volume de décoction pour l'administration animale peut être modifié en fonction de l'espèce et de l'âge et du poids de l'animal. L'animal choisi pour la préparation du sérum contenant du médicament et pour les routines d'administration peut être changé, comme indiqué ci-dessus.

Ensemble, le protocole et les résultats fournissent un exemple pour la préparation et l'application de la décoction à base de plantes dans des études in vivo et in vitro . Dans différents cas, certains détails doivent être optimisés, y compris les périodes de traitement, les espèces et les routines d'administration, en fonction des caractéristiques à base de plantes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81573992). Nous remercions Emily K. Lo et Kathleen DiNapoli pour leur aide à l'édition de langue.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)160922EXD components
Filter paperGElifesciences99-103-952Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) miceShanghai Laboratory Animal CenterSCXK 2007-0005In vivo study
Sprague Dawley ratsShanghai Laboratory Animal CenterSCXK 2007-0005EXD-containing serum preparation
Syringe filterMilliporeSLGP033RB0.22 µm
gavage needles (10 ml)Shanghai BO Ge trade sales department59104274Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg) Fujian Gutian Pharma Co. LtdH35020148Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)Sunway Pharma Co. LtdCB07591Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture mediumGibco12800-116DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
StreptomycinSigma1277100 µg / ml
PenicillinSigma4687100 µg / ml

Références

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