草药的制备:洱西汤和含茜素的血清

在这里，我们以四个步骤 - 浸泡，煎煮，过滤和浓缩四个步骤介绍了一种呃ian汤（EXD）的制备方法，并且证明了给大鼠制备的含有EXD的血清。这些方法适用于中药等中草药的体内和体外研究。

传统草药是临床环境中的替代药物，近年来受到越来越多的关注。在运送到身体之前，通常需要额外的提取方法来从原料中释放活性成分。水煎剂是一种经典的提取方法，在临床环境中仍然广泛应用。在这里，我们提出了一个详细的呃ian汤（EXD）方案，以便将草药煎药应用于实验研究。描述了动物适当剂量的计算，以及EXD的四个主要步骤:浸泡，水煎剂，过滤和浓缩。此外，将含有血清的EXD作为体外验证手段引入大鼠。在这里，大鼠经口给予EXD三天。然后收集血液样品，灭活，离心和过滤。用培养基稀释的血清可用于治疗v。中的细胞或组织itro。例如，EXD被应用于体内和体外研究，并且表明EXD增强成骨。该方案可作为草药的制备和应用参考。

对传统草药研究和应用的兴趣目前正在增长。与现代药物相反，化学成分明确，草药配方有一些未知的成分，需要提取过程才能使其活性化合物交付。虽然许多研究尝试选择一种具有众所周知结构的小化合物作为全草药或草药配方的代表，但药理作用和机制均不能等同于^1,2 。虽然指纹图谱能够分析复方草药配方的成分，但一些成分仍未得到清晰分析，结合所有研究提取物³时会带来挑战。许多成分/提取物的相互作用介导中草药的治疗效果。为了保留这个优势，传统的提取物形式 - 煎煮离子 - 仍然广泛应用于诊所。由于提取方法对治疗效果有很大影响，因此传统水煎剂的标准方案是必要的，特别是对于体内研究^4,5 。

另一方面，当探索药理机制时，体外或体外研究中草药煎剂的施用也是一个挑战。药物血清的概念最初由Tashino于1988年提出⁶ 。从那时起，越来越多的研究人员将其应用于草药^7,8,9 。虽然含药血清的方法有一定的局限性，如血清某些成分的影响，但仍被认为是与生理条件密切相关的方法。

二十世纪五十年代初开发的二味汤是为了缓解更年期症状10,11,12,13。它也被应用于治疗再生障碍性贫血¹⁴ ，更年期骨质疏松症^15,16,17 ，早产卵巢功能衰竭¹⁸ ，乳腺癌¹⁹ ，卵巢癌²⁰和延迟青春期²¹ 。在这里，我们提出了制定呃ian汤（EXD）及其含药血清的详细方案。此外，我们描述了含有EXD和EXD的血清对鼠绝经期骨质疏松模型的应用。

一个EXD由9g Curculigo orchioides Gaertn ， Herbaa Epimedii组成 + ， 甘草和当归，每个成年患者每天6g 皮质黄柏和根瘤菌 。基于以下等式^22，小鼠的等效剂量为0.1418EXD / kg /天:dB = dA * RB / RA *（WA / WB） ^1/3 。 dA和dB分别表示人和小鼠每体重的剂量（mg / kg）。剂量（mg / kg）由EXD / kg的数量代替。 RA和RB分别代表（体表面积（m ² ）/体重（kg）） ^2/3 （ 参见表1 ）成比例的人体因子和小鼠体内因子。 WA和WB分别表示人和小鼠的体重（kg）。

该协议遵循上海中医药大学动物护理方针，经动物实验上海动物伦理委员会批准。

议定书I:准备EXD

1. 计算
   1. 将EXD给予10名6个月大的雌性印记控制区（ICR）小鼠（0.02kg /小鼠）的治疗组，每周5天，持续12周。
      注意:需要总共1.702个EXD。因为EXD是以离散的增量来衡量的，在实际中，管理2个EXD。
   2. 计算每只小鼠施用的EXD的体积（ 即 V =（0.1418EXD / kg·天）*（0.02kg /小鼠）* 50mL / EXD = 0.14mL /小鼠·天）。
2. 浸水
   1. 将两种EXD（ 即，Curculigo orchioides Gaertn （18 g）， Herbaa Epimedii （18 g））， 甘草 （18 g）， R将当归（18g）， 皮质黄柏 （12g）和黑曲霉 （12g），总共96g）放入具有盖子的容器中。
      注意:建议使用陶瓷容器。
   2. 用500毫升蒸馏水将原始草药切片1小时;水应该覆盖草药约一英寸。让所有的草药彻底浸泡。
3. 第一水煎剂
   1. 用大功率的燃气灶或电磁炉加热草药，直到水沸腾（约5-10分钟;时间间隔取决于加热功率，容器和草药和水量）。将电源降低到低炖煮2小时。
4. 先过滤
   1. 用常规滤纸或纱布和棉布覆盖500 mL玻璃烧杯。通过过滤器小心倒入烧杯中。把草药放在容器中。
   2. 返还剩余的草药残留物o把滤纸放到容器上。
5. 第二汤水
   1. 用草药将蒸馏水加入容器中;让它覆盖草药约一英寸。
   2. 重复步骤1.3。
6. 二次过滤
   1. 重复步骤1.4.1和1.4.2。
   2. 将第二汤匙倒入同一个烧杯中。将第一和第二汤匙混合在一起。
7. 浓度
   1. 将烧杯放在燃气灶之间，用无石棉丝网将它们之间加热，用低温炖煮，并用玻璃棒慢慢地连续搅拌。
   2. 当煎剂减少到200 mL时，将其转移到500 mL烧杯中。
   3. 重复步骤1.7.1，直到煎剂减至100 mL。
8. 储存和管理
   1. 将浓缩汤汁转移到无菌玻璃瓶中。让它凉快到室温re（RT）。如果在一周内或-70°C使用长期储存，请在4°C储存。
   2. 使用管饲针，向卵巢切除（OVX）小鼠施用0.14mL /小鼠煎剂一天，每周5天，持续12周。

2.议定书二:含EXD的血清的制备

1. 计算
   1. 计算每只大鼠（1个月大）体重0.15 kg的大鼠当量（RED）:dB =（1/60）*（90/100）*（60 / 0.15） ^1/3 = 0.111 EXD / kg /天。
      注意:需要总共10ml的含EXD血清以制备100mL培养基（含10％含EXD的血清）。预计每只大鼠提供2mL的血清。因此，每天一次，需要6只大鼠（20％的损失被考虑在内）3天。 EXD的数量是:（0.111EXD / kg•天）*（0.15kg /大鼠）*（6只大鼠）*（3天）= 0.300EXD。再次，因为EXD以离散增量测量，使用1 EXD。
   2. 计算每只大鼠施用的EXD体积（ 即 V =（0.111EXD / kg·天）*（0.15kg /大鼠）*（50mL / EXD）= 0.83mL /大鼠·天）。
2. 浸水
   1. 将1 EXD的原料放入带盖的容器中。将原料在蒸馏水中浸泡1小时;水应该覆盖草药约一英寸。让所有的草药彻底浸泡。
3. 第一水煎剂
   1. 用高功率的电磁炉加热草药，直到水沸腾（约5 - 10分钟;时间间隔取决于热量，容器和草药和水量）。将电源切换到低炖煮2小时。
4. 先过滤
   1. 用常规滤纸或纱布和棉布覆盖500 mL玻璃烧杯。通过过滤器小心倒入烧杯中。把草药放在容器中。
   2. 将滤纸上的草药残渣送回容器。
5. 第二汤水
   1. 用草药将蒸馏水加入容器中;让它覆盖草药约一英寸。
   2. 重复步骤2.4。
6. 二次过滤
   1. 重复步骤2.5.1和2.5.2。
   2. 将第二汤匙倒入与步骤2.4.1中相同的烧杯中，并将第一和第二汤匙混合在一起。
7. 浓度
   1. 将烧杯放在燃气灶之间，用无石棉丝网将它们之间加热，并用低温炖煮，并用玻璃棒慢慢连续搅拌。
   2. 当煎剂降至100 mL时，将其转移到100 mL烧杯中。
   3. 重复步骤2.7.1，直到煎煮至50 mL。
8. 储存和管理
   1. 将浓缩汤汁转移至灭菌剂中ile玻璃瓶。让它凉爽到RT。如果在一周内或-70°C使用长期储存，请在4°C储存。
   2. 腹腔内给予0.83mL /天，每天一次，持续3天。
9. 含EXD的血清制剂
   1. 在最后一次给药后1小时腹腔注射300 mL / 100g 80 mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪麻醉麻醉大鼠。通过脚趾捏捏确认适当的麻醉。
   2. 使用手术刀（或直接操作的剪刀）将大鼠的皮肤和腹膜从腹部切除到胸部的底部。创建长度和深度分别为5厘米和0.5厘米的切口。使用薄纸将腹部内脏移至左侧。
   3. 使用薄纸，去除腹主动脉的结缔组织，以清楚地暴露血管。
   4. 使用10 mL，22号注射器从腹主动脉缓慢吸取血液。转移到取出针后取出15 mL无菌管;一只大鼠可以产生8-10毫升血液。
      注意:开始抽血时，大鼠应该活着（ 即腹部主动脉脉动），完成后，死亡。
   5. 在室温下将血液凝固在直立位置30-60分钟。以500-600 xg离心20分钟。将所有上清液（血清）小心地放入一个50mL无菌管中，并将所有血清（来自不同动物）混合在一起。
   6. 通过在56℃水浴中孵育血清30分钟来进行热灭活。使用具有0.22μm孔径的亲水性聚醚砜膜的注射器过滤器过滤血清。使用新鲜血清或将其储存在-20°C。
10. 对照药物血清制剂（用于对照组）
    1. 用相同体积的盐水（0.83mL）每天施用每只大鼠一次，持续3天。其他步骤与步骤2.9相同。
11. 应用
    1. 向每100mL培养基加上1％的青霉素 - 链霉素（PS） ²³加入含有EXD的血清或含药血清。

EXD对OVX小鼠骨密度的影响

腰椎椎体部分的苏木精和伊红（H＆E）染色显示体外EXD处理后增加的骨小梁（ 图1A ，右图）与OVX组相比（ 图1A ，左图）。 图1B显示OVX小鼠（ 图1B ，左图）和EXD处理12周的OVX小鼠的代表性μCT图像（ 图1B ，右图）。在EXD治疗的小鼠的腰椎椎弓根内观察到的小骨小于对照OVX小鼠。来自μCT成像的数据表明第4腰椎的骨量/组织体积（BV / TV），小梁数（Tb.N）和小梁厚度（Tb Th）和骨小梁间距（Tb.Sp）减小在EXD小鼠中（ 图1C ）。

EXD对来自OVX小鼠的骨间充质干细胞（bMSCs）的骨形成的影响

图2表示骨髓基质干细胞的成骨潜力。 OVX小鼠的骨髓基质干细胞培养7天后，自动形成脂滴（星号，脂滴的不规则形状）（ 图2A ，左图）。在EXD处理的小鼠中，形成骨结节（箭头）代替脂肪液滴（ 图2B ，右图）。碱性磷酸酶（ALP）测定显示与来自对照OVX小鼠的bMSCs相比，在EXD处理的骨髓基质干细胞（ 图2B ，右图）中可以检测到更多的ALP阳性细胞（紫色）（ 图2B ，左图）。

OVX和EXD小鼠之间基因表达的变化S = "外部参照"> 24

分层聚类表明，OVX和EXD处理的小鼠体内的 bMSCs中微阵列揭示的389个基因的表达变化（大于1.5，非OVX小鼠标准化）（总共26,991个基因）（ 图3 ）。绿色表示表达式被上调，而红色表示表达式被下调。同一组中的三个样品首先聚集在一起，表明轮廓的可靠性质。 图4显示了体内和体外 EXD靶向的重叠信号传导途径。

图1:EXD对骨形态的影响。
（ A ）OVX和EXD处理的小鼠的腰椎^第 4部分的H＆E染色。 （ 第 4小梁骨的三维μCT重建图像。 （ C ）μCT的定量。 BV:骨量，TV:组织体积，Tb.N:小梁数，Tb.Th:小梁厚度，Tb.Sp:小梁间距。列表示平均值±SE。每组n = 6。 * p <0.05，** p <0.01 EXD与OVX（学生t检验）。 （ AC ）已从Shufen Liu 等人修改请点击此处查看此图的较大版本。

图2:EXD对bMSC分化的影响。
（ A ）biC培养7天后的图像从OVX或EXD处理的小鼠的股骨中分离出来。 *表示脂肪液滴。箭头表示骨结节。 （ B ）培养7天的OVX和EXD处理的骨髓基质干细胞的ALP染色（紫色代表ALP阳性）。 （ C ）（ B ）的定量。列表示每组三个皿（六只小鼠）的平均值±SE。 ** p <0.01 EXD与OVX（学生t检验）。 （ AC ）已从Shufen Liu 等人修改请点击此处查看此图的较大版本。

图3:EXD对基因表达谱的影响。
OVX和EXD骨髓基质干细胞中389个基因表达分层聚类的热图在分离后第七天收获。比例（小图像）表示由非OVX骨髓基质干细胞标准化的倍数变化。基因列表在补充文件1中提供。该图已经从Shufen Liu 等人修改请点击此处查看此图的较大版本。

图4:EXD对体内和体外实验中重叠信号通路的影响。
基于KEGG途径体外 EXD 体外和EXD的血清逆转的前10个重叠信号通路。与通路相关的基因见补充文件2 。/files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg"target ="_ blank">请点击此处查看此图的较大版本。

表1:不同物种的R因子。
8种通常用于药理研究的R因子。 R因子与（体表面积（m ² ）/ b成比例）重量（kg）） ^2/3 。

补充文件1。
关于389个上调或下调≥1.5倍但由体外 EXD拯救的基因的信息。 请点击这里下载此文件。

补充文件2。
关于信号通路（基于KEGG途径）和相关基因在体内和体外实验中的信息。 请点击这里下载此文件。

近年来，更多的关注草药，一种在东方世界临床环境中应用了数千年的替代药物。传统草药与现代医学的"长凳式"床不同，首先需要"床到凳"的模式来解释他们的机制。这可以在后台进行验证，并进行开发新优化药物的处理。到目前为止，已经报道了从整个配方或草药释放活性成分的几种提取方法。其中，水提取是最广泛使用的。

中草药的提取有四个基本步骤。第一步是浸泡。复杂的草药在水中浸泡一段时间，通常为0.5至1小时。浸泡时间取决于原料的数量和性质。至确保原料彻底浸泡，每片或块的中心应浸泡。水的体积取决于草药的总体积。有时，草药的重量用于确定浸泡需要多少水。然而，草药密度差异很大。由于浸泡的目的是浸渍所有草药，因此在以下步骤中促进活性组分的释放，草药的体积优选用作水体积的参考标准。第二步是做饭。煮沸和煨煮的过程已经发展了数千年。烹饪时间的变化主要取决于草药的种类，因为它们的物理，化学和药理特性不同¹² 。建议将diaphoretics短时间内烹饪，通常少于20分钟，而在第一次煮沸前只应加入芳香剂几分钟，以避免挥发性反应。 F或补药，需要很长时间才能浸出其治疗成分。在这种情况下，EXD用于治疗绝经后骨质疏松症几十年。在中医理论中，这种综合征被认为是由肾相关的缺乏引起的。 EXD主要用于补肾。因此，EXD煮熟2 - 3小时，让EXD发挥其抗骨质疏松作用¹⁵ 。第三步是过滤。过滤有助于防止管饲针被草药颗粒堵塞。第四步是集中。应慎重考虑管饲管理量。据报道，通过口服管饲法施用的大量体积（例如10mL / kg或更多）可导致与吸收相关的若干问题，包括将化合物快速分流至十二指肠或与被动反流相关的吸入性肺炎本草进入食道²⁵ 。因此，为小鼠和大鼠选择的体积分别为约7.5mL / kg和5.5mL / kg。

重要的是确认血液中消化和代谢的EXD的有效成分是否与原始提取物相似。在EXD生物等效性方面，Wu et al。报道了狗血浆中7种成分的测定:依马西林A，依马西林B，依马西林C，淫羊藿苷，箭头糖苷B，2"-O-鼠李糖苷II和宝果苷I ²⁶ 。胡等口服后大鼠血浆中发现21种化合物²⁷ 。迄今为止，EXD的原始提取物尚未报道。然而，在血液中测试的一些有效成分，如淫羊藿苷和小檗碱已被直接应用于动物进行比较观察²⁸ 。

有多种方法来计算动物生物等价剂量。基于体重（mg / kg）的传统方法是不合适的，因为不同物种的药代动力学变化不同。经常使用基于身体表面积（mg / m ² ）的计算，其中代谢率与个体动物大小有关。这里应用的方程式考虑了体表面积和体重，在中医药中普遍使用³⁰ 。

可以选择许多种类的动物，例如兔，豚鼠，大鼠和小鼠，用于含药血清制剂。与体外处理的细胞相同的物种是优选的。在这项研究中，选择大鼠，因为它们比小鼠提供更多的血清，并且与其他动物相比，它们与物种相比更接近于小鼠。此外，推荐体内或临床使用的剂量当量，如体外方案所示。稀释不考虑血清离子（推荐1:10）也就是说，由于由处理的细胞或器官引起的潜在的毒性反应，等效剂量的10倍不适用于血清提供的动物。药物管理频率每天一次为3至14天，每天两次（每次给药之间2小时）为7,8,32。收集时间通常在最后一次管理^33,34之后的小时1和2（6小时之前）之间发生。目的是在采集样品时，将血液中的药物浓度保持在相对稳定和峰值水平。根据体内给药程序，给药程序可以包括注射，皮肤给药或吸入。

药物 -含血清仍有争议。支持者认为许多活性成分的存在，如激素，酶，抗体和血清本身的补体可能会导致意想不到的反应，影响结果³⁶ 。反对派认为，药物产生的活性成分也可能被灭活过程³⁷除去。为了平衡这一点，人们设计对照组，使用来自盐水处理的动物的血清。

协议有一些限制。在开始体内和体外实验之前，不评估提取物的质量。其次，在培养基中使用抗生素，这可能导致草药相互作用，需要进一步的检测。第三，浸泡和煨时间是根据临床实践和动物实验获得的经验来确定的。更多的时间可以选择f或比较。浸泡和煨时间可以修改为不同的草药配方。可以根据动物的种类，年龄和体重来改变动物给药的煎煮体积。选择用于制备含药血清和用于给药程序的动物可以改变，如上所述。

总而言之，方案和结果为在体内和体外研究中草药煎剂的制备和应用提供了一个例子。在不同的情况下，一些细节必须优化，包括治疗期，物种和管理程序，基于草药特征。

作者宣称他们没有竞争的经济利益。

这项工作得到了中国国家自然科学基金（81573992）的支持。我们感谢Emily K. Lo和Kathleen DiNapoli的语言编辑协助。