Los autores desean agradecer a Julia Hatler y Martin Ramsden (R &amp; D Systems) útil para el debate y la revisión del manuscrito.

1. La inducción de EMT <ol><li> Medios de cultivo caliente a 37 ° C en un baño de agua. El medio de cultivo utilizado es el mismo que los medios utilizados para el cultivo estándar de las células de interés. Por ejemplo, la línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 se cultiva en F12 de Kaighn enriquecido con suero bovino fetal al 10% y glutamina 2 mM. </li><li> Células Cosecha de interés usando una solución de disociación (por ejemplo TrypLE Express). </li><li> Suspender las células en medios de cultivo pre-calentado en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 400 xg durante 5 min. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante mediante el vertido en un contenedor de residuos. </li><li> Suspender el sedimento de células en medios de cultivo pre-calentado. </li><li> Contar las células viables usando azul de tripano. Extraiga una muestra de la suspensión de células y se diluye en el 0,4% de solución de azul tripán. Ponga 10 l de la muestra diluida en un hemocitómetro y contar las células viables (células que no vuelven azules). Utilizar los recuentos de células para determinar la celda density en su solución. </li><li> Placa sobre células de cultivo de tejidos tratados placas o frascos a 0,9-1,0 x 10 4 células por cm 2. Por ejemplo, 0,5 x 10 6 células en placas en una placa de 100 mm en un medio de cultivo que contiene Suplemento 1X EMT medio inductor (6 ml de medio por placa de 100 mm). </li><li> Cultura células chapada en un C / 5% de CO 2 incubadora a 37 °. Monitorear la morfología celular diaria. </li><li> Tres días después de la siembra, retire y vuelva a colocar los medios de comunicación con los medios de la cultura pre-calentado fresco que contiene Suplemento 1X EMT Inducir Media. Continuar a la cultura en un C / 5% de CO 2 incubadora a 37 °. </li><li> Cinco días después de la siembra, las células están listas para el análisis. La morfología celular se visualiza mediante microscopía de luz invertida. </li></ol> 2. Análisis de la expresión de la proteína por inmunocitoquímica <ol><li> Preparar cubreobjetos estériles 12 mm para una placa de 24 pocillos mediante la colocación de cubreobjetos en una placa de Petri que contiene etanol al 95%. Retire suavemente cubreobjetos de etanol nosotrosing una aguja y pinzas curvas y esterilizar llama. Coloque el cubreobjetos estéril en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Repita con el resto cubreobjetos. </li><li> Preparar la suspensión de células como se describe en la sección 1,1 - 1,7. </li><li> Placa 1.6 x 10 4 células / pocillo en 0,5 ml de medios de cultivo pre-calentado que contiene Suplemento 1X EMT Inducir Media. </li><li> Crecer y alimentar a las células como se describe en las secciones 1.9 a 1.11. </li><li> Cinco días después de la siembra, retirar el medio y fijar las células con 300 l / pocillo de 4% de paraformaldehído en 1X solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Quite el fijador y enjuagar las células 2 veces con 1X PBS, 500 l / pocillo. </li><li> Se incuban las células en 400 l / pocillo de tampón de bloqueo (1X PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA), 10% de suero normal de burro, y 0,3% de Triton X-100) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Incubar en anticuerpo primario a los fabricantes de concentración recomendada en 400 l / pocillo de tampón de bloqueo durante 3 h a temperatur habitaciónE o durante la noche a 4 ° C. Cuando se utiliza un anticuerpo primario conjugado directamente a un fluorocromo, incubar las muestras en la oscuridad. </li><li> Lavar las células tres veces en 500 l / pocillo de 1X PBS que contenía 0,1% de BSA durante 5 minutos cada lavado. Cuando se utiliza un anticuerpo primario conjugado directamente a un fluorocromo, vaya directamente al paso 2.12. </li><li> Se incuban las células en anticuerpo secundario a la concentración recomendada por el fabricante en 400 l / pocillo de 1X PBS que contenía 1% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Lavar las células tres veces en 500 l / pocillo de 1X PBS que contenía 0,1% de BSA durante 5 minutos cada lavado. </li><li> Si se desea, los núcleos con solución DAPI. </li><li> Enjuague las células en agua desionizada y se montan los cubreobjetos boca abajo sobre una diapositiva utilizando medio de montaje. </li></ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

R &amp; D Systems, Inc. es una empresa pública con fines de lucro. Producción y acceso gratuito a este artículo es patrocinado por R &amp; D Systems, Inc.

Los métodos anteriores para la inducción de EMT han utilizado generalmente la estimulación de TGF-β o modificación genética. Aunque se ha demostrado que solo el TGF-β para inducir EMT en algunos tipos de células, ahora se ha demostrado que el TGF-β es necesario para EMT, pero no es suficiente en todos los tipos de células 6,14. Uso de modificación genética para la inducción de EMT es mucho tiempo y mano de obra intensiva. El método descrito aquí usa una combinación de factores que incluyen, E-cadherina anti-humano, sFRP-1 anti-humano, DKK-1 anti-humano, Wnt-5a humana recombinante, y TGF-β1 humano recombinante para inducir de forma fiable de EMT. Esta combinación de factores ha sido diseñado para bloquear la adhesión basada E-cadherina, un paso crítico para la EMT de inducción 4, y mejorar la señalización de Wnt mediante la adición de la proteína Wnt-5 bis, así como el uso de anticuerpos que bloquean a los inhibidores de Wnt, sFRP-1 y DKK -1. Wnt y la señalización de TGF-β se ha demostrado que actuar en un bucle autocrino para inducir y mantener la estadística de células mesenquimalese 6. Este método de inducción evita la manipulación genética y es más eficaz que el uso de TGF-β solo. Es importante destacar que somos capaces de observar la inducción de la EMT en tipos de células, incluidas las células MCF7 y PANC-1, que han sido previamente demostrado no responder exclusivamente a la estimulación del TGF-β (Figura 5) 14. Las células tratadas con el espectáculo Suplemento EMT Inducir Medios morfología fusiforme menos compacto y una mayor (Figura 1). Además, hay una disminución en la superficie de la E-cadherina expresión concurrente con un aumento en la expresión de fibronectina, que son características de la EMT (Figuras 2 y 3). Marcadores adicionales mesenquimales tales como vimentina y caracol también están regulados por incremento en las células inducidas EMT como comparación con los controles no inducidas (Figura 4). El aumento de las capacidades de migración y la invasión son las principales características funcionales de las células mesenquimales. En in vitro </em&gt; Ensayos de migración y la invasión, las células tratadas con el Suplemento EMT Inducir Medios demostraron un aumento significativo de la capacidad de migrar e invadir (Figura 6). Este método simple para la inducción de EMT es útil para el estudio de la señalización de EMT como se demuestra usando los datos de expresión matriz de anticuerpos mostrados en la Figura 7. Diferentes tipos de células se pueden comparar de pre-y post-inducción de EMT para obtener firmas de expresión comunes asociados con la EMT, tales como el aumento de CREB fosforilado y ERK1 / 2 visto en tanto MCF7 y células inducida EMT-A549. S133 fosforilación de CREB estimula la unión de ADN y se ha demostrado que actúa aguas abajo de TGF-β1 inducida EMT-15. ERK1 / 2 fosforilación también se ha demostrado que actúa aguas abajo de TGF-β1 inducida EMT-16. Las diferencias en las vías de señalización entre los tipos de células también pueden ser aclarados como se ha visto con el aumento de la fosforilación de GSK-3β en las células A549 frente a p70S6K fosforilación en células MCF7. La fosforilación de GSK-3β en la serina 9 que disminuye la función, y GSK-3β se ha demostrado que inhiben el factor de transcripción pro-EMT, caracol 17. En contraste, p70S6K induce la actividad de caracol y su fosforilación está asociada con la activación de esta proteína 18. En general, la inducción sencillo y fiable de la EMT, particularmente en las células mostrados anteriormente no responder únicamente a TGF-β, es útil para la comprensión de la biología de la EMT, la identificación de firmas de expresión comunes para su uso como marcadores de pronóstico, y el desarrollo y la evaluación de nuevas terapias para el cáncer y enfermedad fibrótica.

Transición epitelial a mesenquimal (EMT) es el proceso por el cual una célula epitelial polarizada se somete a una variedad de cambios resultantes en una, de células mesenquimales similar a fibroblastos muy móviles. Este proceso se produce, en parte, a través de los cambios de expresión de genes y la degradación de uniones adherentes, lo que resulta en una mayor capacidad para migrar e invadir. Fisiológicamente, la EMT desempeña un papel importante durante el desarrollo embrionario y la curación de heridas. La pérdida de un control adecuado de la EMT puede conducir a la fibrosis y la metástasis de carcinomas de 1,2. La reducción de la E-cadherina en la superficie de las células epiteliales es un paso crítico en la progresión de una célula a través de EMT 3,4. E-cadherina es una proteína transmembrana de paso único que interactúa directamente con las proteínas cadherina en células adyacentes. Además de su papel en la adhesión celular, E-cadherina influencias de señalización celular a través de interacciones entre la cola citoplasmática de un E-cadherinada variedad de proteínas reguladoras, en particular β-catenina. β-catenina desempeña un papel en la estabilización de las uniones adherentes. Durante la señalización canónica de Wnt, β-catenina se libera de E-cadherina y transloca al núcleo donde actúa como un factor de transcripción aguas abajo en la vía de Wnt 3,4,5. En el núcleo, β-catenina se ha demostrado que aumenta la transcripción de varios factores relacionados con el EMT-incluyendo Twist, Slug, fibronectina, y una variedad de metaloproteasas de la matriz 3,6. Además de Wnt, la señalización de TGF-β se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la inducción de EMT tanto durante el desarrollo normal y en estados de enfermedad 7,8,9. TGF-β está implicado en la EMT que se produce durante la formación del paladar y en el corazón en desarrollo 10. También se ha implicado en la fibrosis y en la progresión del cáncer a la metástasis 7. El procedimiento descrito aquí PRovides inducción consistente de EMT en una variedad de tipos de células, sin la necesidad de la manipulación genética. Este procedimiento utiliza un cóctel de E-cadherina, DKK-1 anticuerpos bloqueantes y Wnt-5a y proteínas recombinantes TGF-β1 sFRP-1, y. Este cóctel está diseñado para bloquear E-cadherina basado en la adhesión al tiempo que mejora Wnt y la señalización de TGF-β. La capacidad para robusta inducción de EMT es crítica para la comprensión de la biología de este proceso y cómo manipular con fines terapéuticos. Marcadores comunes actuales de EMT, E-cadherina (downregulated en EMT) y vimentina (upregulated en EMT), se pueden encontrar co-expresada en cánceres y por lo tanto no proporcionan los mejores marcadores de diagnóstico de potenciales células metastásicas 12. Es importante destacar que el análisis de una variedad de tipos de células que han sido objeto de EMT es útil para desarrollar comunes firmas de expresión de genes que se pueden utilizar con fines de diagnóstico en el cáncer y la fibrosis 11. Además, estudios recientes han demostrado que EMT puede desempeñar un papel en la formación de las células madre de cáncer, lo que sugiere que las células que han sido objeto de EMT pueden ser útiles para el cribado de fármacos para identificar compuestos que pueden apuntar estas células 13.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

Transición epitelial a mesenquimal (EMT) es esencial para la morfogénesis durante el desarrollo adecuado. Regulación deficiente de este proceso ha sido implicado como un acontecimiento clave en la fibrosis y la progresión de los carcinomas a un estado metastásico. La comprensión de los procesos que subyacen a la EMT es imprescindible para el diagnóstico precoz y el control clínico de estos estados de enfermedad. Inducción fiable de EMT in vitro es una herramienta útil para el descubrimiento de fármacos, así como para identificar comunes firmas de expresión genética con fines de diagnóstico. Aquí se demuestra un método directo para la inducción de EMT en una variedad de tipos de células. También se incluyen los métodos para el análisis de las células pre-y post-EMT de inducción por inmunocitoquímica. Además, se demuestra la eficacia de este método a través del análisis conjunto basado en anticuerpos y ensayos de migración / invasión.

. La EMT que inducen condiciones de cultivo descritas aquí proporcionan un método robusto para la inducción de EMT en una variedad de tipos de células Figuras 1 y 2 demuestran la morfología de los niveles de expresión y marcador para 4 diferentes líneas celulares humanas: células de glioblastoma T98G, células HT29 de adenocarcinoma de colon , células de carcinoma de pulmón A549, y MCF10A células epiteliales mamarias. Las células que fueron tratados con el suplemento de EMT medio inductor de cambiar desde una morfología epitelial clásica (figuras 1A - 1D) a una mesenquimal, la morfología en forma de huso (Figuras 1E - 1H). Las células inducidas EMT parecían menos densamente poblado en colonias cerradas en comparación con las células no inducidas. Muestras no inducidas MCF10A contenían racimos apretados rodeadas por las células de manera más flexible para llevar. Estos racimos apretados eran la E-cadherina positivo (Figura 2D) y desaparecieron tras el tratamiento con el inductor de EMT Medios Supplement (Figura 2H). EMT también fue evaluada por la regulación a la baja de marcadores epiteliales y la regulación positiva de los marcadores mesenquimales. La regulación a la baja de la expresión de E-cadherina se observa típicamente después de la inducción de EMT en diferentes tipos de células 3,4 La figura 2 muestra la expresión en superficie de la E-cadherina en la mayoría de las células no tratadas (Figuras 2A - 2D, rojo). En comparación con su ausencia después de inducción de EMT (Figuras 2E - 2H; rojo). Una línea celular, T98G, se encontró que tienen un muy bajo nivel basal de la E-cadherina antes de la inducción de EMT, que impidió su análisis. Upregulation del marcador mesenquimal, fibronectina, también fue visible después de la inducción con el Suplemento EMT medio inductor (Figuras 2A - 2D frente Figuras 2E - 2H; verde). Los niveles de expresión de E-cadherina y fibronectina vistos por inmunocitoquímicase confirmaron adicionalmente a través de Western Blot de lisados ​​de células totales (Figura 3). El western blot confirmó regulación a la baja de la E-cadherina y la regulación positiva de la expresión de fibronectina visto por inmunocitoquímica. Las bandas se cuantificaron utilizando densitometría y se normalizaron a GAPDH para determinar el cambio veces en relación después de la inducción de EMT. Niveles de E-cadherina se redujeron 6,4 y 3,4 veces en la A549 y células MCF10A, respectivamente. Niveles de fibronectina se incrementaron 4,6, 4,1, y 2,3 veces en T98G, A549, y células MCF10A, respectivamente. Aunque la transferencia de western no muestra una reducción significativa de los niveles de proteína E-cadherina en células HT29 de inducción después de la EMT, los resultados de inmunocitoquímica demostraron una reducción en la expresión en la superficie de la E-cadherina (Figura 2B frente 2F), que no es capaz de distinguirse en Western Blot de lisados ​​de células totales. A fin de evaluar el estado de EMT, conocido marcador adicionalSe analizaron s para EMT pre y post-inducción de la EMT. En consonancia con los resultados anteriores, la E-cadherina se downregulated en todas las líneas celulares examinadas, lo que indica que la EMT fue inducida. Además, los marcadores mesenquimales, vimentina y caracol, se upregulated en el A549, T98G, y células MCF10A después del tratamiento con suplemento de EMT medio inductor (Figura 4). La línea de células HT29 no mostró expresión de estos marcadores mesenquimales ya sea con o sin la inducción de EMT (datos no presentados), lo que puede indicar que estas células utilizan vías alternativas para la inducción de EMT. Aunque el TGF-β es suficiente para inducir la EMT en cierta célula de contextos de 7,8,9, otros tipos de células no responden únicamente a la adición de TGF-β 14. MCF7 células de cáncer de mama humano y PANC-1 en las células de carcinoma de páncreas humanos son a la vez informaron a no responder a TGF-β señalización solo 14. Para determinar si ambas líneas podrían someterse a EMT en vitrO, las células se cultivaron en presencia del suplemento de medio inductor de EMT. Las células fueron estimuladas con TGF-β1 solo recombinante, en la concentración en el Suplemento medio inductor de EMT. Estas células conservan su morfología epitelial, que consiste en colonias apretados de células (datos no presentados) y de superficie los niveles E-cadherina fueron similares a los observados en las células control (Figuras 5C y 5D frente a las figuras 5A y 5B). En contraste, las células estimuladas con el Suplemento EMT Inducir medios mostraron una disminución drástica de los niveles superficiales E-cadherina (Figuras 5E y 5F). Estas células también obtienen una morfología más mesenquimal, como las células llegaron a ser menos compacta y más de tipo huso (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que el método de EMT inducir descrito aquí es capaz de promover la morfología de EMT y cambios en la expresión de marcadores en células típicamente resistentes a TGF-β-iEMT nduced. Además de los cambios en la expresión del marcador, otra característica de las células mesenquimales es su capacidad para migrar e invadir. La migración y la invasión de células cultivadas con o sin el suplemento de EMT medio inductor se analizaron usando el ensayo de invasión así BME de la célula 96 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (50.000 células / pocillo) que contiene insertos de filtro con 8,0 m poros. Después de 48 h, la migración se evaluó por tinción de calceína AM de las células que habían migrado a través del filtro. Cada muestra se ensayó por triplicado dos veces con resultados similares. Los resultados representativos de un experimento se muestran en la Figura 6A. Aumentos estadísticamente significativos (p-valor &lt;0,003) en la migración celular se observó tanto con A549 y células PANC-1 después de la inducción de EMT. Para evaluar la capacidad de estas células para invadir (es decir, migrar a través de la matriz extracelular), el mismo ensayo fuerealizado con un filtro de extracto recubierto de la membrana basal. Células inducida EMT-mostraron un (valor P &lt;0,001) aumento estadísticamente significativo en la capacidad de invasión en comparación con las células no tratadas como se ve en la Figura 6B. La inducción robusta de EMT es útil para el análisis de los cambios de expresión génica y de señalización que tienen lugar en estas células. Matriz de análisis basados ​​en anticuerpos utilizando lisados ​​de células tanto tratados y no tratados es un método para analizar los niveles de expresión de una variedad de moléculas en una sola muestra. A modo de ejemplo, se analizaron los niveles de miembros de la familia MAPK fosforilada en lisados ​​de un-inducido y EMT inducida MCF7 y células A549 utilizando el Kit de array Proteoma Humano Profiler fosfo-MAPK. La matriz se ejecutó dos veces a partir de tratamientos de EMT-inducción independientes con resultados similares. Figura 7 muestra los datos representativos de una matriz. Ambos tipos de células mostraron aumento de la fosforilación de CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204), y ERK2 (T185/Y187) en células inducidas-EMT en comparación con los controles. Se observaron diferencias en los eventos de señalización entre los dos tipos de células así. Células A549 mostraron un aumento en GSK-3 β (S9) la fosforilación, mientras que las células MCF7 mostraron aumento de la p70S6K (T421/S424) fosforilación. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 1. Mesenquimales morfología de inducción después de la estimulación con el Suplemento EMT Inducir Media (A - D). Morfología epitelial en los cuatro tipos de células indicó tras el cultivo durante 5 días en medio de cultivo estándar sin el Suplemento EMT medio inductor (E - H). Morfología mesenquimales en el cuatro tipos de células indicaron cultivadas con el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 2. Regulación a la baja de la expresión de marcadores epiteliales y la regulación positiva de la expresión de marcadores mesenquimales en células inducidas-EMT. Las células se tiñeron por inmunofluorescencia para detectar la expresión del marcador epitelial, E-cadherina (rojo), y el marcador mesenquimal, fibronectina (verde). (Un - D) Control de las células cultivadas sin el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días (E - H.) Las células cultivadas con el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días. Todas las células se contratiñeron con DAPI (azul). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Confirmación de expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales con un western blot<html> . estudio de carácter de transferencia de Western de lisados ​​de células totales de los cuatro tipos de células indicado, se trató con (EMT) o sin (-) el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días. Bandas para la E-cadherina, fibronectina y el control GAPDH carga son como se indica a la izquierda. El marcador de tamaño es como se indica a la derecha. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. La regulación por incremento de los marcadores mesenquimales, vimentina y Snail en células inducidas-EMT. Las células se tiñeron por inmunofluorescencia multicolor para detectar la expresión del marcador epitelial, E-cadherina (gris), y los marcadores mesenquimales, vimentina (verde) y Caracol (rojo) Las células de control cultivadas sin el suplemento de EMT medio inductor durante 5 días. - (C A). (D - F) Las células cultivadas con el suplemento de EMT medio inductor durante 5 días. iempre &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="La figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 5. La inducción de EMT en células que no responden de TGF-β1. (A y B) Las células cultivadas con medio solo durante 5 días. (C y D) Las células cultivadas en medio que contenía 10 ng / ml de TGF-β1 durante 5 días. (E y F) Las células cultivadas en el Suplemento EMT medio inductor durante 5 días. Todas las células se tiñeron para la expresión de E-cadherina (rojo) y counterstained con DAPI (azul). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="La figura 6"/> Figura 6. Células inducida EMT-han aumentado la capacidad de migración e invasión. A. Número promedio de células que migraron a través de un filtro de poro 8 micras después de la incubación durante 48 horas. B. Número promedio decélulas que fueron capaces de invadir a través de un filtro de poro 8 micras recubierto con extracto de membrana basal después de la incubación durante 48 horas. Las barras de error indican la desviación estándar de más de 3 pozos. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="La figura 7"/> La expresión de matriz basada en anticuerpos Figura 7. De la EMT de inducción. Los lisados ​​de A549 (A y C) y MCF7 (B y D) las células cultivadas con o sin suplemento EMT Inducir medios se utilizaron para el análisis conjunto con el Kit de array Proteoma Humano Profiler fosfo-MAPK. Spots destacan en A y B fueron entonces su cuantificación mediante densitometría. Las comparaciones de los inducidos por la ONU lisados ​​inducida EMT a se muestran en los correspondientes gráficos de barras a continuación (C y D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura &lt;</a>/ A&gt;.

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Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Un método directo se describe para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en una variedad de tipos de células. Se incluyen métodos para el análisis de células en estados EMT por inmunocitoquímica.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

35.6K vistas.  R&D Systems, Inc..  Un método directo se describe para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en una variedad de tipos de células. Se incluyen métodos para el análisis de células en estados EMT por inmunocitoquímica. 

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Luz / oscuridad de transición de prueba para ratones

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Investigación

Biología

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

La manipulación de la murino Glándula Lagrimal

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para microdisección de murino mucosa colónica

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.